Summary
Detta protokoll fungerar som en omfattande handledning för standardiserad och reproducerbar blandning av trögflytande material med en ny automatiseringsteknik med öppen källkod. Detaljerade instruktioner ges om driften av en nyutvecklad arbetsstation med öppen källkod, användningen av en protokolldesigner med öppen källkod och validering och verifiering för att identifiera reproducerbara blandningar.
Abstract
Nuvarande blandningssteg av trögflytande material förlitar sig på repetitiva och tidskrävande uppgifter som huvudsakligen utförs manuellt i ett lågt genomströmningsläge. Dessa problem representerar nackdelar i arbetsflöden som i slutändan kan leda till irreproduktivt av forskningsresultat. Manuella arbetsflöden begränsar ytterligare utvecklingen och den utbredda användningen av trögflytande material, till exempel hydrogeler som används för biomedicinska tillämpningar. Dessa utmaningar kan övervinnas genom att använda automatiserade arbetsflöden med standardiserade blandningsprocesser för att öka reproducerbarheten. I den här studien presenterar vi steg-för-steg-instruktioner för att använda en protokolldesigner med öppen källkod, för att driva en arbetsstation med öppen källkod och för att identifiera reproducerbara blandningar. Specifikt vägleder protokolldesignern med öppen källkod användaren genom det experimentella parametervalet och genererar en färdig protokollkod för att använda arbetsstationen. Denna arbetsstation är optimerad för pipettering av trögflytande material för att möjliggöra automatiserad och mycket tillförlitlig hantering genom integrering av temperaturdockor för termoresponsiva material, positiva deplacementpipetter för trögflytande material och en valfri spetskontaktdocka för att avlägsna överflödigt material från pipettspetsen. Validering och verifiering av blandningar utförs genom en snabb och billig absorbansmätning av Orange G. Detta protokoll presenterar resultat för att erhålla 80% (v/v) glycerol blandningar, en utspädning serie för gelatin metakryloyl (GelMA) och dubbla nätverk hydrogeler av 5% (w/v) GelMA och 2% (w/v) alginat. En felsökningsguide ingår för att stödja användare med protokollimplementering. Det beskrivna arbetsflödet kan i stor utsträckning tillämpas på ett antal trögflytande material för att generera användardefinierade koncentrationer på ett automatiserat sätt.
Introduction
Reproducerbarhet och reproducerbarhet är av största vikt i vetenskapligt arbete1,2,3,4. Nya rön har dock belyst betydande utmaningar när det gäller att upprepa biomedicinska studier med hög effekt inom grundläggande vetenskap samt translationell forskning4,5,6,7. Faktorer som bidrar till irreproduktible resultat är komplexa och många, såsom dålig eller partisk studiedesign6,8, otillräcklig statistisk kraft3,9, saknad överensstämmelse med rapporteringsstandarder7,10,11, tryck att publicera6 eller otillgängliga metoder eller programvarukod6,9 . Bland dem har subtila förändringar i protokollet och mänskliga fel i utförandet av experiment identifierats som ytterligare faktorer som står för irreproduktivitet4. Till exempel medför manuella pipetteringsuppgifter in- och interpersonlig imprecision12,13 och ökar sannolikheten för mänskliga fel14. Medan kommersiella vätskehanteringsrobotar kan övervinna dessa nackdelar och har visat ökad tillförlitlighet för vätskor15,16,17, är automatiserad hantering av material med betydande trögflytande egenskaper fortfarande utmanande.
Kommersiella vätskehanteringsrobotar använder ofta luftkuddepipetter, även kända som luftkolv eller luftförskjutningsrör. Reagenset och kolven separeras av en luftkudde som krymper under dispenseringsstegen och expanderar under inandningssteg. Med hjälp av luftkuddepipetter "flödar" trögflytade material endast långsamt in i och ut ur spetsen, och ett tidigt tillbakadragande av pipetten från behållaren kan leda till att luftbubblorna aspirerar. Under dispenseringsuppgifter lämnar det trögflytande materialet en film på den inre spetsväggen som "bara flyter" långsamt eller inte alls när det tvingas med luft. För att övervinna dessa problem introducerades positiva deplacementpipetter kommersiellt för att aktivt extrudera det trögflytade materialet ur spetsen med hjälp av en solid kolv. Även om dessa pipetter med positiv deplacement möjliggör korrekt och tillförlitlig hantering av trögflytande material, är automatiserade lösningar med pipetter med positiv deplacement fortfarande för dyra för akademiska laboratoriemiljöer, och därför förlitar sig de flesta arbetsflöden med trögflytande material enbart på manuella pipetteringsuppgifter18.
I allmänhet definieras viskositet som en vätskas motståndskraft mot flöde, och trögflytande material definieras vidare som material med större viskositet av vatten (0,89 mPa·s vid 25 °C). Inom biomedicinska tillämpningar innehåller experimentella inställningar ofta flera material med större viskositet än vatten, såsom dimetylsulfoxid (DMSO; 1,99 mPa·s vid 25 °C), glycerol (208,1 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa 20. Hydrogeler är hydrofila polymernätverk arrangerade i ett fysiskt eller/och kemiskt läge som används för olika tillämpningar, inklusive cellinkapsling, läkemedelsleverans och mjuka ställdon19,20,21,22. Hydrogelernas viskositet beror på polymerkoncentrationen och molekylvikten19. Rutinmässigt använda hydrogeler för biomedicinska tillämpningar uppvisar viskositetsvärden mellan 1 och 1000 mPa·s, medan specifika hydrogelsystem har rapporterats med värden på upp till 6 x 107 mPa·s19,23,24. Viskositetsmätningar av hydrogeler är dock inte standardiserade när det gäller mätprotokoll och provberedning, och därför är viskositetsvärden mellan olika studier svåra att jämföra.
Eftersom kommersiellt tillgängliga automatiserade lösningar som är speciellt utformade för hydrogeler antingen saknas eller är för dyra, är nuvarande arbetsflöden för hydrogel beroende av manuell hantering18. För att förstå begränsningarna i det nuvarande manuella arbetsflödet för pipettering av hydrogeler är det viktigt att förstå viktiga hanteringsuppgifter18. Till exempel, när ett nytt hydrogelmaterial har synthetiserats, genereras en önskad koncentration eller en utspädningsserie med varierande koncentrationer för att identifiera tillförlitliga syntesprotokoll och tvärbindningsegenskaper med efterföljande analys av de mekaniska egenskaperna25,26,27,28 . I allmänhet bereds eller köps en stamlösning och blandas därefter med ett spädningsmedel och/eller andra reagenser för att få en blandning. Blandningsuppgifterna utförs oftast inte direkt i en brunnsplatta (eller något utgångsformat), och utförs snarare i ett separat reaktionsrör, som vanligtvis kallas huvudblandning. Under dessa beredningsuppgifter krävs olika aspirations- och dispenseringssteg för att överföra det trögflytande materialet,blanda reagenserna och överföra blandningen till ett utgångsformat (t.ex. en 96-brunnsplatta). Dessa uppgifter kräver en hög mängd mänskligt arbete18, långa experimentella timmar och ökar sannolikheten för mänskliga fel som potentiellt kan manifesteras som felaktiga resultat. Dessutom förhindrar manuell hantering effektiv förberedelse av höga provnummer för att screena olika parameterkombinationer för detaljerad karakterisering. Den manuella bearbetningen hindrar också användningen av hydrogeler för screeningtillämpningar med hög genomströmning, såsom identifiering av lovande föreningar under läkemedelsutveckling. De nuvarande manuella förberedelsestegen är inte genomförbara för att screena läkemedelsbibliotek som består av tusentals droger. Av dessa skäl krävs automatiserade lösningar för att tillhandahålla en effektiv utvecklingsprocess och möjliggöra en framgångsrik översättning av hydrogeler för ansökningar om läkemedelsscreening.
För att gå från manuella arbetsflöden till automatiserade processer har vi optimerat en kommersiell rördil för öppen källkod för hantering av trögflytande material genom integrering av temperaturdockor för termoresponsiva material, användning av positiva deplacementrör med kapillärkolvspetsar och en valfri spetskontaktdocka för rengöring av pipettspetsar. Denna pipetteringsrobot har integrerats ytterligare som rörledningsmodul i en nyutvecklad arbetsstation med öppen källkod, som består av färdiga och anpassningsbara moduler18,29. Detaljerade monteringsanvisningar för den utvecklade arbetsstationen, inklusive maskin- och programvarufiler, är fritt tillgängliga från GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) och Zenodo-arkivet (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Förutom maskinvaruutvecklingen har ett program för design med öppen källkod programmerats och släppts för att vägleda användaren genom parametervalsprocessen och generera en färdig protokollkod (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Denna kod körs på den kommersiella rördyssroboten med öppen källkod samt på den utvecklade arbetsstationen med öppen källkod.
Häri tillhandahålls en omfattande handledning om driften av arbetsstationen med öppen källkod för att automatisera blandningsuppgifter för trögflytande material (figur 1). De handledningsspecifika protokollstegen kan utföras med den utvecklade arbetsstationen med öppen källkod samt den kommersiella rördränningsroboten med öppen källkod. Med stöd av en egenutvecklad öppen källkod protokoll design ansökan, automatiserad blandning och beredning av erforderliga koncentrationer för glycerol, gelatin metakryloyl (GelMA) och alginat visas. Glycerol har valts i denna handledning, eftersom det är väl karakteriserat30,31, Det är billigt och lättillgängligt, och därför används det ofta som trögflytande referensmaterial för automatiserade pipettering uppgifter. Som exempel på hydrogeler som används i biomedicinska tillämpningar har GelMA och alginathydrogelprekursorlösningar tillämpats för automatiserade blandningsexperiment. GelMA presenterar en av de vanligaste hydrogelerna för cellkapslingsstudier32,33, och alginat valdes i denna studie för att visa förmågan att tillverka dubbelnät hydrogeler34,35. Med Orange G som färgämne genomfördes ett snabbt och billigt förfarande för att validera och verifiera blandningsresultaten med en spektrofotometer16.
En kommersiell rördyssrobot med öppen källkod har integrerats som rörledningsmodul i den utvecklade arbetsstationen med öppen källkod (figur 2a), och därför används namnet "pipetteringsmodul" ytterligare för att beskriva pipetterroboten. En detaljerad beskrivning av den installerade maskinvaran ligger utanför protokollets tillämpningsområde och är tillgänglig via de medföljande databaserna som också innehåller steg-för-steg-instruktioner för den öppna källkodsplattformens generalförsamling. Pipettermodulen kan utrustas med två pipetter (en- eller 8-kanals pipett) som är installerade på axel A (höger) och axel B (vänster) (bild 2b). Pipetteringsmodulen erbjuder en 10-däckskapacitet enligt American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS) standarder, och följande platspositioner definieras på däcket: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (figur 2c). För att initiera fotoinducerad polymerisation av hydrogellösningar krävs en separat tvärlänkmodul och har lagts till på arbetsstationen. Tvärbindningsmodulen är utrustad med lysdioder med en våglängd på 400 nm och därför kan ämnen som exciterar vid en synlig ljusvåglängd användas med de nuvarande systemen, såsom litiumfenyl-2,4,6 trimethylbenzoylfosphinate (LAP)36,37. Intensiteten (i mW/cm2) av lysdioderna kan adresseras av användaren i protokolldesignprogrammet för att studera korslänkningsbeteendet38. Arbetsstationen innehåller även en lagringsmodul för att möjliggöra ökade genomströmningsstudier; Denna modul används dock inte inom denna studie och beskrivs därför inte ytterligare. I allmänhet rekommenderas att pipetteringsmodulen används i ett biologiskt säkerhetsskåp för att undvika provkontaminering. Huvudströmkretsen för att driva pipetteringsmodulen är en 12 V-krets, vilket anses vara en lågspänningsapplikation i de flesta länder. Alla elektriska komponenter är baserade i en särskild kontrollbox som hindrar användare från att komma i kontakt med källan till en elektrisk fara.
Genom att följa dessa standardiserade blandningsprotokoll kan forskare uppnå tillförlitliga blandningar för trögflytande såväl som icke-trögflytande material på ett automatiserat sätt. Metoden med öppen källkod gör det möjligt för användare att optimera blandningssekvenser och dela nyutvecklade protokoll med communityn. I slutändan kommer detta tillvägagångssätt att underlätta screeningen av flera parameterkombinationer för att undersöka det ömsesidiga beroendet mellan olika faktorer och därigenom påskynda tillförlitlig tillämpning och utveckling av trögflytande material för biomedicinska tillämpningar.
Protocol
PROTOKOLLET börjar med en introduktion till (1) programvaran och (2) maskinvaruinställningen för att bekanta användaren med nödvändiga installationer och arbetsstationen. Efter ett avsnitt om (3) materialberedning och (4) användningen av protokolldesignerapplikationen markeras (5) kalibreringen av pipetteringsmodulen och (6) utförandet av det automatiserade protokollet i detalj. Slutligen beskrivs (7) validerings- och verifieringsförfaranden, inklusive absorbansavläsning och dataanalys. Ett allmänt protokollarbetsflöde med enskilda uppgifter visas i bild 1.
1. Programvaruinställningar
OBS: Det här avsnittet innehåller en detaljerad instruktion för att installera API (Application Programming Interface) samt den nödvändiga protokolldesignapplikationen och kalibreringsterminalen. Följande instruktioner är skrivna för en Raspberry Pi (RPi) enkortsdator; men även Windows 8, 10 och macOS 10.13+ har framgångsrikt använts med API och applikationerna.
- Konfigurera datormiljön.
OBS: Var bekant med grunderna i Python39, hur du ställer in och använder en Raspberry Pi40,41 och hur du ansluter till internet42. Följande handledningssteg fokuserar på protokollspecifika steg och ytterligare information om användningen av en Raspberry Pi är tillgänglig online40.- Öppna ett terminalfönster från Aktivitetsfältet eller programmenyn.
- Uppdatera systemets paketlista:
sudo apt-get update - Uppgradera alla installerade paket:
sudo apt-get dist-upgrade - Starta om Raspberry Pi:
sudo omstart - Kontrollera installerad Python-version:
python3 --version
Kontrollera att minst Python 3.5 är installerat. om inte, installera den senaste versionen43. - Installera python pip, som publicerar Python-paket med Python-paketet Index44:
sudo apt-get install python3-pip - Installera beroenden:
pip installera numpy
pip install python-ändra storlek-image
OBS: Om du använder Windows måste du installera windows-curses-paketet via: python -m pip installera windows-curses
- Installera API (Application Programming Interface).
API: API: et tillhandahåller ett enkelt Python-ramverk som är utformat för att skriva experimentella protokollskript och använda arbetsstationen. Följande två API:er krävs för att köra den genererade protokollkoden.- Installera API för arbetsstation:
pip installera openworkstation - Installera Opentrons API för att använda pipetteringsmodulen:
pip installera opentrons==2.5.2 - Kontrollera om API:et har installerats:
python3
>>> importera openworkstation
>>> importera opentroner
STORLEKEN på API: et och protokoll design programmet är 2,2 MB respektive 1,2 MB. Inga problem uppgick under installationen när den användes med begränsat diskutrymme (200 MB). Kraven på diskutrymme beror dock på operativsystemet.
- Installera API för arbetsstation:
- Välj en katalog för filhämtning (kalibreringsterminal, protokolldesignprogram osv.).
Filer kan kopieras och klistras in någon annanstans efteråt. - Klona filer från GitHub-databasen:
git klon https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
KOMMANDOT "git clone" klonar och sparar sedan alla filer i katalogen, som är öppen i terminalen just nu. Eftersom databasen också innehåller maskinvarufilerna för sammansättningen krävs inte hela databasen för att köra de presenterade protokollen. Alla nödvändiga filer för att replikera experimenten är tillgängliga som kompletterande fil och i GitHub-lagringsplatsen under "/examples/publication-JoVE". - Öppna den nedladdade mappen. Om hela databasen har hämtats navigerar du till mappen "publication-JoVE" via
cd openworkstation/exempel/publikation-JoVE
OBS: Den här mappen innehåller filer som krävs för driften av arbetsstationen och användningen av protokolldesignerprogrammet och kalibreringsterminalen.
2. Maskinvaruinställningar
- Placera arbetsstationen i ett biologiskt säkerhetsskåp för att undvika provkontaminering.
- Installera pipetter på arbetsstationen.
- Välj pipettstorlek baserat på den experimentella installationen. I allmänhet, ta en pipettstorlek vilken volym som ska aspireras är i den högre änden av intervallet. Om blandning av uppgifter med volymer som är större än 1 ml krävs för en viss inställning (t.ex. inandning/dispensering på 2 ml), välj M1000E med en maximal asspirating/dispenseringsvolym på 1 000 μL för att minimera pipetteringssteg och spara tid.
OBS: En detaljerad instruktion för luftförskjutningspipetter finns online45. Den utvecklade pipetteringsmodulen kan integrera följande positiva deplacementpipetter: M10E (1–10 μL), M25E (3–25 μL), M50E (20–50 μL), M100E (10–100 μL), M250E (50–250 μL), M1000E (10–100 μL). - Använd en M4-intennyckel för att lossa och dra åt skruvarna.
- Fäst de två pipettfixeringsplattorna (vita akrylplattor) på aluminiumskenan och dra åt M5-skruvarna löst.
- Sätt in pipetten i de två pipettfixeringsplattorna och se till att rörettens ergonomiska svans vilar på motsatt sida av akrylmonteringsplattan.
- Dra åt de fyra skruvarna på de två pipettfixeringsplattorna ordentligt.
- Skjut in de två fyrkantiga fästmuttrarna, som är fästa på akrylmonteringsplattan, i z-axelns extruderingsspår och dra åt skruvarna.
OBS: Fäst pipetten ordentligt för att undvika rörelse under drift.
- Välj pipettstorlek baserat på den experimentella installationen. I allmänhet, ta en pipettstorlek vilken volym som ska aspireras är i den högre änden av intervallet. Om blandning av uppgifter med volymer som är större än 1 ml krävs för en viss inställning (t.ex. inandning/dispensering på 2 ml), välj M1000E med en maximal asspirating/dispenseringsvolym på 1 000 μL för att minimera pipetteringssteg och spara tid.
3. Materialberedning
OBS: De trögflytande materialen (glycerol, GelMA, alginat) används för de experiment som presenteras i denna studie, och därför är beredda volymer och hanteringsuppgifter (t.ex. lägg till 5 ml lagerlösning i 5 ml reaktionsrör) specifikt för denna experimentella inställning.
- Gelatin metakryloyl (GelMA)
OBS: GelMA funktionalisering, dialys och frysning är inte omfattningen av detta papper, och ett steg-för-steg protokoll finns i Loessner et al.33. Protokollet börjar använda lyofiliserad GelMA, som kan förberedas internt eller köpas kommersiellt.- Beräkna önskad massa av GelMA (mGelMA) baserat på önskad slutlig lagerkoncentration (cGelMA) och volym (VGelMA) med hjälp av ekvationen:
mGelMA = cGelMA x VGelMA
OBS: VGelMA beror på den experimentella installationen och det rekommenderas att förbereda 20−30% överflödigt material. De presenterade protokollen börjar med 5 ml 20% (w/v) GelMA som lagerlösning. - Väg den erforderliga mängden frystorkad GelMA, tillsätt den i ett 50 ml reaktionsrör och tillsätt önskad mängd fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Blanda GelMA antingen genom att blötlägga i lösningsmedlet vid 4 °C över natten eller genom uppvärmning till 60 °C i 6 timmar i ett vattenbad.
OBS: Sterila GelMA-lösningar kan förvaras skyddade mot ljus vid 4 °C i minst sex månader. - Fyll 5 ml GelMA i 5 ml reaktionsrör.
- Beräkna önskad massa av GelMA (mGelMA) baserat på önskad slutlig lagerkoncentration (cGelMA) och volym (VGelMA) med hjälp av ekvationen:
- Fotoinitiator: Litiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosphinat (LAP)
OBS: Undvik ytterligare exponering för rumsljus, eftersom LAP är ljuskänsligt.- Beräkna erforderlig massa av LAP (mLAP) baserat på önskad slutlig lagerkoncentration (cLAP) och önskad volym (VLAP) med hjälp av ekvationen:
mLAP = cLAP x VLAP
OBS: Det rekommenderas att förbereda en 3% (w/v) lagerlösning. - Väg den erforderliga mängden LAP, tillsätt den i ett 15 ml reaktionsrör och tillsätt PBS.
- Linda röret i aluminiumfolie för att förhindra fotoinducerad nedbrytning.
- Lös upp LAP genom att placera reaktionsröret i ett vattenbad vid 37 °C i 2 timmar eller tills det är helt upplöst.
- Fyll 1 ml LAP-lagerlösning i 5 ml-rör.
- Beräkna erforderlig massa av LAP (mLAP) baserat på önskad slutlig lagerkoncentration (cLAP) och önskad volym (VLAP) med hjälp av ekvationen:
- Alginat
- Beräkna erforderlig mängd alginat (malginat) baserat på önskad slutlig beståndskoncentration (calginat) och volym (Valginat) med hjälp av ekvationen:
malginat = calginate x Valginate
OBS: Valginate beror på den experimentella installationen och det rekommenderas att förbereda 20−30% överflödigt material. De presenterade protokollen börjar med 5 ml 4% (w/v) alginat som en lagerlösning. - Väg den erforderliga massan av alginat, tillsätt det i en 50 ml reaktionsrör och tillsätt PBS.
- Placera alginatblandningen i ett vattenbad vid 37 °C i 4 timmar.
OBS: Användningen av en virvelblandare kommer att påskynda upplösningsprocessen, men också generera luftbubblor. Upplöst alginat kan förvaras vid 4 °C i minst sex månader. - Fyll 5 ml alginat i 5 ml reaktionsrör.
- Beräkna erforderlig mängd alginat (malginat) baserat på önskad slutlig beståndskoncentration (calginat) och volym (Valginat) med hjälp av ekvationen:
- Fyll 5 ml glycerol i 5 ml reaktionsrör.
- Orange G-lösning
- Förbered en 10 mg/ml-stamlösning av Orange G i ett 50 ml reaktionsrör.
OBS: Volymen beror på antalet experiment. Beroende på spädningstyp, förbered stamlösningen antingen i ultrapurvatten, PBS eller ett lämpligt spädningsreagens. I de presenterade experimenten användes ultrapure vatten för utspädning av glycerol och PBS för utspädning gelma och alginat. PBS användes som spädningsspel för GelMA och alginat och kan antingen beredas med tabletter eller köpas utanför hyllan. - Blanda i 10 s genom att virvla.
- Linda röret i aluminiumfolie för att förhindra fotoinducerad nedbrytning.
OBS: Lagerlösning kan användas efter 24 timmar för att säkerställa korrekt upplösning av Orange G. - Späd lagerlösning till en arbetslösning på 1 mg/ml i ett 50 ml reaktionsrör.
- Överför arbetslösningen till lämpliga flaskor/rör för försöksinstallationen.
OBS: För de presenterade experimenten fylldes arbetslösningen i 5 ml rör. Orange G-buljong och arbetslösning kan förvaras vid 4 °C och användas inom tre månader efter beredningen. - Fyll 5 ml av arbetslösningen 1 mg/ml Orange G i 5 ml reaktionsrör.
- Förbered en 10 mg/ml-stamlösning av Orange G i ett 50 ml reaktionsrör.
4. Generera protokollkod med protokolldesignerprogrammet
OBS: De angivna parametrarna i steg 4.2−4.7 är desamma för alla utförda experiment, med undantag för materialets lagerkoncentration och den slutliga produktionskoncentrationen. Dessa parametrar sammanfattas i tabell 1 och i följande används parametrar för att förbereda dubbelnätshydrogeler med 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginat, 0,15% (w/v) LAP och PBS som en spädning.
- Öppna protokolldesignprogrammet genom att köra 'ProtocolDesignApp.html'.
OBS: Appen "ProtocolDesignApp.html" vägleder användaren genom parametervalsprocessen och genererar automatiskt det färdiga protokollet för att använda arbetsstationen. Användargränssnittet körs på alla vanliga webbläsare (dvs. Chrome, Firefox, Safari, Edge, Internet Explorer). - Ange protokollnamn (t.ex. dubbelnätverkshydrogeler) på installationssidan.
- Klicka på "Fortsätt" för att bekräfta protokollnamnet och gå vidare till nästa steg.
- Definiera inmatningsfacket genom att välja "3x4 Heating Block" på den nedrullningsbara menyn och följande inmatningsparametrar:
- Välj "Gel 1" på rullgardinsmenyn, ange namnet "GelMA", ange lagerkoncentration "20%", ställ in "Antal prover" till "3" för att fylla i en kolumn. Klicka på +lägg till" för att spara poster.
- Välj "Gel 2" på rullgardinsmenyn och ange namn: "Alginat", ange lagerkoncentration "4 %", ange "Antal prover" till "3" för att fylla i en kolumn. Klicka på +lägg till" för att spara poster.
- Välj "Photoinitiator" på rullgardinsmenyn, ange namn: "LAP", ange lagerkoncentration "3%", ange "Antal prover" till "3" för att fylla i en kolumn. Klicka på +lägg till" för att spara poster.
- Välj "Diluent 1" på den nedrullningsbara menyn och ange namn: "PBS", ange "Antal exempel" till "3" för att fylla i en kolumn. Klicka på +lägg till" för att spara poster.
Visualiseringen av inmatningsfältet uppdateras automatiskt när du klickar på +add. Om fler indata läggs till än fackets kapacitet visas varningen "För många exempel för det här facket" för användaren.
- Definiera tvärlänkningsparametrar genom att kontrollera "Photo crosslinking" och skriva tiden i sekunder, "30" och intensiteten W/m2 med "2".
- Slutför inmatningsinställningarna genom att klicka på "FORTSÄTT".
- Definiera utmatningsfackets inställningar genom att välja "96 brunnsplatta" i rullgardinsmenyn för välplatta.
- Klicka på "Grupp1" för att definiera utdata genom att skapa en grupp exempel.
- Ange utmatningssammansättning genom att ange önskade koncentrationer och provvolym i fälten för varje inmatning: GelMA = "5", Alginat = "2", LAP = "0,15", Total volym = "60".
- Markera kryssrutan om du vill använda avancerat blandningsprotokoll.
- Ange antalet prover genom att ange antalet prover i fältet "Antal prover": "96".
Visualiseringen av exempelfältet uppdateras automatiskt när du klickar på +lägg till-grupp. Om fler exempel läggs till än fackets kapacitet visas varningen "För många exempel för det här facket" för användaren. - Slutför utdatainställningen genom att klicka på "FORTSÄTT".
- Välj fackposition på däcklayouten och förbered plattformen i enlighet därmed:
- Markera fältet "SLOT A1" och välj "Empty_Cell" på den nedrullningsbara menyn.
- Markera fältet "SLOT A2" och välj "Trash_Cell" på den nedrullningsbara menyn.
- Markera fältet "SLOT B1" och välj "Tips_Cell_100 μL" på den nedrullningsbara menyn.
- Markera fältet "SLOT B2" och välj "Tips_Cell_1000 μL" på den nedrullningsbara menyn.
- Markera fältet "SLOT C1" och välj "Input_Cell" på den nedrullningsbara menyn.
- Markera fältet "SLOT C2" och välj "Empty_Cell" på den nedrullningsbara menyn.
- Markera fältet "SLOT D1" och välj "Mixing_Cell" på den nedrullningsbara menyn.
- Markera fältet "SLOT D2" och välj "Output_Cell" på den nedrullningsbara menyn.
- Definiera typ och egenskaper hos den första pipetten (M100E) genom att kontrollera "Pipette Left", välja "10–100μL positiv förskjutning" från rullgardinsmenyn och ställa in inandningshastighet = "600", dispenseringshastighet = "800".
- Definiera typ och egenskaper hos den andra pipetten (M1000E) genom att kontrollera "Pipetter right", välja "100–1000μL positiv deplacement" från rullgardinsmenyn och ange inandningshastighet = "800", dispenseringshastighet = "1200".
- Klicka på "GENERATE PROTOCOL" för att bekräfta installationen och generera protokollskriptet.
Obs: Den utvecklade protokolldesigner-appen genererar automatiskt en ny mapp när ett nytt protokoll genereras. Alla filer som krävs för det här experimentet och för att använda arbetsstationen sparas i den här mappen som är uppkallad efter protokollnamnet. Mappen kan kopieras till olika kataloger utan att orsaka problem. - Stäng inte gränssnittet eftersom det kommer att användas för att köra protokollet (se steg 6.6.).
5. Kalibrering av pipetteringsmodulen
OBS: Behållare (t.ex. brunnsplattor, spetsställ, sopor) och pipetter (t.ex. M1000E) måste kalibreras inledningsvis. Om en behållare och/eller ett pipettläge ändras/ändras måste den nya positionen kalibreras.
- Navigera till protokollmappen och öppna kalibreringsterminalen genom att köra filen "calibrate.py" i en terminal windox (se steg 1.1.1):
phython.calibrate.py
OBS: Gränssnittet "calibrate.py" vägleder användaren genom kalibrering av däcksinställningen och pipetterna. Kontrollera att filen finns i samma mapp som protokollfilen och modulfilerna. Den genereras automatiskt i steg 4.10. - Välj rörelsesteg för kolvx,y,z-rörelse med det numeriska tangentbordet (1−8): "1" för 0,1 mm, "2" för 0,5 mm, "3" för 1 mm, "4" för 5 mm, "5" för 10, "6" för 20 mm, "7" för 40 mm och "8" för 80 mm.
- Kalibrera pipetten.
- Tryck på kortkommando P för att välja pipettstorlek.
- Tryck på kortkommando V för att gå in i kolvkalibreringsläget.
OBS: Det rekommenderas att börja med små steg (2, 5 och 10 mm) för att bekanta dig med pipetterhuvudets ökningsstorlek och rörelseverkan. - Kalibrera följande kolvlägen för en positiv deplacementpipett: T–Top = viloposition; B–Botten = kolven skjuts tills motståndet är uppfyllt; P–Pick-up = kolven skjuts till ett läge där en kolvspets kan fästas; Mata ut = kolven skjuts tills en fäst spets matas ut. Variera kolvpositionerna med hjälp av uppåt- och nedåtpilarna på tangentbordet och spara den slutliga positionen med S på tangentbordet.
- Lämna kalibreringsläget pipetten genom att trycka på kortkommandoT V.
- Kalibrera behållarens position i förhållande till pipettspetsen.
- Tryck på kortkommando P för att välja pipetttyp. Se till att ett tips är anslutet till den valda pipetted.
- Tryck på kortkommando C för att välja behållartyp.
- Välj en lämplig rörelsestegra och flytta pipettspetsen till följande lägen. För brunnsplattor, kalibrera till "A1" brunnsläget längst ner; För spetsställ, kalibrera till "A1"-läget; För papperskorgen väljer du en position (definierad som en punkt) där spetsen kan matas ut i papperskorgen.
- Tryck på kortkommando S för att spara position.
- Upprepa steg 5.3.1−5.3.3 för alla behållare som anges under "C" för den valda pipetttypen.
- Upprepa 5.3.1−5.3.5 för den andra pipetttypen.
- Stäng kalibreringsskriptet.
6. Protokollkörning med arbetsstationen
OBS: Protokollfiler är tillgängliga via databasen och finns även som kompletterande fil.
- Placera papperskorgen, spetsställ, inmatningsfack, blandningsfack och utgång på däcket (definieras i steg 4.3).
- Kalibrera pipetter och instrument enligt definitionen i avsnitt 5.
- Om det behövs, slå på temperaturdockan och välj temperaturen för in- och blandningsfacket.
OBS: Experimenten i denna handledning utfördes utan temperaturkontroll och vid 40 °C för glycerol och 37 °C för GelMA och alginat pipettering. - Placera rör med inmatningsreagenser i aluminiumblocken på temperaturdockorna enligt den valda inställningen.
- Vänta tills inmatningsreagenserna har nått önskad temperatur.
OBS: För att säkerställa korrekt temperaturfördelning rekommenderas en inkubationstid på 30 min för GelMA och alginat. - Kör protokollfilen genom att klicka på 'KÖR PYTHON SCRIPT'
Det valda protokollet körs nu av arbetsstationen. Den medföljande videon belyser automatiserad blandning av GelMA och distributionen av 60 μL till en 96 brunnsplatta. - Körningen är klar när 'Slutförd' visas.
7. Validerings- och verifieringsprocess
- Ta bort brunnsplattan från arbetsstationen och transportera brunnsplattan med proverna till en spektrofotometer.
- Läs absorbans med en spektrofotometer vid 450 nm. Läs varje platta 2x för att jämföra resultat och säkerställa konsekventa resultat.
- Exportera och spara absorbansavläsningar.
- Dataanalys.
OBS: Experimentella data kan bearbetas individuellt eller kopieras och klistras in i den angivna mallen för att utvärdera medelvärdet, standardavvikelsen och varianskoefficienten (CV) med hjälp av kalkylbladsprogram.- Öppna tilläggsfilen "supplementary_template-analys.xlsx", som också kan vailable inom GitHub-lagringsplatsen under 'openworkstation/examples/publication-JoVE.
- Kopiera absorbansavläsningar i bladet "rådata", se till att alla cellreferenser är korrekt definierade i alla tabeller och klicka på analysbladet för information om medelvärdet, standardavvikelsen och varianskoefficienten (CV).
OBS: Beroende på provfördelningen på en brunnsplatta finns följande förinställda utvärderingstyper tillgängliga med mallen: typen "Enhetlig" används när alla prover har samma sammansättning, typen "Efter rader" används när prover i olika rader har olika kompositioner, typen "Efter kolumner" används när prover i olika kolumner har olika kompositioner, och typen "Anpassad" används när exempelpositionerna är användarspecifika.
Representative Results
Denna handledning presenterar resultat för experiment med glycerol (figur 3) och GelMA med LAP och alginat (figur 4).
Genereringen av en 80% (v/v) glycerollösning undersöktes antingen utan temperaturkontroll (rumstemperatur, 22 °C) och utan spetstouch (definierad som inställning 1), med temperaturkontroll (40 °C) och utan spetstouch (inställning 2), eller med temperaturkontroll (40 °C) och med spetstouch (inställning 3) (bild 3a-i). Dessa två temperaturinställningar valdes för att utvärdera hanteringsskillnaden, eftersom glycerolens viskositet minskar nästan med en faktor 3 när den värms upp från 22 °C (139,5 mPa·s) till 40 °C (46,6 mPa·s)30. En 85% (v/v) lagerlösning av glycerol späddes ut till en slutlig koncentration på 80% och jämnt fördelades i en 96 brunnsplatta (n = 96 per inställning). Försökstiden, som inkluderar dispensering av varje material i blandningsröret, respektive blandningsuppgifter och provfördelningen till en 96-brunnsplatta, var 30 min 42 s. För att identifiera skillnader mellan utspädningsblandningar framställdes ultrapure vatten- som spädningsvätska för glycerol – med 1 mg/ml Orange G. Absorbansavläsningarna belyser att integreringen av temperaturkontrollen och spets beröringen avsevärt påverkar blandningarna (s < 0,0001). Utöver den utförda tvåvägsanalysen av variansen (ANOVA) beräknades CV-värdena för att utvärdera den relativa standardavvikelsen. Variationskoefficienten beskriver en standardiserad indikator för att identifiera graden av avvikelse i förhållande till medelvärdet och uttrycks i procent. Om provmedlen inte är särskilt intressanta, utan variabiliteten inom mätningarna, ger variationskoefficienten ytterligare insikter för att identifiera reproducerbara blandningar46. I det här experimentet med tre olika inställningar visade absorbansvärdena minskande CV-värden från 5,6%, 4,2%, till 2,0% för inställning 1, inställning 2 och inställning 3, vilket visar den betydande påverkan av temperaturdockan och tipstouchfunktionen på att producera tillförlitliga resultat (figur 3a-ii). Plottning av provabsorberingsvärden för inställning 3 (provnummer #1 till #96 i en 96-brunnsplatta) ger inga ökande eller minskande värden under hela försöket och indikerar därför ingen inverkan av provpositionen på absorbansvärdena (figur 3a-iii). Visualisering av data för varje uppmätt brunnsplatta med värmekartor ger ytterligare insikter för att identifiera heterogeniteter för en viss rad eller kolumn, eller varierande absorbansvärden under hela dispenseringsuppgifterna. De visualiserade värmekartorna för de tre installationerna visar minskade heterogeniteter över hela brunnsplattorna från inställning 1 till inställning 3 (bild 3b). Slutligen utvärderades reproducerbiliteten av den genomförda blandningen inom åtta oberoende körningar (figur 3c-i,ii), där varje körning tog 6 min 57 s. Enskilda blandningskörningar visade låga CV-värden mellan 1,1% och 2,6%, vilket indikerar mycket tillförlitliga blandnings- och dispenseringsuppgifter för de enskilda körningarna. Absorbansvärden för alla åtta körningar gav ett CV-värde på 3,3% och visade reproducerbarheten hos det etablerade blandningsprotokollet.
GelMA utspädningsserier framställdes genom utspädning av en 20% (w/v) stamlösning med PBS till 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 och 0% (w/v) och lägga till LAP till en konstant koncentration av 0,15% (w/v) (figur 4a-i), som tog totalt 55 min 12 s. Som anges i det experimentella protokollskriptet var hydrogelen korslänkning för 30 s med en intensitet på 2,0 mW/cm2 vid 400 nm. För att utvärdera skillnaderna mellan blandningarna framställdes PBS- eftersom spädningsmedlet för GelMA och alginat – med 1 mg/ml Orange G. Därför identifieras absorbansskillnaden mellan proverna inom en blandning och mellan de seriella utspädningarna med en spektrofotometer. Uppmätta absorbansvärden för varje koncentrationssteg är signifikant olika (p < 0,0001) och har mycket låga CV-värden mellan 1,2% och 3,4% under koncentrationsstegen (n = 12 per koncentrationssteg). Linjär regression visade hög passform med ett R²-värde på 0,9869 (figur 4a-ii) och en värmekarta bekräftade den homogena fördelningen för varje koncentration och skillnaden mellan koncentrationerna (figur 4a-iii). Automatiserad blandning av fyra reagenser utfördes för generering av 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginat, 0,15% (w/v) LAP och PBS som spädningslösning utan (inställning 2) och med (inställning 3) beröringsspets (n = 96 för varje inställning) med samma korslänkningsparametrar (30 s, 2,0 mW/cm2). Dispensering av de fyra materialen, blandning och distribution till en 96 brunnsplatta tog 32 min 22 s. Alla experiment med GelMA och alginat utfördes vid 37 °C för att förhindra termisk gelering som förhindrar pipettering av GelMA. Med alternativet tip touch sänktes CV-värdet från 5,2% till 3,4% och särskilt avvikande värden i den nedre regionen förhindrades genom att ta bort överflödigt material från spetsen (figur 4b-i). Även om medelvärdet 1,927 och 1,944 för inställning 2 och inställning 3 är mycket nära, belyser variationskoefficienten den minskande avvikelsen i förhållande till medelvärdet. Enstaka rader på 96-brunnsplattan kan jämföras med varandra med hjälp av en värmemappsvisualisering för att upptäcka rad- och/eller kolumnskillnader (bild 4b-ii).
Bild 1: Protokollarbetsflöde med enskilda uppgifter. Det beskrivna arbetsflödet är indelat i sju aktiviteter som är uppdelade i inställningar, förberedelse, körning och analys. I början måste programvaran (uppgift 1) samt maskinvaran (uppgift 2) ställas in. Efter beredningen av materialen (uppgift 3) och genereringen av protokollskriptet (uppgift 4) kalibreras pipettermodulen genom att definiera pipetten och behållarens positioner (uppgift 5). Därefter körs protokollskriptet på arbetsstationen (uppgift 6) och validering och verifiering (uppgift 7) av blandningar utförs för att utvärdera blandningar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Arbetsstation med öppen källkod och däckinställning för pipetteringsmodulen. a) Den utvecklade arbetsstationen är inspirerad av en monteringslinjemetod, där prover transporteras genom olika moduler, och består av följande moduler: pipettering, tvärlänk, lagring, transport och beräkningsmodul. b) Pipettermodulens däck är inställt beroende på försökslayouten (t.ex. brunnsplåtstyp, rörvolym osv.). Den visade däckinställningen användes för de presenterade experimenten och består av positiva deplacementpipetter med ett intervall från 10−100 μL (M100E) och 100−1000 μL (M1000E), spetsställen med kapillärkolvar (CP) för 100 μL (CP1000) och 1 000 μL (CP1000), en soptunna. c) De tillgängliga däckspositionerna definieras med de visade siffrorna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Resultat för automatiserad pipettering av glycerolblandningar. a) Den flexibla arbetsstationsdesignen gör det möjligt att utvärdera tre olika inställningar (i) för att identifiera optimala parametrar för reproducerbara resultat. ii) Tillsats av en spetstouch och uppvärmning av materialet resulterade i en minskad varianskoefficient (CV) och mycket reproducerbara blandningar för inställning 3. Varje experiment utfördes med 96 prover. iii) Plottning av enskilda provvärden visade ingen inverkan på pipetteringssekvensen. b) Experimentella resultat av varje inställning visualiserades med värmekartor för att identifiera påverkan på råa/kolumn skillnader, kanter eller huvudblandning. c) Reproducerbarheten för inställning 3 analyserades inom åtta oberoende körningar med hjälp av (i) median, standardavvikelse, CV-värde och (ii) värmekartor. Data i panelerna a-ii (n = 96) och b-i (n = 12) presenteras med medel och enskilda datapunkter. Statistisk signifikans definierades som ****p < 0,0001 med hjälp av tvåvägsanalys av varians (ANOVA). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Resultat för blandning av uppgifter med hydrogeler. a) Från en gelatinmetacryloyl (GelMA) 20% (w/v) stamlösning genererades en seriell utspädning på 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 och 0% (w/v) inom en experimentell körning med en 96 brunnsplatta (n = 12 per koncentration). i) Varianskoefficienten (CV) varierade mellan 1,2 % och 3,4 % under de beredda koncentrationerna, och ii) linjär regression visade en hög passform med ett R²-värde på 0,9869. iii) Homogena utspädningar bekräftades visuellt med den genererade värmekartan. b) Dubbelnät hydrogeler genererades med 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginat och 0,15% (w/v) LAP (i) med och utan spetstouch (n = 96 för varje inställning) och korsade i 30 s med en intensitet av 2,0 mW/cm2 vid 400 nm. Integreringen av tip touch resulterade i minskade CV-värden från 5,2% till 3,4%. ii,iii) Värmekartor bekräftar färre avvikelser vid användning av spetstouch för att avlägsna överflödigt material från spetsen. Data i panelerna a-i och b-i presenteras med medel och enskilda datapunkter. Statistisk signifikans definierades som *p < 0,05, ***p < 0,001 och ****p < 0,0001 med hjälp av envägsanalys av varians (ANOVA). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Sammanfattning av pipetttypsskillnaden och problem med trögflytade biomaterial. a) Reagenset och kolven separeras av en luftkudde som krymper under dispenseringsstegen och expanderar under inandningssteg. Vid inandning och dispensering av trögflytande material introducerar det långsamma "flödet" problem som luftbubblor och oregelbundet pipetteringsbeteende. b) Röretter med positiv deplacement möjliggör tillförlitlig inandning och dispensering av viskös material genom användning av en kolv inuti spetsen. c) Pipettering av mycket trögflytande material (t.ex. 4 % (w/v) alginat) kan leda till ackumulering av överflödigt material på spetsen, vilket leder till felaktigheter under försöken. d) Genomförandet av en enkel spetspekbricka gör det möjligt att avlägsna överflödigt material på spetsen och resulterar i exakta aspirerings- och dispenseringsvolymer. Detta realiseras genom att använda insidan av brunnsplattans lock som placeras på en spetsställbehållare. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Material #1 (lagerkoncentration) | Slutlig koncentration av material #1 | Material #2 (lagerkoncentration) | Slutlig koncentration av material #2 | Material #3 (lagerkoncentration) | Slutlig koncentration av material #3 | Spädd (Orange G arbetslösning) | Slutlig Orange G-koncentration i blandning | Visas i figur |
| Glycerol (85% (v)) | 80% (v/v) | vatten (1 mg/ml Orange G) | 0,059 mg/mL | Bild 3a−c | ||||
| GelMA (20% (w/v)) | 0% (v/v) | LAP (3% (w/v)) | 0.15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 1 mg/ml | Bild 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 2% (w/v) | LAP (3% (w/v)) | 0.15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,85 mg/ml | Bild 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 4% (v/v) | LAP (3% (w/v)) | 0.15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,75 mg/ml | Bild 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 6% (v/v) | LAP (3% (w/v)) | 0.15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,65 mg/ml | Bild 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 8% (v/v) | LAP (3% (w/v)) | 0.15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,55 mg/ml | Bild 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 10% (v/v) | LAP (3% (w/v)) | 0.15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,45 mg/ml | Bild 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 12% (v/v) | LAP (3% (w/v)) | 0.15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,35 mg/ml | Bild 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 14% (v/v) | LAP (3% (w/v)) | 0.15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,25 mg/ml | Bild 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 5% (v/v) | Alginat (4% (w/v)) | 2% (w/v) | LAP (3% (w/v)) | 0.15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,2 mg/ml | Bild 4b |
Tabell 1: Parameteröversikt för de genomförda experimenten.
| Protokollsteg | Problem | Möjlig orsak | Lösning |
| 1.1 | Programvara kan inte installeras eller uppdateras | Slut på diskutrymme på SD-kort | Kontrollera diskutrymmet på SD-kortet. Om det behövs tar du bort onödiga artiklar, tömde lagerplats eller använder ett SD-kort av lämplig storlek |
| 1.2 | API kan inte installeras | Användarnas installationsförmåga är begränsad (ingen root-användarbehörighet) | Använd kommandot sudo framför angivna kommandon för att få administratörsrättigheter. I Linux kallas denna typ av åtkomst som superanvändaren. |
| 3.1 | Problem med GelMA | Funktionalisering, dialys eller frysning | Detaljerad steg-för-steg-protokoll inklusive felsökningslista finns i Loessner et al.33. |
| 5.1 och 6.2 | Arbetsstationen reagerar inte på kommandon | Anslutningsproblem | Vänd på allt och stäng av datorn. Stäng av strömförsörjningen i 10 s. Strömdator och arbetsstation på igen. |
| 5.1 och 6.2 | Arbetsstationen reagerar inte på kommandon | Anslutningsproblem | Kontrollera om datorn känner igen USB-anslutningen och USB-porten är korrekt definierad. Kontrollera att brandväggen inte hindrar anslutningsprocessen (se länken nedan tabell 2). |
| 5.1 och 6.2 | Det går inte att öppna filen | Fel katalog | Kontrollera regissören (mappsökvägen) för att se till att rätt sökväg används. Om det inte går att hitta en fil (t.ex. interface.py) är det troligt att fel sökväg används. |
| 6.6.2 | Spetsen är inte korrekt fastsatt eller faller under rörelse | Kalibreringsproblem | Upprepa kalibreringsstegen för pipetten och se till att kapillärkolven är korrekt ansluten till pipetten. |
| 6.6.2 | Spetsen är inte korrekt fastsatt eller faller under rörelse | Problem med bifogad fil | Pipetten är inte korrekt ansluten till pipettens axel och rör sig under rörelsestegen. Dra åt skruvarna ordentligt för att förhindra detta. |
| 6.6.2 | Tips är att aspirera över material | Kalibreringsproblem | Upprepa kalibreringen av denna facktyp för att definiera höjden korrekt. |
| 6.6.2 | Tips är att aspirera över material | Kalibreringsproblem | Kontrollera volymen i röret och kontrollera att volymen är lika med den volym som definieras i protokolldesignerprogrammet. |
| 6.6.2 | Materialet doppar under rörelse | För mycket överflödigt material på spetsen | Lägg till alternativet pekdocka för tips; Alternativt kan även tiden för spetstouch ökas. |
| 6.6.2 | Materialet är fast eller för trögflytande för pipettering | Termoresponsivt beteende hos material | Kontrollera termoresponsiv materialkarakterisering och justera temperaturens värme-/kyltemperatur i enlighet därmed. |
| https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting | |||
Tabell 2: Felsökningstabell med identifierade problem, möjliga orsaker samt lösningar för att lösa problemen.
Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Pipettering av trögflytande material, särskilt hydrogeler för biomedicinska tillämpningar19,20,21,33,47, är rutinuppgifter i många forskningslaboratorier för att förbereda en användardefinierad koncentration eller en utspädningsserie med varierande koncentrationer. Även om det är repetitivt och körningen är ganska enkel, utförs den mestadels manuellt med lågt provgenomströmning18. Denna handledning introducerar driften av en öppen källkod arbetsstation, som har utformats speciellt för trögflytande material, för att möjliggöra automatiserad blandning av trögflytande material för reproducerbar generering av önskade koncentrationer. Denna arbetsstation är optimerad för pipettering av hydrogeler för att möjliggöra automatiserad och mycket tillförlitlig hantering genom integrering av temperaturdockor för termoresponsiva material, positiva deplacementpipetter för trögflytande material och en valfri spetskontaktdocka för att avlägsna överflödigt material från spetsen. Pipetteringsmodulen har optimerats specifikt för att möjliggöra bearbetning av trögflytande material på ett standardiserat och automatiserat sätt. I jämförelse med luftkuddepipetter (figur 5a) doserar röretter med positiv deplacement (figur 5b) viskösa material utan att lämna kvar restmaterial kvar i spetsen, vilket resulterar i exakta aspirerings- och dispenseringsvolymer. Den valfria spetsbortdockan tar bort överflödigt provmaterial från spetsen (figur 5c,d), vilket är användbart för klibbiga material (t.ex. 4% (w/v) alginat).
Protokolldesignerns ansökan har programmerats speciellt för hydrogeler och möjliggör utspädning av upp till fyra reagenser med olika koncentrationer och upp till två spädningsvätska. Risken för fel vid beräkningen av slutliga utspädningar förhindras i denna applikation, eftersom användarna endast väljer önskad koncentration eller de seriella utspädningsstegen. Nödvändiga asspiraterings- och dispenseringsvolymer beräknas automatiskt, sparas i en separat dokumentationstextfil och fylls sedan i protokollskriptet. Denna protokolldesignapplikation ger användaren full kontroll över alla experimentella parametrar (t.ex. pipetteringshastighet) och säkerställer intern dokumentation av de viktiga parametrarna. Protokolldesignappen tar hänsyn till behållarens fyllningsnivå (t.ex. brunn) och varierar inandnings-/dispenseringshöjden för att förhindra onödig doppning i de trögflytande materialen. Denna integrerade funktion undviker materialackumulering på spetsens yttervägg och säkerställer därmed tillförlitliga aspirerings- och dispenseringsuppgifter i hela protokollet. Även om protokolldesignerapplikationen har utvecklats för hydrogelutspädning steg, kan den också användas för utspädning av nonviscous vätskor, såsom Orange G färgämnen. Protokolldesignerapplikationen, som är tillgänglig via databasen under "/examples/publication-JoVE", är den version som förklaras i protokollavsnittet och markeras i videon. Den här versionen kommer inte att uppdateras. En uppdaterad version av protokolldesignprogrammet är dock tillgänglig via huvudarkivsidan. Kalibreringsterminalen utvecklades ursprungligen av Sanderson48 och har optimerats för kalibrering av röretter med positiv deplacement.
Som beskrivs i protokollavsnitt 4 skall pipetter och behållare kalibreras inledningsvis. Denna kalibreringsprocess är avgörande för att definiera och spara de positioner som sedan används för att beräkna rörelsestegen. Därför förlitar sig framgångsrik protokollkörning på väldefinierade kalibreringspositioner, eftersom felaktiga kalibreringspunkter kan leda till att spetsen kraschar i en behållare. Eftersom pipetternas kolvlägen måste kalibreras manuellt beror pipetternoggrannheten och precisionen i hög grad på den utförda kalibreringen. Dessa kalibreringsprocedurer beror i hög grad på användarupplevelsen med pipetteringsmodulen, och därför rekommenderas utbildning med erfaren personal i början för att säkerställa korrekta kalibreringsförfaranden. Förutom den manuella kalibreringen på pipetteringsmodulen måste själva pipetten kalibreras för att säkerställa korrekt pipettering. Det rekommenderas att pipetten kalibreras minst var tolfte månad för att uppfylla acceptanskriterierna enligt ISO 8655. För att utvärdera pipettkalibreringen internt finns validering och verifiering tillgänglig enligt Stangegaard et al.16.
För att skapa en tillförlitlig datauppsättning är det viktigt att börja med reagenser av hög kvalitet. Detta är särskilt viktigt för hydrogelbearbetningsuppgifter, eftersom batch-till-batch-variationer kan påverka de genererade resultaten i det här protokollet. Förutom variationer från parti till parti kan subtila förändringar i beredningen av små volymer också bidra till skillnader i egenskaper. För att förhindra detta rekommenderas förberedelse av större volymer, som kan användas för hela experimenten.
Validerings- och verifieringsförfarandena bygger på användningen av ett färgämne för att identifiera tillförlitliga blandningar. Det presenterade protokollet beskriver tillämpningen av Orange G, men det allmänna protokollet och analysarbetsflödet kan också anpassas till fluorescerande färgämnen49,50. Användningen av Orange G minskar de tekniska kraven för spektrofotometern och eliminerar försiktighetsåtgärder som vidtas för att förhindra blekning av fluorescerande färgämnen efter exponering för ljus. Problem i upplösande beteende eller klusterbildning av färgämnet har inte observerats med de presenterade materialen under experiment men kan förekomma med andra material. Potentiell klusterbildning och därmed interaktionen mellan färgämne och material kan lätt detekteras med ett mikroskop.
Procedurerna och teknikerna som presenteras i den här självstudien lägger till automatiseringskapacitet till nuvarande arbetsflöden för trögflytande material för att uppnå mycket tillförlitliga uppgifter med minimalt mänskligt arbete. Den angivna felsökningstabellen (tabell 2) innehåller identifierade problem och presenterar möjliga orsaker samt lösningar för att lösa problemen. Den presenterade arbetsstationen har framgångsrikt tillämpats på naturliga (gelatin, gellan tuggummi, matrigel) och syntetiska (t.ex. poly (etylenglykol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) polymera material för automatiserade pipettering uppgifter. I synnerhet kommer kombinationen av en arbetsstation med öppen källkod och en öppen källkodsprotokolldesignapplikation utformad för trögflytande material att vara mycket användbar för forskare som arbetar inom biomedicinsk teknik, materialvetenskap och mikrobiologi.
Disclosures
CM och DWH är grundare och aktieägare i Gelomics Pty Ltd. CM är också direktör för Gelomics Pty Ltd. Författarna förklarar ingen intressekonflikt som är relevant för ämnet för denna artikel. Författarna har inga andra relevanta anknytningar eller ekonomiskt engagemang med någon organisation eller enhet med ett ekonomiskt intresse i eller ekonomisk konflikt med ämnet eller materialet som diskuteras i artikeln förutom de som avslöjas.
Acknowledgments
Författarna erkänner medlemmarna i Centre in Regenerative Medicine vid QUT, i synnerhet Antonia Horst och Pawel Mieszczanek för deras användbara förslag och feedback. Detta arbete stöddes av QUT: s Postgraduate Research Award för SE och av Australian Research Council (ARC) enligt bidragsavtal IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB stöddes av ett nationellt hälso- och sjukvårdsforskningsråd (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-959-53A | |
| 5 mL tubes | Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) | SCT-5ML | size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name |
| 50 mL reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-432-22 | |
| 70% w/w Ethanol | LabChem, Inc. (USA) | aja726-5Lpl | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055 | |
| Alginate | NovaMatrix | 4200001 | https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/ |
| Demineralized or ultrapure (MilliQ) water | |||
| Gelatin methacryloyl (GelMA) | Synthetized in-house | detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich, Inc. (USA) | 900889 | |
| M4 and M5 Allen key | OpenBuilds, inc. (USA) | 179, 190 | also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/ |
| OrangeG | Fisher Scientific (USA) | O267-25 | https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14190-144 | alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific) |
| Equipment | |||
| Aluminium blocks for temperature dock | Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) | SB16 | blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html |
| Analytical balance | Sartorius AG (Germany) | ED224S | |
| Open source liquid handling robot: commercial product | Opentrons Laboratories, Inc. (USA) | OT-One S Pro | https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro |
| Open source liquid handling robot: open source hardware | Assembled in-house following an open source approach | hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24 | |
| Positive displacement pipette: MicromanE | Gilson, Inc. (USA) | FD10006 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html |
| Spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH (Germany) | CLARIOstar | |
| Tips: capillary pistons | Gilson, Inc. (USA) | F148180 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191 |
References
- Jarvis, M. F., Williams, M. Irreproducibility in Preclinical Biomedical Research: Perceptions, Uncertainties, and Knowledge Gaps. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (4), 290-302 (2016).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The economics of reproducibility in preclinical research. PLoS Biology. 13 (6), 1-9 (2015).
- Niepel, M., et al. A Multi-center Study on the Reproducibility of Drug-Response Assays in Mammalian Cell Lines. Cell Systems. 9 (1), 35-48 (2019).
- Prinz, F., Schlange, T., Asadullah, K. Believe it or not: how much can we rely on published data on potential drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (9), 712 (2011).
- Baker, M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature. 533 (7604), 452-454 (2016).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
- Sena, E. S., van der Worp, H. B., Bath, P. M. W., Howells, D. W., Macleod, M. R. Publication Bias in Reports of Animal Stroke Studies Leads to Major Overstatement of Efficacy. PLoS Biology. 8 (3), 1000344 (2010).
- Ioannidis, J. P. A., Kim, B. Y. S., Trounson, A. How to design preclinical studies in nanomedicine and cell therapy to maximize the prospects of clinical translation. Nature Biomedical Engineering. 2 (11), 797-809 (2018).
- Enserink, M. Sloppy reporting on animal studies proves hard to change. Science. 357 (6358), 1337-1338 (2017).
- Freedman, L. P., Inglese, J. The Increasing Urgency for Standards in Basic Biologic Research. Cancer Research. 74 (15), 4024-4029 (2014).
- Lippi, G., Lima-Oliveira, G., Brocco, G., Bassi, A., Salvagno, G. L. Estimating the intra- and inter-individual imprecision of manual pipetting. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 55 (7), 962-966 (2017).
- Hentz, N. G., Knaide, T. R. Effect of Liquid-Handling Accuracy on Assay Performance. Journal of Laboratory Automation. 19 (2), 153-162 (2014).
- Reason, J. Understanding adverse events: human factors. Quality and Safety in Health Care. 4 (2), 80-89 (1995).
- Schober, L., et al. Cell Dispensing in Low-Volume Range with the Immediate Drop-on-Demand Technology (I-DOT). Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 154-163 (2015).
- Stangegaard, M., Hansen, A. J., Frøslev, T. G., Morling, N. A Simple Method for Validation and Verification of Pipettes Mounted on Automated Liquid Handlers. Journal of Laboratory Automation. 16 (5), 381-386 (2011).
- Crombie, D. E., et al. Development of a Modular Automated System for Maintenance and Differentiation of Adherent Human Pluripotent Stem Cells. SLAS Discovery. 22 (8), 1016-1025 (2017).
- Eggert, S., Hutmacher, D. W. In vitro disease models 4.0 via automation and high-throughput processing. Biofabrication. 11 (4), 043002 (2019).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Advanced Materials. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Zhang, Y. S., Khademhosseini, A.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Gao, G., Huang, Y., Schilling, A. F., Hubbell, K., Cui, X. Organ Bioprinting: Are We There Yet. Advanced Healthcare Materials. 7 (1), 1701018 (2018).
- Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
- Lim, K. S., et al. New Visible-Light Photoinitiating System for Improved Print Fidelity in Gelatin-Based Bioinks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1752-1762 (2016).
- Müller, M., et al. Development and thorough characterization of the processing steps of an ink for 3D printing for bone tissue engineering. Materials Science and Engineering C. 108, 110510 (2020).
- Sewald, L., et al. Beyond the Modification Degree: Impact of Raw Material on Physicochemical Properties of Gelatin Type A and Type B Methacryloyls. Macromolecular Bioscience. 18 (12), 1-10 (2018).
- Eggert, S., Mieszczanek, P., Meinert, C., Hutmacher, D. W. A modular open source technology for automated in vitro workflows. Zenodo. , (2020).
- Volk, A., Kähler, C. J. Density model for aqueous glycerol solutions. Experiments in Fluids. 59 (5), 75 (2018).
- Zhang, H., Grinstaff, M. W. Recent Advances in Glycerol Polymers: Chemistry and Biomedical Applications. Macromolecular Rapid Communications. 35 (22), 1906-1924 (2014).
- Klotz, B. J., Gawlitta, D., Rosenberg, A. J. W. P., Malda, J., Melchels, F. P. W. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair. Trends in Biotechnology. 34 (5), 394-407 (2016).
- Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Ansari, S., et al. Regulation of the fate of dental-derived mesenchymal stem cells using engineered alginate-GelMA hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2957-2967 (2017).
- Axpe, E., Oyen, M. Applications of Alginate-Based Bioinks in 3D Bioprinting. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 1976 (2016).
- Ma, X., et al. 3D printed micro-scale force gauge arrays to improve human cardiac tissue maturation and enable high throughput drug testing. Acta Biomaterialia. 95, 319-327 (2019).
- Bas, O., et al. Rational design and fabrication of multiphasic soft network composites for tissue engineering articular cartilage: A numerical model-based approach. Chemical Engineering Journal. 340, 15-23 (2018).
- O'Connell, C. D., et al. Tailoring the mechanical properties of gelatin methacryloyl hydrogels through manipulation of the photocrosslinking conditions. Soft Matter. 14 (11), 2142-2151 (2018).
- LearnPython.org. , Available from: https://www.learnpython.org (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Using your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-using (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Setting up your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/4 (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Connect your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/3 (2020).
- Python Software Foundation: python.org. , Available from: https://www.pthon.org (2020).
- Python Software Foundation: pypi.org. , Available from: https://pypi.org (2020).
- Opentrons Labworks, Inc: Installing pipettes. , Available from: https://support.opentrons.com/en/articles/689945-installing-pipettes (2020).
- Kang, C. W., Lee, M. S., Seong, Y. J., Hawkins, D. M. A Control Chart for the Coefficient of Variation. Journal of Quality Technology. 39 (2), 151-158 (2007).
- Annabi, N., et al. 25th Anniversary Article: Rational Design and Applications of Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
- Theo Sanderson: OpenTronsTerminalCalibration. , Available from: https://github.com/theosanderson/OpentronsTerminalCalibration (2020).
- Rhode, H., et al. An Improved Method for Checking HTS/uHTS Liquid-Handling Systems. Journal of Biomolecular Screening. 9 (8), 726-733 (2004).
- Taylor, P. B., et al. A Standard Operating Procedure for Assessing Liquid Handler Performance in High-Throughput Screening. Journal of Biomolecular Screening. 7 (6), 554-569 (2002).
