Summary
该协议是使用新颖的开源自动化技术对粘性材料进行标准化和可重复混合的综合教程。提供了有关新开发的开源工作站的操作，开源协议设计器的使用以及识别可重复混合物的验证和确认的详细说明。
Abstract
目前粘性材料的混合步骤依赖于重复且耗时的任务，这些任务主要在低吞吐量模式下手动执行。这些问题代表了工作流程中的缺点，最终可能导致研究结果的不可重复性。基于手动的工作流程进一步限制了粘性材料的进步和广泛采用，例如用于生物医学应用的水凝胶。通过使用具有标准化混合过程的自动化工作流程来提高可重复性，可以克服这些挑战。在本研究中，我们提供了使用开源协议设计器，操作开源工作站以及识别可重复混合物的分步说明。具体而言，开源协议设计器指导用户完成实验参数选择，并生成即用型协议代码来操作工作站。该工作站针对粘性材料的移液进行了优化，通过集成热响应材料的温度底座、用于粘性材料的容积式移液器以及用于从移液器吸头中去除多余物料的可选吸头触摸底座，实现自动化和高度可靠的处理。混合物的验证和确认是通过快速且廉价的橙色G吸光度测量来执行的。该协议提供了获得80%（v / v）甘油混合物的结果，明胶甲基丙烯酰（GelMA）的稀释系列，以及5%（w / v）GelMA和2%（w / v）海藻酸盐的双网络水凝胶。包含故障排除指南，以支持用户采用协议。所描述的工作流程可以广泛地应用于许多粘性材料，以自动方式生成用户定义的浓度。
Introduction
再现性和可复制性在科学工作中至关重要1，2，3，4。然而，最近的證據強調了在基礎科學和轉化研究中重複高影響力生物醫學研究的重大挑戰4，5，6，7。导致不可重复结果的因素是复杂且多方面的，例如研究设计不佳或有偏见6，8，统计能力不足3，9，缺乏对报告标准的遵守7，10，11，发布压力6，或方法或软件代码不可用6，9.其中，实验方案的细微变化和实验执行中的人为错误已被确定为导致不可重复性的进一步因素4。例如，手动移液任务会导致个体内部和个体间的不精确性12，13 ，并增加了人为错误的可能性14。虽然商用液体处理机器人能够克服这些缺点，并已证明液体的可靠性有所提高15、16、17，但具有显著粘性特性的材料的自动处理仍然具有挑战性。
商用液体处理机器人通常使用气垫移液器，也称为空气活塞或空气置换移液器。试剂和活塞由气垫隔开，气垫在分配步骤中收缩，在吸气步骤中膨胀。使用气垫移液器时，粘性物质仅缓慢地"流入"和流出吸头，并且过早地将移液器从储液罐中取出可能导致吸入气泡。在点胶任务期间，粘性材料在内尖端壁上留下一层薄膜，当被空气强制时，该薄膜仅缓慢或根本不流动。为了克服这些问题，在商业上引入了容积式移液器，以使用实心活塞主动挤出吸头中的粘性材料。虽然这些正置换式移液器能够准确可靠地处理粘性材料，但对于学术实验室环境而言，使用正置换式移液器的自动化解决方案仍然过于昂贵，因此，大多数使用粘性材料的工作流程仅依赖于手动移液任务18。
通常，粘度被定义为流体流动的阻力，粘性材料进一步被定义为具有更大水粘度的材料（25°C时为0.89 mPa·s s）。在生物医学应用领域，实验装置通常包含多种粘度高于水的材料，例如二甲基亚砜（DMSO;25°C时为1.99 mPa·s），甘油（25°C下为208.1 mPa·s，90%甘油[v/v]），Triton X-100（25°C时为240 mPa·s）和水膨胀聚合物，称为水凝胶19，20.水凝胶是以物理或/和化学模式排列的亲水性聚合物网络，用于各种应用，包括细胞封装，药物输送和软致动器19，20，21，22。水凝胶的粘度取决于聚合物浓度和分子量19。用于生物医学应用的常规使用水凝胶的粘度值在1至1000 mPa·s之间，而据报道，特定的水凝胶体系具有高达6 x 107 mPa·s19，23，24的值。然而，水凝胶的粘度测量在测量方案和样品制备方面没有标准化，因此，不同研究之间的粘度值难以比较。
由于市售的专门为水凝胶设计的自动化解决方案要么缺失，要么过于昂贵，因此目前的水凝胶工作流程依赖于手动处理18。要了解当前基于手动的水凝胶移液工作流程的局限性，重要的是要理解基本的处理任务18。例如，一旦合成了新型水凝胶材料，就会生成所需浓度或具有不同浓度的稀释系列，以确定可靠的合成方案和交联特性，并随后分析机械性能25，26，27，28.通常，制备或购买储备溶液，然后与稀释剂和/或其他试剂混合以获得混合物。混合任务通常不是直接在孔板（或任何输出格式）中执行的，而是在单独的反应管中执行，这通常被称为预混液。在这些制备任务中，需要各种吸气和分配步骤来转移粘性材料，混合试剂并将混合物转移到输出格式（例如，96孔板）。这些任务需要大量的人力18，实验时间长，并增加了人为错误的可能性，这些错误可能表现为不准确的结果。此外，手动处理会妨碍高效制备高样品数量，以筛选各种参数组合以进行详细表征。手动处理还阻碍了水凝胶在高通量筛选应用中的使用，例如在药物开发过程中鉴定有前途的化合物。目前基于手动的制备步骤无法筛选由数千种药物组成的药物库。由于这些原因，需要自动化解决方案来提供有效的开发过程，并能够成功转化用于药物筛选应用的水凝胶。
为了从基于手动的工作流程转向自动化流程，我们优化了商用开源移液机器人，通过集成热响应材料的温度底座，使用毛细管活塞吸头的现成容积式移液器，以及用于移液器吸头清洁的可选吸头触摸底座来处理粘性物料。该移液机器人已作为移液模块进一步集成到新开发的开源工作站中，该工作站由即装即用和可定制的模块组成18，29。开发工作站的详细汇编说明，包括硬件和软件文件，可从GitHub（https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation）和Zenodo存储库（https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757）免费访问。除了硬件开发之外，还编写并发布了一个开源协议设计应用程序，以指导用户完成参数选择过程并生成即用型协议代码（https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp）。该代码在商业开源移液机器人以及开发的开源工作站上运行。
本文提供了有关开源工作站操作以自动执行粘性材料混合任务的综合教程（图1）。特定于教程的协议步骤可以使用开发的开源工作站以及商业开源移液机器人进行。在内部开发的开源方案设计应用程序的支持下，演示了甘油，明胶甲基丙烯酰（GelMA）和海藻酸盐所需浓度的自动混合和制备。本教程中选择了甘油，因为它具有良好的表征30，31，它价格低廉且易于获得，因此，它通常用作自动移液任务的粘性参考材料。作为生物医学应用中使用的水凝胶的例子，GelMA和海藻酸盐水凝胶前体溶液已应用于自动混合实验。GelMA是细胞封装研究最常用的水凝胶之一32，33，本研究选择了海藻酸盐来证明其制造双网络水凝胶的能力34，35。使用Orange G作为染料，实施了一种快速且廉价的程序，以使用分光光度计16验证和验证混合结果。
一个商用开源移液机器人已作为移液模块集成到开发的开源工作站中（图2a），因此，名称"移液模块"进一步用于描述移液机器人。已安装硬件的详细说明超出了此协议的范围，可通过提供的存储库获得，其中还包括开源平台大会的分步说明。移液模块可以配备两个移液器（单通道或8通道移液器），分别安装在轴A（右）和轴B（左）上（图2b）。移液模块根据美国国家标准协会/实验室自动化和筛选协会（ANSI/SLAS）标准提供10层容量，并且在甲板上定义了以下位置位置：A1，A2，B1，B2，C1，C2，D1，D2，E1，E2（图2c）。为了启动水凝胶溶液的光诱导聚合，需要一个单独的交联剂模块，并且已将其添加到工作站中。交联剂模块配有波长为400nm的LED，因此，在可见光波长下激发的物质可用于当前系统，例如苯基-2，4，6三甲基苯甲酰亚磷酸锂（LAP）36，37。用户可在协议设计应用中解决 LED 的强度（单位：mW/cm2），以研究交联行为38。该工作站还包括一个存储模块，可以提高吞吐量研究;但是，本研究中未使用该模块，因此未进一步描述。通常，建议在生物安全柜中操作移液模块，以避免样品污染。操作移液模块的主要电源电路是12 V电路，在大多数国家/地区被认为是低压应用。所有电气组件都位于专用的控制盒中，可防止用户接触电气危险源。
通过遵循这些标准化的混合协议，研究人员能够以自动化的方式实现粘性和非粘性材料的可靠混合物。开源方法允许用户优化混合序列，并与社区共享新开发的协议。最终，这种方法将促进筛选多个参数组合，以研究不同因素之间的相互依赖性，从而加速生物医学应用中粘性材料的可靠应用和开发。
Protocol
注：该协议首先介绍 （1） 软件和 （2） 硬件设置，以使用户熟悉所需的安装和工作站。在关于（3）材料制备和（4）协议设计器应用程序的使用，（5）移液模块的校准和（6）自动协议的执行的部分之后，将详细强调。最后，描述了（7）验证和验证程序，包括吸光度读数和数据分析。 图 1 显示了包含各个任务的常规协议工作流。
1. 软件设置
注：本节包括安装应用程序编程接口（API）以及所需的协议设计器应用程序和校准终端的详细说明。以下说明是为树莓派（RPi）单板计算机编写的;但是，Windows 8，10和macOS 10.13 +也已成功与API和应用程序一起使用。
- 设置计算机环境。
注意：熟悉 Python39 的基础知识、如何设置和使用 Raspberry Pi40、41 以及如何连接到 Internet42。以下教程步骤重点介绍特定于协议的步骤，有关 Raspberry Pi 用法的其他信息可在线获取40。- 从任务栏或应用程序菜单中打开终端窗口。
- 更新系统的软件包列表：
sudo apt-get update - 升级所有已安装的软件包：
sudo apt-get dist-upgrade - 重新启动树莓派：
sudo reboot - 检查已安装的 Python 版本：
python3 --version
确保至少安装了Python 3.5;如果没有，请安装最新版本43。 - 安装 python pip，它使用 Python Package Index44 发布 Python 包：
sudo apt-get install python3-pip - 安装依赖项：
pip install numpy
pip install python-resize-image
注意：如果您使用的是Windows，则需要通过以下方式安装Windows-curses软件包：python -m pip install windows-curses
- 安装应用程序编程接口 （API）。
注意：该 API 提供了一个简单的 Python 框架，旨在编写实验性协议脚本并操作工作站。成功执行生成的协议代码需要以下两个 API。- 安装工作站 API：
pip install openworkstation - 安装 Opentrons API 以操作移液模块：
pip install opentrons==2.5.2 - 验证 API 是否已成功安装：
python3
>>>导入开放工作站
>>>导入 opentrons
注意：API 和协议设计应用程序的大小分别为 2.2 MB 和 1.2 MB。在磁盘空间有限 （200 MB） 的情况下使用时，安装过程中未遇到任何问题。但是，磁盘空间要求取决于操作系统。
- 安装工作站 API：
- 选择文件下载目录（校准终端、协议设计应用程序等）。
注意：之后可以将文件复制并粘贴到其他位置。 - 从 GitHub 存储库克隆文件：
git clone https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
注意："git clone"命令克隆并随后将所有文件保存到该目录中，该目录此时在终端中打开。由于存储库还包括程序集的硬件文件，因此执行所提供的协议不需要整个存储库。复制实验所需的所有文件都可作为 补充文件 提供，并可在 GitHub 存储库中的"/examples/publication-JoVE"下找到。 - 打开下载的文件夹。如果整个存储库已下载，请通过以下方式导航到"publish-JoVE"文件夹
cd openworkstation/examples/publication-JoVE
注：此文件夹包括工作站操作以及使用协议设计器应用程序和校准终端所需的文件。
2. 硬件设置
- 将工作站放在生物安全柜中，以避免样品污染。
- 在工作站上安装移液器。
- 根据实验设置选择移液器尺寸。通常，取一个移液器尺寸，其吸气量在范围的较高端。如果特定设置需要体积大于 1 mL 的混合任务（例如，吸出/分液 2 mL），请选择最大吸出量/分液量为 1，000 μL 的 M1000E，以最大限度地减少移液步骤并节省时间。
注：有关置换式移液器的详细说明，请在线获取45。开发的移液模块能够集成以下现成的正置换式移液器：M10E （1–10 μL）、M25E （3–25 μL）、M50E （20–50 μL）、M100E （10–100 μL）、M250E （50–250 μL）、M1000E （100–1，000 μL）。 - 使用 M4 内六角扳手松开并拧紧螺钉。
- 将两个移液器固定板（白色丙烯酸板）连接到铝制导轨上，然后松松地拧紧M5螺钉。
- 将移液器插入两个移液器固定板，并确保移液器的符合人体工程学的尾部位于丙烯酸安装板的另一侧。
- 拧紧两个移液器固定板的四个螺钉。
- 将连接到亚克力安装板上的两个方形紧固螺母滑入 z 轴的挤出槽中，然后拧紧螺钉。
注：请紧紧固移液器，以避免在操作过程中有任何移动。
- 根据实验设置选择移液器尺寸。通常，取一个移液器尺寸，其吸气量在范围的较高端。如果特定设置需要体积大于 1 mL 的混合任务（例如，吸出/分液 2 mL），请选择最大吸出量/分液量为 1，000 μL 的 M1000E，以最大限度地减少移液步骤并节省时间。
3. 材料准备
注意：粘性材料（甘油，GelMA，海藻酸盐）用于本研究中提出的实验，因此，制备的体积和处理任务（例如，在5 mL反应管中加入5mL储备溶液）专门用于此实验设置。
- 明胶甲基丙烯酰（GelMA）
注意：GelMA功能化，透析和冻干不是本文的范围，并且在Loessner等人中提供了分步方案。该协议开始使用冻干凝胶MA，其可以在内部制备或商业购买。- 使用以下公式，根据所需的最终储液浓度 （cGelMA） 和体积 （VGelMA） 计算所需质量的 GelMA （mGelMA）：
mGelMA = cGelMA x VGelMA
注意：VGelMA取决于实验设置，建议准备20-30%的过量材料。所提出的方案从5 mL 20%（w / v）GelMA作为储备溶液开始。 - 称取所需量的冻干凝胶MA，将其加入50 mL反应管中，并加入所需量的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 通过将凝胶MA浸泡在4°C的溶剂中过夜或在水浴中加热至60°C6小时来混合GelMA。
注意：无菌凝胶MA溶液可以在4°C的避光保护下储存至少六个月。 - 将 5 mL GelMA 灌装到 5 mL 反应管中。
- 使用以下公式，根据所需的最终储液浓度 （cGelMA） 和体积 （VGelMA） 计算所需质量的 GelMA （mGelMA）：
- 光引发剂：苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂（LAP）
注：避免过度暴露于室内光线下，因为 LAP 对光敏感。- 使用以下公式，根据所需的最终库存浓度 （cLAP） 和所需体积 （VLAP） 计算所需 LAP （mLAP） 质量：
mLAP = cLAP x VLAP
注意：建议准备3%（w / v）的储备溶液。 - 称量所需量的LAP，将其加入15 mL反应管中并加入PBS。
- 将管子包裹在铝箔中以防止光致分解。
- 通过将反应管置于37°C的水浴中2小时或直到完全溶解来溶解LAP。
- 将 1 mL LAP 储备溶液倒入 5 mL 管中。
- 使用以下公式，根据所需的最终库存浓度 （cLAP） 和所需体积 （VLAP） 计算所需 LAP （mLAP） 质量：
- 海藻 酸
- 使用以下公式根据所需的最终库存浓度（甘膦酸盐）和体积（醛酸盐）计算所需的海藻酸盐（麦氏酸盐）量：
麦氏酸盐 = 甘氨酸盐 x 甘酸盐酸盐
注意：戊酸盐取决于实验设置，建议准备20-30%的过量材料。所提出的方案从5 mL的4%（w / v）海藻酸盐作为储备溶液开始。 - 称量所需质量的海藻酸盐，将其加入50 mL反应管中，然后加入PBS。
- 将海藻酸盐混合物放入37°C的水浴中4小时。
注意：使用涡流混合器将加速溶解过程，但也会产生气泡。溶解的海藻酸盐可以在4°C下储存至少六个月。 - 将 5 mL 海藻酸盐倒入 5 mL 反应管中。
- 使用以下公式根据所需的最终库存浓度（甘膦酸盐）和体积（醛酸盐）计算所需的海藻酸盐（麦氏酸盐）量：
- 将 5 mL 甘油倒入 5 mL 反应管中。
- 橙色G溶液
- 在50 mL反应管中制备10mg / mL橙色G储备溶液。
注意：数量取决于实验次数。根据稀释剂类型，在超纯水，PBS或合适的稀释剂试剂中制备储备溶液。在所提出的实验中，使用超纯水稀释甘油，使用PBS稀释GelMA和海藻酸盐。PBS被用作GelMA和海藻酸盐的稀释剂，可以使用片剂制备或现成购买。 - 通过涡旋混合10秒。
- 将管子包裹在铝箔中以防止光致分解。
注意：储备溶液可以在24小时后使用，以确保Orange G的适当溶解。 - 将储备溶液稀释至50 mL反应管中的1mg / mL工作溶液。
- 将工作溶液转移到适当的烧瓶/管中以进行实验设置。
注意：对于所提出的实验，将工作溶液填充到5 mL管中。橙G储备和工作溶液可以储存在4°C，并在制备后三个月内使用。 - 将 5 mL 1 mg/mL 橙色 G 工作液倒入 5 mL 反应管中。
- 在50 mL反应管中制备10mg / mL橙色G储备溶液。
4. 使用协议设计器应用程序生成协议代码
注：步骤4.2−4.7中指定的参数对于所有进行的实验都是相同的，但材料的库存浓度和最终输出浓度除外。这些参数总结在 表1 中，在下文中，参数用于制备具有5%（w / v）GelMA，2%（w / v）海藻酸盐，0.15%（w / v）LAP和PBS作为稀释剂的双网络水凝胶。
- 通过运行"ProtocolDesignApp.html"打开协议设计器应用程序。
注意：应用程序"ProtocolDesignApp.html"将指导用户完成参数选择过程，并自动生成即用型协议来操作工作站。用户界面运行在每个常用的互联网浏览器（即Chrome，Firefox，Safari，edge，Internet Explorer）上。 - 在设置页面上输入协议名称（例如，双网络水凝胶）。
- 单击"继续"以确认协议名称并继续执行下一步。
- 通过从下拉菜单中选择"3x4 加热块"和以下输入参数来定义输入托盘：
- 从下拉菜单中选择"凝胶1"，输入名称"GelMA"，输入库存浓度"20%"，将"样品数量"设置为"3"以填充一列。单击"+添加"以保存条目。
- 从下拉菜单中选择"凝胶2"，输入名称："海藻酸盐"，输入库存浓度"4%"，将"样品数量"设置为"3"以填充一列。单击"+添加"以保存条目。
- 从下拉菜单中选择"光引发剂"，输入名称："LAP"，输入库存浓度"3%"，将"样品数量"设置为"3"以填充一列。单击"+添加"以保存条目。
- 从下拉菜单中选择"稀释剂1"，输入名称："PBS"，将"样品数量"设置为"3"以填充一列。单击"+添加"以保存条目。
注：单击"+add"后，输入托盘的可视化会自动更新。如果添加的输入数超过托盘的容量，则会向用户显示警告"此托盘的样本太多"。
- 通过选中"照片交联"并输入时间（以秒为单位）、"30"和强度 W/m2 并输入"2"来定义交联参数。
- 通过单击"继续"完成输入设置。
- 通过在孔板类型的下拉菜单中选择"96 孔板"来定义输出托盘设置。
- 单击"Group1"，通过创建一组样本来定义输出。
- 通过在每个输入的字段中输入所需的浓度和样品体积来指定输出成分：GelMA = '5'，海藻酸盐= '2'，LAP = '0.15'，总体积= '60'。
- 复选框以应用高级混合协议。
- 通过在"样本数"字段中输入样本数来指定样本数："96"。
注：单击"+添加组"后，样品盘的可视化会自动更新。如果添加的样品超过托盘的容量，则会向用户显示警告"此托盘的样品太多"。 - 通过单击"继续"完成输出设置。
- 在甲板布局上选择托盘位置并相应地准备平台：
- 选中"插槽A1"字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择"Empty_Cell"。
- 选中"插槽A2"字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择"Trash_Cell"。
- 选中"插槽 B1"字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择"Tips_Cell_100 μL"。
- 选中"插槽 B2"字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择"Tips_Cell_1000 μL"。
- 选中"插槽C1"字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择"Input_Cell"。
- 选中"插槽 C2"字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择"Empty_Cell"。
- 选中"插槽D1"字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择"Mixing_Cell"。
- 选中"插槽D2"字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择"Output_Cell"。
- 通过选中"左移液器"，从下拉菜单中选择"10-100μL正置换量"并将吸气速度设置为"600"，分配速度= "800"，定义第一个移液器（M100E）的类型和特性。
- 通过选中"移液器正确"，从下拉菜单中选择"100-1000μL正置换量"并将吸气速度设置为"800"，分配速度= "1200"，定义第二移液器（M1000E）的类型和特性。
- 单击"生成协议"以确认设置并生成协议脚本。
注意：每当生成新协议时，开发的协议设计器应用程序都会自动生成一个新文件夹。此实验和操作工作站所需的所有文件都保存在此文件夹中，该文件夹以协议名称命名。可以将该文件夹复制到不同的目录中，而不会引起问题。 - 不要关闭接口，因为它将用于执行协议（请参阅步骤 6.6）。
5. 移液模块的校准
注意：容器（例如，孔板、吸头架、垃圾桶）和移液器（例如 M1000E）必须首先进行校准。如果容器和/或移液器位置被修改/更改，则必须校准新位置。
- 导航到协议文件夹，并通过在终端 windox 中执行文件"calibrate.py"打开校准终端（参见步骤 1.1.1）：
phython.calibrate.py
注："calibrate.py"界面可指导用户完成台式设置和移液器的校准。确保该文件与协议文件和模块文件位于同一文件夹中。它是在步骤 4.10 中自动生成的。 - 使用数字键盘 （1−8） 选择柱塞、y、z 移动的移动增量："1"表示 0.1 mm，"2"表示 0.5 mm，"3" 表示 1 mm，"4" 表示 5 mm，"5" 表示 10，"6" 表示 20 mm，"7" 表示 40 mm，"8" 表示 80 mm。
- 校准移液器。
- 按键盘快捷键 P 选择移液器尺寸。
- 按键盘快捷键 V 进入柱塞校准模式。
注：建议从小增量（2、5 和 10 mm）开始，以熟悉移液器头的增量大小和运动动作。 - 校准容积式移液器的以下柱塞位置：T–Top = 静止位置;B–底部 = 柱塞被推动，直到遇到阻力;P–拾取 = 柱塞被推到可以连接活塞尖端的位置;E–弹出 = 柱塞被推动，直到连接的尖端被弹出。使用键盘上的向上和向下箭头改变柱塞位置，并使用键盘上的 S 保存最终位置。
- 按键盘快捷键 V 离开移液器柱塞校准模式。
- 校准容器相对于移液器吸头的位置。
- 按键盘快捷键 P 选择移液器类型。确保吸头已连接到选定的移液器。
- 按键盘快捷键 C 选择容器类型。
- 选择适当的移动增量，并将移液器吸头移动到以下位置。对于孔板，校准到底部的"A1"孔位置;对于吸头架，校准到"A1"位置;对于回收站，请选择一个位置（定义为一个点），以便将吸头弹出到垃圾箱中。
- 按键盘快捷键 S 保存位置。
- 对所选移液器类型在"C"下列出的所有容器重复步骤5.3.1−5.3.3。
- 对第二种移液器类型重复5.3.1−5.3.5。
- 关闭校准脚本。
6. 使用工作站执行协议
注意：协议文件可通过存储库访问，也可以作为 补充文件提供。
- 将垃圾箱、吸头架、进纸盘、混合盘和出料放在料台上（在步骤 4.3 中定义）。
- 校准第 5 节中定义的移液器和仪器。
- 如果需要，请打开温度底座，并选择输入和混合托盘的温度。
注意：本教程中的实验在没有温度控制的情况下进行，甘油在40°C下进行，GelMA和海藻酸盐移液在37°C下进行。 - 根据所选设置，将带有输入试剂的管子定位在温度底座上的铝块中。
- 等到输入试剂达到所需温度。
注意：为确保适当的温度分布，建议凝胶MA和海藻酸盐的孵育时间为30分钟。 - 通过单击"运行PYTHON脚本"执行协议文件
注意：选定的协议现在由工作站执行。随附的视频重点介绍了GelMA的自动混合以及将60μL分配到96孔板中。 - 当显示"已完成"时，运行完成。
7. 验证和验证过程
- 从工作站上取出孔板，并将孔板与样品一起运送到分光光度计。
- 使用分光光度计读取450nm处的吸光度。读取每个板2x以比较结果并确保结果一致。
- 导出并保存吸光度读数。
- 数据分析。
注意：实验数据可以单独处理，也可以复制并粘贴到提供的模板中，以使用电子表格软件评估平均值，标准差和方差系数（CV）值。- 打开 补充文件 "supplementary_template分析.xlsx"，该文件也可以在GitHub存储库中的"openworkstation/examples/publication-JoVE"下使用。
- 将吸光度读数复制到"原始数据"表中，确保所有表中正确定义所有细胞参考，然后单击"分析"表以获取有关平均值，标准偏差和方差系数（CV）值的信息。
注意：根据孔板上的样品分布，模板提供以下预设评估类型：当所有样品具有相同的成分时使用"均匀"类型，当不同行中的样品具有不同的成分时使用"按行"类型，当不同色谱柱中的样品具有不同的成分时使用"按列"类型， 当样品位置是用户特定的时，将使用"自定义"类型。
Representative Results
本教程介绍了使用甘油（图3）和GelMA与LAP和海藻酸盐（图4）的实验结果。
在没有温度控制（室温，22°C）和不接触尖端（定义为设置1），温度控制（40°C）和没有尖端触摸（设置2）或温度控制（40°C）和尖端触摸（设置3）的情况下研究了80%（v / v）甘油溶液的产生（图3a-i）。选择这两种温度设置来评估处理差异，因为当从22°C（139.5 mPa·s）加热到40°C（46.6 mPa·s）30时，甘油的粘度几乎降低了3倍。将85%（v / v）甘油储备溶液稀释至80%的最终浓度，并均匀分布到96孔板中（每个设置n = 96）。实验时间为30分钟42秒，包括将每种材料分配到混合物管中，相应的混合任务以及样品分配到96孔板中。为了确定稀释混合物之间的差异，用1mg / mL橙G制备超纯水 - 作为甘油的稀释剂。吸光度读数强调，温度控制和尖端接触的集成会显著影响混合物（p < 0.0001）。除了执行的双向方差分析（方差分析）外，还计算了CV值以评估相对标准偏差。变异系数描述了一个标准化指标，用于识别与平均值相关的偏差程度，并以百分比表示。如果样品均值不是特别感兴趣的点，而是测量值内的变异性，则变异系数为识别可重复的混合物提供了额外的见解46。在三种不同设置的实验中，对于设置1，设置2和设置3，吸光度值分别从5.6%，4.2%下降到2.0%，表明温度底座和尖端触摸功能对产生可靠结果的显着影响（图3a-ii）。绘制设置3的样品吸光度值（96孔板中的样品编号#1至#96）在整个实验过程中不产生增加或减少的值，因此表明样品位置对吸光度值没有影响（图3a-iii）。使用热图可视化每个测量孔板的数据可提供额外的见解，以识别特定行或色谱柱的异质性，或在整个分配任务中变化的吸光度值。三个设置的可视化热图显示从设置1到设置3的整个孔板的异质性降低（图3b）。最后，在八次独立运行中评估了传导混合的可重复性（图3c-i，ii），其中每次运行需要6分钟57秒。单次混合运行的CV值低，介于1.1%至2.6%之间，这表明单个运行的混合和分配任务非常可靠。所有八次运行的吸光度值均产生3.3%的CV值，并证明了已建立的混合方案的再现性。
通过将20%（w / v）的PBS储备溶液稀释至14，12，10，8，6，4，2和0%（w / v）并加入LAP至0.15%（w / v）的恒定浓度（图4a-i）来制备GelMA稀释系列，总共需要55分钟12 s。如实验方案脚本中所述，水凝胶在400nm处交联30 s，强度为2.0 mW / cm 2。为了评估混合物之间的差异，用1mg / mL橙G制备PBS（作为GelMA和海藻酸盐的稀释剂），因此，用分光光度计鉴定一种混合物内样品之间的吸光度差异以及连续稀释液之间的吸光度差异。每个浓度步骤的测量吸光度值显着不同（p <0.0001），并且在整个浓缩步骤中具有非常低的CV值，介于1.2%至3.4%之间（每个浓度步骤n = 12）。线性回归显示出高拟合度，R²值为0.9869（图4a-ii），热图证实了每种浓度的同质分布和浓度之间的差异（图4a-iii）。对四种试剂进行自动混合，以产生5%（w / v）GelMA，2%（w / v）海藻酸盐，0.15%（w / v）LAP和PBS作为稀释剂，无需（设置2）和（设置3）触摸尖端（每个设置n = 96）具有相同的交联参数（30 s，2.0 mW / cm2，400 nm）。分配四种材料，混合并分配到96孔板中需要32分钟22秒。所有使用GelMA和海藻酸盐的实验均在37°C下进行，以防止热凝胶化，从而防止凝胶MA的移液。使用吸头触摸选项，CV值从5.2%降低到3.4%，特别是通过从吸头中去除多余的材料来防止较低区域的异常值（图4b-i）。尽管设置 2 和设置 3 的平均值 1.927 和 1.944 非常接近，但变异系数突出显示了相对于平均值的递减偏差。可以使用热图可视化来检测行和/或列差异，从而将96孔板的单行相互比较（图4b-ii）。
图 1：包含单个任务的协议工作流。 所描述的工作流分为七个任务，这些任务分为设置、准备、执行和分析。首先，必须设置软件（任务 1）和硬件（任务 2）。在准备材料（任务3）和生成协议脚本（任务4）后，通过定义移液器和容器位置（任务5）来校准移液模块。接下来，在工作站上执行协议脚本（任务6），并对混合物进行验证和确认（任务7）以评估混合物。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：移液模块的开源工作站和平台设置。 （a） 所开发的工作站受到装配线方法的启发，其中样品通过不同的模块进行运输，并由以下模块组成：移液，交联剂，存储，运输和计算模块。（b）移液模块的甲板根据实验布局（例如，孔板类型，管体积等）进行设置。显示的甲板设置用于演示的实验，包括范围为10-100μL（M100E）和100-1，000μL（M1000E）的正位移移液器，带有毛细管活塞（CP）的吸头架（CP）为100μL（CP1000）和1，000μL（CP1000），垃圾容器，混合托盘和用于输入试剂的进纸盘。（c） 可用甲板位置用显示的数字确定。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：甘油混合物自动移液的结果。 （a） 灵活的工作站设计能够对三种不同的设置进行评估（i）以确定最佳参数，以获得可重复的结果。（ii） 添加尖端接触和加热材料导致方差系数（CV）值降低，并且设置的混合物具有高度可重复性 3.每个实验用96个样本进行。（iii）单个样品值的绘制对移液序列没有影响。（b）使用热图可视化每个设置的实验结果，以确定对原始/柱差异，边缘或主混合物的影响。（c） 使用 （i） 中位数、标准偏差、CV 值和 （ii） 热图在八次独立运行中分析了设置 3 的再现性。面板 a-ii （n = 96） 和 b-i （n = 12） 中的数据与均值和单个数据点一起表示。使用双向方差分析 （ANOVA） 将统计显著性定义为 ****p < 0.0001。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：与水凝胶混合任务的结果。 （a）从明胶偏丙酰（GelMA）20%（w / v）储备溶液中，使用96孔板（每个浓度n = 12）在一次实验运行中产生14，12，10，8，6，4，2和0%（w / v）的连续稀释。（i） 在整个制备的浓度中，方差系数（CV）值在1.2%至3.4%之间变化，并且（ii）线性回归显示出高拟合度，R²值为0.9869。（iii） 使用生成的热图直观地确认了均质稀释。（b）用5%（w / v）GelMA，2%（w / v）海藻酸盐和0.15%（w / v）LAP （i）产生双网络水凝胶，有和不带尖端接触（n = 96对于每个设置）并在400nm处交联30 s，强度为2.0 mW / cm 2。尖端触摸的集成导致CV值从5.2%降低到3.4%。（二，三）热图确认使用吸头触摸去除吸头中多余的材料时偏差更少。面板 a-i 和 b-i 中的数据以均值和单个数据点表示。使用单因素方差分析（方差分析）将统计显著性定义为 *p < 0.05、***p < 0.001 和 ****p < 0.0001。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：移液器类型差异和粘性生物材料问题摘要。 （a） 试剂和活塞由气垫隔开，气垫在分配步骤中收缩，在吸气步骤中膨胀。当吸气和分配粘性材料时，缓慢的"流动"会带来气泡和不规则的移液行为等问题。（b） 容积式移液器通过使用吸头内的活塞，能够可靠地吸气和分配粘性材料。（c）移液高粘度物质（例如，4%（w / v）海藻酸盐）可导致过量物质积聚在吸头上，从而导致整个实验不准确。（d） 采用简单的吸头触摸托盘，可以去除吸头上多余的材料，从而产生准确的吸气和分配量。这是通过使用放置在尖端架容器上的孔板盖的内侧来实现的。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 材料 #1（库存集中度） | 材料最终浓度 #1 | 材料 #2（库存浓度） | 材料最终浓度 #2 | 材料 #3（库存集中度） | 材料最终浓度 #3 | 稀释剂（橙G工作液） | 混合物中最终的橙G浓度 | 如图所示 |
| 甘油 （85% （w/v）） | 80% （瓦/瓦） | 水（1毫克/毫升橙G） | 0.059毫克/毫升 | 图 3a−c | ||||
| 凝胶玛 （20% （瓦/v）） | 0% （瓦/v） | LAP （3% （W/V）） | 0.15% （瓦/瓦） | PBS （1 毫克/毫升橙 G） | 1毫克/毫升 | 图 4a | ||
| 凝胶玛 （20% （瓦/v）） | 2% （瓦/v） | LAP （3% （W/V）） | 0.15% （瓦/瓦） | PBS （1 毫克/毫升橙 G） | 0.85毫克/毫升 | 图 4a | ||
| 凝胶玛 （20% （瓦/v）） | 4% （瓦/v） | LAP （3% （W/V）） | 0.15% （瓦/瓦） | PBS （1 毫克/毫升橙 G） | 0.75毫克/毫升 | 图 4a | ||
| 凝胶玛 （20% （瓦/v）） | 6% （瓦/v） | LAP （3% （W/V）） | 0.15% （瓦/瓦） | PBS （1 毫克/毫升橙 G） | 0.65毫克/毫升 | 图 4a | ||
| 凝胶玛 （20% （瓦/v）） | 8% （瓦/v） | LAP （3% （W/V）） | 0.15% （瓦/瓦） | PBS （1 毫克/毫升橙 G） | 0.55毫克/毫升 | 图 4a | ||
| 凝胶玛 （20% （瓦/v）） | 10% （瓦/v） | LAP （3% （W/V）） | 0.15% （瓦/瓦） | PBS （1 毫克/毫升橙 G） | 0.45毫克/毫升 | 图 4a | ||
| 凝胶玛 （20% （瓦/v）） | 12% （瓦/v） | LAP （3% （W/V）） | 0.15% （瓦/瓦） | PBS （1 毫克/毫升橙 G） | 0.35毫克/毫升 | 图 4a | ||
| 凝胶玛 （20% （瓦/v）） | 14% （瓦/v） | LAP （3% （W/V）） | 0.15% （瓦/瓦） | PBS （1 毫克/毫升橙 G） | 0.25毫克/毫升 | 图 4a | ||
| 凝胶玛 （20% （瓦/v）） | 5% （瓦/v） | 海藻酸盐 （4% （w/v）） | 2% （瓦/v） | LAP （3% （W/V）） | 0.15% （瓦/瓦） | PBS （1 毫克/毫升橙 G） | 0.2毫克/毫升 | 图 4b |
表1：所进行实验的参数概述。
| 协议步骤 | 问题 | 可能的原因 | 溶液 |
| 1.1 | 无法安装或更新软件 | SD 卡上的磁盘空间不足 | 检查SD卡上的磁盘空间。如果需要，请移除不必要的物品、清空垃圾箱或使用适当大小的 SD 卡 |
| 1.2 | 无法安装 API | 用户安装能力受到限制（无 root 用户权限） | 在指定命令前面使用"sudo"命令来获得管理员权限。在 Linux 中，这种访问称为超级用户。 |
| 3.1 | 凝胶玛的麻烦 | 功能化、透析或冻干 | 详细的分步协议，包括Loessner等人33中提供的故障排除列表。 |
| 5.1 和 6.2 | 工作站未对命令做出反应 | 连接问题 | 转动一切并关闭计算机。关闭电源 10 秒。重新打开计算机和工作站的电源。 |
| 5.1 和 6.2 | 工作站未对命令做出反应 | 连接问题 | 检查计算机是否正在识别 USB 连接，以及 USB 端口是否定义正确。确保防火墙不会阻止连接过程（请参阅下面的表 2 下的链接）。 |
| 5.1 和 6.2 | 无法打开文件 | 目录错误 | 检查控制器（文件夹路径）以确保使用了正确的路径。如果找不到文件（例如，interface.py），则可能是使用了错误的路径。 |
| 6.6.2 | 吸头未正确连接或在移动过程中掉落 | 校准问题 | 重复移液器的校准步骤，并确保毛细管活塞与移液器正确连接。 |
| 6.6.2 | 吸头未正确连接或在移动过程中掉落 | 附件问题 | 移液器未正确连接到移液器轴，并且在移动步骤中移动。拧紧螺钉以防止这种情况。 |
| 6.6.2 | 尖端吸气高于材料 | 校准问题 | 重复校准此托盘类型以正确定义高度。 |
| 6.6.2 | 尖端吸气高于材料 | 校准问题 | 检查管中的体积，并确保体积等于协议设计器应用程序中定义的体积。 |
| 6.6.2 | 物料在移动过程中浸渍 | 吸头上多余的材料过多 | 添加提示触摸底座选项;（可选）也可以增加吸头触摸的时间。 |
| 6.6.2 | 材料固体或太粘稠，无法移液 | 材料的热响应行为 | 检查热响应材料特性，并相应地调整温度码头的加热/冷却温度。 |
| https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting | |||
表2：疑难解答表，其中包含已识别的问题，可能的原因以及解决问题的解决方案。
补充文件。 请点击此处下载此文件。
Discussion
粘性材料的移液，特别是用于生物医学应用的水凝胶19，20，21，33，47，是许多研究实验室的常规任务，以制备用户定义的浓度或具有不同浓度的稀释系列。虽然它是重复的，并且执行相当简单，但它主要是手动执行的，样品通量较低18。本教程介绍了专为粘性材料设计的开源工作站的操作，以实现粘性材料的自动混合，从而可重复地生成所需浓度。该工作站针对水凝胶的移液进行了优化，通过集成用于热响应材料的温度底座，用于粘性材料的正置换移移液器以及可选的吸头触摸底座（用于从吸头中去除多余的材料），实现自动化和高度可靠的处理。移液模块经过专门优化，能够以标准化和自动化的方式处理粘性材料。与气垫移液器（图5a）相比，容积式移液器（图5b）分配粘性材料而不会留下残留在吸头中的残留材料，从而产生精确的吸气和分配量。可选的吸头触摸底座可去除吸头中多余的样品材料（图 5c，d），这对于胶合材料（例如，4% （w/v） 海藻酸盐）非常有用。
方案设计器应用程序专门针对水凝胶进行了编程，允许稀释多达四种不同浓度的试剂和多达两种稀释剂。在此应用中，由于用户仅选择所需的浓度或连续稀释步骤，因此可以防止最终稀释度计算中出现错误的风险。自动计算所需的吸气量和分配量，保存在单独的文档文本文件中，然后填写到协议脚本中。该协议设计应用程序使用户能够完全控制所有实验参数（例如，移液速度），并确保重要参数的内部文档记录。协议设计应用程序考虑了储液槽的填充水平（例如，良好），并改变吸气/分配高度，以防止不必要的浸入粘性材料中。这种集成功能可避免材料堆积在尖端外壁上，从而确保在整个实验方案中执行可靠的吸气和点胶任务。虽然方案设计器应用程序已经开发用于水凝胶稀释步骤，但它也可用于稀释非粘性液体，如Orange G染料。协议设计器应用程序可通过"/examples/publication-JoVE"下的存储库访问，是协议部分所述并在视频中突出显示的版本。此版本将不会更新。但是，协议设计器应用程序的更新版本可通过主存储库页面获得。该校准终端最初由Sanderson48开发，并已针对正置换移液器的校准进行了优化。
如协议第4节所述，移液器和容器必须首先进行校准。该校准过程对于定义和保存位置至关重要，然后使用这些位置来计算运动增量。因此，成功的协议执行依赖于明确定义的校准位置，因为错误的校准点可能导致尖端撞入容器。由于移液器的柱塞位置必须手动校准，因此移液的准确度和精度在很大程度上取决于所执行的校准。这些校准程序在很大程度上取决于用户对移液模块的体验，因此，建议在开始时与经验丰富的工作人员进行培训，以确保正确的校准程序。除了在移液模块上进行手动校准外，还必须对移液器本身进行校准，以确保准确的移液。建议至少每12个月校准一次移液器，以符合ISO 8655中规定的验收标准。为了在内部评估移液器校准，可以按照Stangegaard等人16的描述进行验证和确认。
为了生成可靠的数据集，从高质量的试剂开始至关重要。这对于水凝胶处理任务尤其重要，因为批次之间的差异可能会影响该协议中生成的结果。除了批次之间的差异外，小体积制备中的细微变化也可能导致属性差异。为了防止这种情况，建议准备更大体积，可用于整个实验。
验证和确认程序依赖于染料的使用来识别可靠的混合物。所提出的方案描述了Orange G的应用，但一般方案和分析工作流程也可以适应荧光染料49，50。Orange G的使用降低了分光光度计的技术要求，并消除了为防止荧光染料在暴露在光线下后漂白而采取的预防措施。在实验过程中，在所呈现的材料中未观察到染料的溶解行为或簇形成的问题，但在其他材料中可能会出现。潜在的团簇形成，因此，染料与材料之间的相互作用可以很容易地用显微镜检测到。
本教程中介绍的程序和技术为粘性材料的当前工作流程增加了自动化功能，以最少的人力实现高度可靠的任务。提供的故障排除表（表 2）包括已识别的问题，并提供了可能的原因以及解决问题的解决方案。所提出的工作站已成功应用于天然（明胶，结冷胶，基质胶）和合成（例如，聚乙二醇][PEG]，Pluronic F127，Lutrol F127）聚合物材料，用于自动移液任务。特别是，开源工作站和专为粘性材料设计的开源协议设计应用程序的结合对于在生物医学工程，材料科学和微生物学领域工作的研究人员将非常有用。
Disclosures
CM和DWH是Gelomics Pty Ltd的创始人和股东，CM也是Gelomics Pty Ltd.的董事。作者声明没有与本文主题相关的利益冲突。除披露的内容外，作者与与本文讨论的主题或材料有经济利益或财务冲突的任何组织或实体没有其他相关从属关系或财务参与。
Acknowledgments
作者感谢昆士兰科技大学再生医学中心的成员，特别是Antonia Horst和Pawel Mieszczanek的有用建议和反馈。这项工作得到了QUT的SE研究生研究奖和澳大利亚研究委员会（ARC）根据赠款协议IC160100026（ARC添加剂生物制造工业转型培训中心）的支持。NB得到了国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）Peter Doherty早期职业研究奖学金（APP1091734）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-959-53A | |
| 5 mL tubes | Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) | SCT-5ML | size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name |
| 50 mL reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-432-22 | |
| 70% w/w Ethanol | LabChem, Inc. (USA) | aja726-5Lpl | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055 | |
| Alginate | NovaMatrix | 4200001 | https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/ |
| Demineralized or ultrapure (MilliQ) water | |||
| Gelatin methacryloyl (GelMA) | Synthetized in-house | detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich, Inc. (USA) | 900889 | |
| M4 and M5 Allen key | OpenBuilds, inc. (USA) | 179, 190 | also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/ |
| OrangeG | Fisher Scientific (USA) | O267-25 | https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14190-144 | alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific) |
| Equipment | |||
| Aluminium blocks for temperature dock | Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) | SB16 | blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html |
| Analytical balance | Sartorius AG (Germany) | ED224S | |
| Open source liquid handling robot: commercial product | Opentrons Laboratories, Inc. (USA) | OT-One S Pro | https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro |
| Open source liquid handling robot: open source hardware | Assembled in-house following an open source approach | hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24 | |
| Positive displacement pipette: MicromanE | Gilson, Inc. (USA) | FD10006 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html |
| Spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH (Germany) | CLARIOstar | |
| Tips: capillary pistons | Gilson, Inc. (USA) | F148180 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191 |
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