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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Una plataforma tecnológica de código abierto para fabricar modelos de cultivo 3D basados en hidrogel de manera automatizada y estandarizada

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/61261
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1,3,4,5, 1,2, 1,2,3,4,6
1Centre in Regenerative Medicine, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 2School of Mechanical, Medical and Process Engineering, Science and Engineering Faculty, Queensland University of Technology, 3School of Biomedical Sciences, Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Australian Prostate Cancer Research Centre, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 5Translational Research Institute, Queensland University of Technology, 6ARC ITTC in Additive Biomanufacturing, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology

Summary

Este protocolo sirve como un tutorial completo para la mezcla estandarizada y reproducible de materiales viscosos con una novedosa tecnología de automatización de código abierto. Se proporcionan instrucciones detalladas sobre el funcionamiento de una estación de trabajo de código abierto recientemente desarrollada, el uso de un diseñador de protocolos de código abierto y la validación y verificación para identificar mezclas reproducibles.

Abstract

Los pasos de mezcla actuales de materiales viscosos se basan en tareas repetitivas y lentas que se realizan principalmente manualmente en un modo de bajo rendimiento. Estos problemas representan inconvenientes en los flujos de trabajo que, en última instancia, pueden resultar en la irreproducibilidad de los hallazgos de la investigación. Los flujos de trabajo manuales están limitando aún más el avance y la adopción generalizada de materiales viscosos, como los hidrogeles utilizados para aplicaciones biomédicas. Estos desafíos se pueden superar mediante el uso de flujos de trabajo automatizados con procesos de mezcla estandarizados para aumentar la reproducibilidad. En este estudio, presentamos instrucciones paso a paso para usar un diseñador de protocolos de código abierto, para operar una estación de trabajo de código abierto e identificar mezclas reproducibles. Específicamente, el diseñador de protocolos de código abierto guía al usuario a través de la selección de parámetros experimentales y genera un código de protocolo listo para usar para operar la estación de trabajo. Esta estación de trabajo está optimizada para pipetear materiales viscosos para permitir un manejo automatizado y altamente confiable mediante la integración de muelles de temperatura para materiales termosensibles, pipetas de desplazamiento positivo para materiales viscosos y un muelle táctil de punta opcional para eliminar el exceso de material de la punta de la pipeta. La validación y verificación de mezclas se realiza mediante una medición de absorbancia rápida y económica de Orange G. Este protocolo presenta resultados para obtener mezclas de glicerol al 80% (v/v), una serie de dilución para gelatina metacriloil (GelMA), e hidrogeles de doble red de 5% (p/v) gelMA y 2% (p/v) de alginato. Se incluye una guía de solución de problemas para ayudar a los usuarios con la adopción de protocolos. El flujo de trabajo descrito se puede aplicar ampliamente a una serie de materiales viscosos para generar concentraciones definidas por el usuario de manera automatizada.

Introduction

La reproducibilidad y la replicabilidad son de suma importancia en el trabajo científico1,2,3,4. Sin embargo, la evidencia reciente ha puesto de relieve importantes desafíos en la repetición de estudios biomédicos de alto impacto en ciencias fundamentales, así como en la investigación traslacional4,5,6,7. Los factores que contribuyen a resultados irreproducibles son complejos y múltiples, como un diseño de estudio deficiente o sesgado6,8, un poder estadístico insuficiente3,9, la falta de cumplimiento de las normas de información7,10,11, la presión para publicar6 o los métodos o códigos de software no disponibles6,9 . Entre ellos, los cambios sutiles en el protocolo y los errores humanos en la ejecución de los experimentos se han identificado como elementos adicionales que explican la irreproducibilidad4. Por ejemplo, las tareas de pipeteo manual introducen imprecisión intra e interindividual12,13 y aumentan la probabilidad de errores humanos14. Si bien los robots comerciales de manejo de líquidos pueden superar estos inconvenientes y han demostrado una mayor confiabilidad para líquidos15,16,17, el manejo automatizado de materiales con propiedades viscosas significativas sigue siendo un desafío.

Los robots comerciales de manejo de líquidos comúnmente usan pipetas de cojín de aire, también conocidas como pipetas de pistón de aire o de desplazamiento de aire. El reactivo y el pistón están separados por un cojín de aire que se encoge durante los pasos de dispensación y se expande durante los pasos de aspiración. Usando pipetas de cojín de aire, los materiales viscosos "fluyen" solo lentamente dentro y fuera de la punta, y la retirada temprana de la pipeta del depósito puede resultar en la aspiración de burbujas de aire. Durante las tareas de dispensación, el material viscoso deja una película en la pared de la punta interior que "fluye" lentamente o no fluye en absoluto cuando es forzado por el aire. Para superar estos problemas, se introdujeron comercialmente pipetas de desplazamiento positivo para extruir activamente el material viscoso de la punta utilizando un pistón sólido. Aunque estas pipetas de desplazamiento positivo permiten un manejo preciso y confiable de materiales viscosos, las soluciones automatizadas con pipetas de desplazamiento positivo siguen siendo demasiado costosas para entornos de laboratorio académicos y, por lo tanto, la mayoría de los flujos de trabajo con materiales viscosos se basan únicamente en tareas de pipeteo manual18.

En general, la viscosidad se define como la resistencia de un fluido al flujo, y los materiales viscosos se definen además como materiales con una mayor viscosidad del agua (0,89 mPa·s a 25 °C). En el campo de las aplicaciones biomédicas, las configuraciones experimentales a menudo contienen múltiples materiales con una mayor viscosidad que el agua, como el dimetilsulfóxido (DMSO; 1,99 mPa·s a 25 °C), glicerol (208,1 mPa·s a 25 °C para el 90% de glicerol [v/v]), Tritón X-100 (240 mPa·s a 25 °C) y polímeros hinchados por agua, denominados hidrogeles19, 20. Los hidrogeles son redes de polímeros hidrófilos dispuestas en un modo físico y/o químico utilizado para diversas aplicaciones, incluyendo encapsulación celular, administración de fármacos y actuadores blandos19,20,21,22. La viscosidad de los hidrogeles depende de la concentración del polímero y del peso molecular19. Los hidrogeles utilizados habitualmente para aplicaciones biomédicas presentan valores de viscosidad entre 1 y 1000 mPa·s, mientras que se han reportado sistemas de hidrogel específicos con valores de hasta 6 x 107 mPa·s19,23,24. Sin embargo, las mediciones de viscosidad de los hidrogeles no están estandarizadas en términos de protocolo de medición y preparación de la muestra, y, por lo tanto, los valores de viscosidad entre diferentes estudios son difíciles de comparar.

Dado que las soluciones automatizadas disponibles en el mercado diseñadas específicamente para hidrogeles faltan o son demasiado caras, los flujos de trabajo actuales para el hidrogel dependen de la manipulación manual18. Para comprender las limitaciones del flujo de trabajo manual actual para el pipeteo de hidrogeles, es importante comprender las tareas de manipulación esenciales18. Por ejemplo, una vez que se ha sintetizado un nuevo material de hidrogel, se genera una concentración deseada o una serie de dilución con concentraciones variables para identificar protocolos de síntesis confiables y características de reticulación con el análisis posterior de las propiedades mecánicas25,26,27,28 . En general, se prepara o compra una solución madre, y posteriormente se mezcla con un diluyente y / u otros reactivos para obtener una mezcla. Las tareas de mezcla en su mayoría no se realizan directamente en una placa de pozo (o cualquier formato de salida), y se realizan en un tubo de reacción separado, que comúnmente se conoce como mezcla maestra. Durante estas tareas de preparación, se requieren varios pasos de aspiración y dispensación para transferir el material (s) viscoso (s), mezclar los reactivos y transferir la mezcla a un formato de salida (por ejemplo, una placa de 96 pocillos). Estas tareas requieren una gran cantidad de trabajo humano18, largas horas experimentales y aumentan la probabilidad de errores humanos que podrían manifestarse como resultados inexactos. Además, el manejo manual impide la preparación eficiente de números de muestra altos para filtrar varias combinaciones de parámetros para una caracterización detallada. El procesamiento manual también impide el uso de hidrogeles para aplicaciones de cribado de alto rendimiento, como la identificación de compuestos prometedores durante el desarrollo de fármacos. Los pasos actuales de preparación manual no son factibles para examinar las bibliotecas de medicamentos que consisten en miles de medicamentos. Por estas razones, se requieren soluciones automatizadas para proporcionar un proceso de desarrollo eficiente y permitir la traducción exitosa de hidrogeles para aplicaciones de detección de drogas.

Para pasar de los flujos de trabajo manuales a los procesos automatizados, hemos optimizado un robot de pipeteo comercial de código abierto para el manejo de materiales viscosos mediante la integración de muelles de temperatura para materiales termosensibles, el uso de pipetas de desplazamiento positivo listas para usar utilizando puntas de pistón capilar y una base táctil de punta opcional para la limpieza de la punta de la pipeta. Este robot pipeteador se ha integrado aún más como un módulo de pipeteo en una estación de trabajo de código abierto recientemente desarrollada, que consta de módulos listos para instalar y personalizables18,29. Las instrucciones de montaje detalladas para la estación de trabajo desarrollada, incluidos los archivos de hardware y software, son de libre acceso desde GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) y el repositorio de Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Además del desarrollo de hardware, se ha programado y lanzado una aplicación de diseño de protocolo de código abierto para guiar al usuario a través del proceso de selección de parámetros y generar un código de protocolo listo para usar (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Este código se ejecuta en el robot de pipeteo de código abierto comercial, así como en la estación de trabajo de código abierto desarrollada.

Aquí, se proporciona un tutorial completo sobre el funcionamiento de la estación de trabajo de código abierto para automatizar las tareas de mezcla de materiales viscosos (Figura 1). Los pasos del protocolo específico del tutorial se pueden llevar a cabo con la estación de trabajo de código abierto desarrollada, así como con el robot de pipeteo comercial de código abierto. Con el apoyo de una aplicación de diseño de protocolo de código abierto desarrollada internamente, se demuestra la mezcla automatizada y la preparación de las concentraciones requeridas para glicerol, gelatina metacriloil (GelMA) y alginato. El glicerol ha sido seleccionado en este tutorial, ya que está bien caracterizado30,31, es barato y fácilmente disponible, y, por lo tanto, se utiliza comúnmente como material de referencia viscoso para tareas de pipeteo automatizado. Como ejemplos de hidrogeles utilizados en aplicaciones biomédicas, se han aplicado soluciones precursoras de hidrogel GelMA y alginato para experimentos de mezcla automatizados. GelMA presenta uno de los hidrogeles más utilizados para estudios de encapsulación celular32,33, y el alginato fue seleccionado en este estudio para demostrar la capacidad de fabricar hidrogeles de doble red34,35. Utilizando Orange G como colorante, se implementó un procedimiento rápido y económico para validar y verificar los resultados de la mezcla con un espectrofotómetro16.

Un robot de pipeteo de código abierto comercial se ha integrado como un módulo de pipeteo en la estación de trabajo de código abierto desarrollada (Figura 2a), y por lo tanto, el nombre 'módulo de pipeteo' se utiliza además para describir el robot de pipeteo. Una descripción detallada del hardware instalado está más allá del alcance de este protocolo y está disponible a través de los repositorios proporcionados que también incluyen instrucciones paso a paso para el ensamblaje general de la plataforma de código abierto. El módulo de pipeteo puede equiparse con dos pipetas (pipeta de uno u 8 canales) que se instalan en el eje A (derecha) y el eje B (izquierda) (Figura 2b). El módulo de pipeteo ofrece una capacidad de 10 cubiertas de acuerdo con los estándares del American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS), y las siguientes posiciones de ubicación se definen en la cubierta: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (Figura 2c). Para iniciar la polimerización fotoinducida de soluciones de hidrogel, se requiere un módulo de reticulación separado y se ha agregado a la estación de trabajo. El módulo de reticulación está equipado con LEDs con una longitud de onda de 400 nm y, por lo tanto, las sustancias que excitan a una longitud de onda de luz visible se pueden utilizar con los sistemas actuales, como el trimetilbenzoilfosfinato de litio 2,4,6 (LAP)36,37. La intensidad (en mW/cm2) de los LEDs puede ser abordada por el usuario en la aplicación de diseño de protocolo para estudiar el comportamiento de reticulación38. La estación de trabajo incluye también un módulo de almacenamiento para permitir un mayor rendimiento de los estudios; sin embargo, este módulo no se utiliza dentro de este estudio y, por lo tanto, no se describe más a fondo. En general, se recomienda operar el módulo de pipeteo en un gabinete de seguridad biológica para evitar la contaminación de la muestra. El circuito de alimentación principal para operar el módulo de pipeteo es un circuito de 12 V, que se considera una aplicación de bajo voltaje en la mayoría de los países. Todos los componentes eléctricos se basan en una caja de control dedicada que evita que los usuarios entren en contacto con la fuente de un peligro eléctrico.

Al seguir estos protocolos de mezcla estandarizados, los investigadores pueden lograr mezclas confiables para materiales viscosos y no viscosos de manera automatizada. El enfoque de código abierto permite a los usuarios optimizar las secuencias de mezcla y compartir protocolos recientemente desarrollados con la comunidad. En última instancia, este enfoque facilitará la detección de múltiples combinaciones de parámetros para investigar las interdependencias entre diferentes factores y, por lo tanto, acelerar la aplicación confiable y el desarrollo de materiales viscosos para aplicaciones biomédicas.

Protocol

NOTA: El protocolo comienza con una introducción a (1) el software y (2) la configuración de hardware para familiarizar al usuario con las instalaciones requeridas y la estación de trabajo. Después de una sección sobre (3) la preparación del material y (4) el uso de la aplicación del diseñador de protocolos, (5) se destaca en detalle la calibración del módulo de pipeteo y (6) la ejecución del protocolo automatizado. Por último, (7) se describen los procedimientos de validación y verificación, incluida la lectura de absorbancia y el análisis de datos. En la figura 1 se muestra un flujo de trabajo de protocolo general con tareas individuales.

1. Configuración del software

NOTA: Esta sección incluye una instrucción detallada para instalar la interfaz de programación de aplicaciones (API), así como la aplicación de diseñador de protocolos requerida y el terminal de calibración. Las siguientes instrucciones están escritas para una computadora de placa única Raspberry Pi (RPi); sin embargo, también Windows 8, 10 y macOS 10.13+ se han utilizado con éxito con la API y las aplicaciones.

  1. Configure el entorno informático.
    NOTA: Familiarícese con los conceptos básicos de Python39, cómo configurar y usar una Raspberry Pi40,41 y cómo conectarse a Internet42. Los siguientes pasos del tutorial se centran en los pasos específicos del protocolo y la información adicional sobre el uso de una Raspberry Pi está disponible en línea40.
    1. Abra una ventana de terminal desde la barra de tareas o el menú de la aplicación.
    2. Actualice la lista de paquetes del sistema:
      sudo apt-get update
    3. Actualice todos los paquetes instalados:
      sudo apt-get dist-upgrade
    4. Reinicie la Raspberry Pi:
      reinicio de sudo
    5. Compruebe la versión de Python instalada:
      python3 --versión
      Asegúrese de que al menos Python 3.5 esté instalado; de lo contrario, instale la versión más reciente43.
    6. Instale python pip, que publica paquetes de Python con Python Package Index44:
      sudo apt-get install python3-pip
    7. Instalar dependencias:
      pip instalar numpy
      pip install python-resize-image
      NOTA: Si está utilizando Windows, debe instalar el paquete windows-curses a través de: python -m pip install windows-curses
  2. Instale la interfaz de programación de aplicaciones (API).
    NOTA: La API proporciona un marco python simple diseñado para escribir scripts de protocolos experimentales y operar la estación de trabajo. Las dos API siguientes son necesarias para ejecutar correctamente el código de protocolo generado.
    1. Instalar la API de la estación de trabajo:
      pip instalar estación caladura
    2. Instale la API de Opentrons para operar el módulo de pipeteo:
      pip instalar opentrons==2.5.2
    3. Compruebe si la API se ha instalado correctamente:
      python3
      >>> importar openworkstation
      >>> importar opentrons
      NOTA: El tamaño de la API y la aplicación de diseño de protocolo es de 2,2 MB y 1,2 MB, respectivamente. No se experimentaron problemas durante la instalación cuando se utilizó con espacio en disco limitado (200 MB). Sin embargo, los requisitos de espacio en disco dependen del sistema operativo.
  3. Seleccione un directorio para la descarga de archivos (terminal de calibración, aplicación de diseño de protocolo, etc.).
    NOTA: Los archivos se pueden copiar y pegar en otro lugar después.
  4. Clonar archivos desde el repositorio de GitHub:
    https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation de clonación de git
    NOTA: El comando 'git clone' clona y posteriormente guarda todos los archivos en el directorio, que está abierto en el terminal en este momento. Dado que el repositorio también incluye los archivos de hardware para el ensamblado, no se requiere todo el repositorio para ejecutar los protocolos presentados. Todos los archivos necesarios para replicar los experimentos están disponibles como Archivo suplementario y en el repositorio de GitHub en "/examples/publication-JoVE".
  5. Abra la carpeta descargada. Si se descargó todo el repositorio, navegue a la carpeta 'publication-JoVE' a través de
    cd openworkstation/examples/publication-JoVE
    Nota : esta carpeta incluye los archivos necesarios para el funcionamiento de la estación de trabajo y el uso de la aplicación de diseñador de protocolos y el terminal de calibración.

2. Configuración de hardware

  1. Coloque la estación de trabajo en un gabinete de seguridad biológica para evitar la contaminación de la muestra.
  2. Instale pipetas en la estación de trabajo.
    1. Seleccione el tamaño de la pipeta en función de la configuración experimental. En general, tome un tamaño de pipeta cuyo volumen a aspirar está en el extremo superior del rango. Si se requieren tareas de mezcla con volúmenes superiores a 1 ml para una configuración específica (por ejemplo, aspiración/dispensación de 2 ml), elija el M1000E con un volumen máximo de aspiración/dispensación de 1.000 μL para minimizar los pasos de pipeteo y ahorrar tiempo.
      NOTA: Una instrucción detallada para pipetas de desplazamiento de aire está disponible en línea45. El módulo de pipeteo desarrollado es capaz de integrar las siguientes pipetas de desplazamiento positivo listas para usar: M10E (1–10 μL), M25E (3–25 μL), M50E (20–50 μL), M100E (10–100 μL), M250E (50–250 μL), M1000E (100–1,000 μL).
    2. Use una llave Allen M4 para aflojar y apretar los tornillos.
    3. Fije las dos placas de fijación de pipeta (placas de acrílico blanco) al riel de aluminio y apriete los tornillos M5 libremente.
    4. Inserte la pipeta en las dos placas de fijación de la pipeta y asegúrese de que la cola ergonómica de la pipeta descanse en el lado opuesto de la placa de montaje acrílica.
    5. Apriete firmemente los cuatro tornillos de las dos placas de fijación de pipetas.
    6. Deslice las dos tuercas de sujeción cuadradas, que están unidas a la placa de montaje acrílica, en la ranura de extrusión del eje Z y apriete los tornillos.
      NOTA: Sujete bien la pipeta para evitar cualquier movimiento durante la operación.

3. Preparación del material

NOTA: Los materiales viscosos (glicerol, GelMA, alginato) se utilizan para los experimentos presentados en este estudio y, por lo tanto, los volúmenes preparados y las tareas de manipulación (por ejemplo, agregar 5 ml de solución madre en tubos de reacción de 5 ml) son específicamente para esta configuración experimental.

  1. Gelatina metacriloil (GelMA)
    NOTA: La funcionalización, diálisis y liofilización de GelMA no son el alcance de este trabajo, y un protocolo paso a paso está disponible en Loessner et al.33. El protocolo comienza a usar GelMA liofilizado, que se puede preparar internamente o comprar comercialmente.
    1. Calcule la masa requerida de GelMA (mGelMA) en función de la concentración final de stock deseada (cGelMA) y el volumen (VGelMA) utilizando la ecuación:
      mGelMA = cGelMA x VGelMA
      NOTA: VGelMA depende de la configuración experimental y se recomienda preparar un 20-30% de exceso de material. Los protocolos presentados comienzan con 5 ml de GelMA al 20% (p/v) como solución madre.
    2. Pesar la cantidad requerida de GelMA liofilizado, agregarlo en un tubo de reacción de 50 ml y agregar la cantidad requerida de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    3. Mezclar GelMA ya sea sumergiéndolo en el disolvente a 4 °C durante la noche o calentando a 60 °C durante 6 h en un baño de agua.
      NOTA: Las soluciones estériles de GelMA se pueden almacenar protegidas de la luz a 4 °C durante al menos seis meses.
    4. Llene 5 ml de GelMA en tubos de reacción de 5 ml.
  2. Fotoiniciador: Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP)
    NOTA: Evite la exposición adicional a la luz de la habitación, ya que LAP es sensible a la luz.
    1. Calcule la masa requerida de LAP (mLAP) en función de la concentración final de stock (cLAP) y el volumen requerido (VLAP) deseados utilizando la ecuación:
      mLAP = cLAP x VLAP
      NOTA: Se recomienda preparar una solución de stock al 3% (p/v).
    2. Pesar la cantidad requerida de LAP, agregarla en un tubo de reacción de 15 ml y agregar PBS.
    3. Envuelva el tubo en papel de aluminio para evitar la descomposición fotoinducida.
    4. Disuelva la LAP colocando el tubo de reacción en un baño de agua a 37 °C durante 2 h o hasta que se disuelva por completo.
    5. Llene 1 ml de solución madre lap en tubos de 5 ml.
  3. Alginato
    1. Calcule la cantidad requerida de alginato (malginato) en función de la concentración final deseada (calginato) y el volumen (Valginato) utilizando la ecuación:
      malginato = calginato x valginato
      NOTA: El valginato depende de la configuración experimental y se recomienda preparar un 20-30% de exceso de material. Los protocolos presentados comienzan con 5 ml de alginato al 4% (p/v) como solución madre.
    2. Pesar la masa requerida de alginato, agregarla en tubos de reacción de 50 ml y agregar PBS.
    3. Coloque la mezcla de alginato en un baño de agua a 37 °C durante 4 h.
      NOTA: El uso de un mezclador de vórtice acelerará el proceso de disolución, pero también generará burbujas de aire. El alginato disuelto se puede almacenar a 4 °C durante al menos seis meses.
    4. Llene 5 ml de alginato en tubos de reacción de 5 ml.
  4. Llene 5 ml de glicerol en tubos de reacción de 5 ml.
  5. Solución Orange G
    1. Prepare una solución madre de 10 mg/ml de Orange G en un tubo de reacción de 50 ml.
      NOTA: El volumen depende del número de experimentos. Dependiendo del tipo de diluyente, prepare la solución madre en agua ultrapura, PBS o un reactivo diluyente adecuado. En los experimentos presentados, se utilizó agua ultrapura para diluir glicerol y PBS para diluir GelMA y alginato. PBS se utilizó como diluyente para GelMA y alginato, y se puede preparar con tabletas o comprar en el mercado.
    2. Mezclar durante 10 s por vórtice.
    3. Envuelva el tubo en papel de aluminio para evitar la descomposición fotoinducida.
      NOTA: La solución madre se puede utilizar después de 24 h para garantizar la disolución adecuada de Orange G.
    4. Diluya la solución madre a una solución de trabajo de 1 mg/ml en un tubo de reacción de 50 ml.
    5. Transfiera la solución de trabajo a los matraces/tubos apropiados para la configuración experimental.
      NOTA: Para los experimentos presentados, la solución de trabajo se llenó en tubos de 5 ml. El caldo de Orange G y la solución de trabajo se pueden almacenar a 4 °C y utilizarse en un plazo de tres meses tras la preparación.
    6. Llene 5 ml de la solución de trabajo Orange G de 1 mg/ml en tubos de reacción de 5 ml.

4. Generar código de protocolo con la aplicación de diseño de protocolos

NOTA: Los parámetros especificados en los pasos 4.2 a 4.7 son los mismos para todos los experimentos realizados, excepto para la concentración de existencias del material y la concentración de salida final. Estos parámetros se resumen en la Tabla 1 y, a continuación, los parámetros se utilizan para preparar hidrogeles de doble red con 5% (p/v) gelMA, 2% (p/v) alginato, 0,15% (p/v) LAP y PBS como diluyente.

  1. Abra la aplicación de diseñador de protocolos ejecutando 'ProtocolDesignApp.html'.
    NOTA: La aplicación "ProtocolDesignApp.html" guía al usuario a través del proceso de selección de parámetros y genera automáticamente el protocolo listo para usar para operar la estación de trabajo. La interfaz de usuario se ejecuta en todos los navegadores de Internet de uso común (es decir, Chrome, Firefox, Safari, edge, Internet Explorer).
  2. Introduzca el nombre del protocolo (por ejemplo, hidrogeles de doble red) en la página de configuración.
  3. Haga clic en 'Continuar' para confirmar el nombre del protocolo y continúe con el siguiente paso.
  4. Defina la bandeja de entrada seleccionando 'Bloque calefactor 3x4' en el menú desplegable y los siguientes parámetros de entrada:
    1. Seleccione 'Gel 1' en el menú desplegable, ingrese el nombre 'GelMA', ingrese la concentración de existencias '20%', establezca 'Número de muestras' en '3' para llenar una columna. Haga clic en '+agregar' para guardar las entradas.
    2. Seleccione 'Gel 2' en el menú desplegable, ingrese el nombre: 'Alginato', ingrese la concentración de existencias '4%', establezca 'Número de muestras' en '3' para completar una columna. Haga clic en '+agregar' para guardar las entradas.
    3. Seleccione 'Fotoiniciador' en el menú desplegable, ingrese el nombre: 'LAP', ingrese la concentración de existencias '3%', establezca 'Número de muestras' en '3' para llenar una columna. Haga clic en '+agregar' para guardar las entradas.
    4. Seleccione 'Diluyente 1' en el menú desplegable, ingrese el nombre: 'PBS', establezca 'Número de muestras' en '3' para completar una columna. Haga clic en '+agregar' para guardar las entradas.
      NOTA: La visualización de la bandeja de entrada se actualiza automáticamente, una vez que se hace clic en '+agregar'. Si se añaden más entradas que la capacidad de la bandeja, se mostrará al usuario la advertencia 'Demasiadas muestras para esta bandeja'.
  5. Defina los parámetros de reticulación marcando 'Foto de reticulación' y escribiendo el tiempo en segundos, '30', y la intensidad W/m2 con '2'.
  6. Finalice la configuración de entrada haciendo clic en 'CONTINUAR'.
  7. Defina la configuración de la bandeja de salida seleccionando 'Placa de pozo 96' en el menú desplegable para el tipo de placa de pozo.
  8. Haga clic en 'Grupo1' para definir los resultados creando un grupo de muestras.
    1. Especifique la composición de salida introduciendo las concentraciones deseadas y el volumen de la muestra en los campos para cada entrada: GelMA = '5', Alginato = '2', LAP = '0.15', Volumen total = '60'.
    2. Casilla de verificación para aplicar el protocolo de mezcla avanzado.
  9. Especifique el número de muestras introduciendo el número de muestras en el campo «Número de muestras»: «96».
    NOTA: La visualización de la bandeja de muestra se actualiza automáticamente, una vez que se hace clic en '+agregar grupo'. Si se añaden más muestras que la capacidad de la bandeja, se mostrará al usuario la advertencia 'Demasiadas muestras para esta bandeja'.
  10. Finalice la configuración de salida haciendo clic en 'CONTINUAR'.
    1. Seleccione la posición de la bandeja en el diseño de la cubierta y prepare la plataforma en consecuencia:
    2. Marque la marca de verificación en el campo 'SLOT A1' y seleccione 'Empty_Cell' en el menú desplegable.
    3. Marque la marca de verificación en el campo 'SLOT A2' y seleccione 'Trash_Cell' en el menú desplegable.
    4. Marque la marca de verificación en el campo 'SLOT B1' y seleccione 'Tips_Cell_100 μL' en el menú desplegable.
    5. Marque la marca de verificación en el campo 'SLOT B2' y seleccione 'Tips_Cell_1000 μL' en el menú desplegable.
    6. Marque la marca de verificación en el campo 'SLOT C1' y seleccione 'Input_Cell' en el menú desplegable.
    7. Marque la marca de verificación en el campo 'SLOT C2' y seleccione 'Empty_Cell' en el menú desplegable.
    8. Marque la marca de verificación en el campo 'SLOT D1' y seleccione 'Mixing_Cell' en el menú desplegable.
    9. Marque la marca de verificación en el campo 'SLOT D2' y seleccione 'Output_Cell' en el menú desplegable.
    10. Defina el tipo y las características de la primera pipeta (M100E) marcando 'Pipeta izquierda', seleccionando 'Desplazamiento positivo de 10-100μL' en el menú desplegable y configurando la velocidad de aspiración = '600', la velocidad de dispensación = '800'.
    11. Defina el tipo y las características de la segunda pipeta (M1000E) marcando 'Pipeta derecha', seleccionando 'Desplazamiento positivo de 100-1000μL' en el menú desplegable y configurando la velocidad de aspiración = '800', la velocidad de dispensación = '1200'.
  11. Haga clic en 'GENERAR PROTOCOLO' para confirmar la configuración y generar el script de protocolo.
    NOTA: La aplicación de diseñador de protocolos desarrollada genera automáticamente una nueva carpeta cada vez que se genera un nuevo protocolo. Todos los archivos necesarios para este experimento y para operar la estación de trabajo se guardan en esta carpeta que lleva el nombre del protocolo. La carpeta se puede copiar en diferentes directorios sin causar problemas.
  12. No cierre la interfaz, ya que se utilizará para ejecutar el protocolo (consulte el paso 6.6.).

5. Calibración del módulo de pipeteo

NOTA: Los contenedores (por ejemplo, placas de pozos, estante de punta, basura) y pipetas (por ejemplo, M1000E) deben calibrarse inicialmente. Si se modifica/cambia un contenedor y/o una posición de pipeta, la nueva posición debe calibrarse.

  1. Navegue hasta la carpeta de protocolo y abra el terminal de calibración ejecutando el archivo 'calibrate.py' en un terminal windox (consulte el paso 1.1.1):
    phython.calibrate.py
    NOTA: La interfaz 'calibrate.py' guía al usuario a través de la calibración de la configuración de la cubierta y las pipetas. Asegúrese de que el archivo está en la misma carpeta que el archivo de protocolo y los archivos de módulo. Se genera automáticamente en el paso 4.10.
  2. Seleccione incrementos de movimiento para el movimiento plungerx,y,z con el teclado numérico (1−8): '1' para 0,1 mm, '2' para 0,5 mm, '3' para 1 mm, '4' para 5 mm, '5' para 10, '6' para 20 mm, '7' para 40 mm y '8' para 80 mm.
  3. Calibrar la pipeta.
    1. Presione el método abreviado de teclado P para seleccionar el tamaño de la pipeta.
    2. Presione el método abreviado de teclado V para ingresar al modo de calibración del émbolo.
      NOTA: Se recomienda comenzar con pequeños incrementos (2, 5 y 10 mm) para familiarizarse con el tamaño de incremento y la acción de movimiento del cabezal de pipeta.
    3. Calibre las siguientes posiciones del émbolo para una pipeta de desplazamiento positivo: T–Top = posición de reposo; B–Bottom = émbolo se empuja hasta que se encuentra la resistencia; P–Pick-up = el émbolo se empuja a una posición donde se puede unir una punta de pistón; E–Eyect = émbolo se empuja hasta que se expulsa una punta unida. Varía las posiciones del émbolo usando las flechas hacia arriba y hacia abajo en el teclado, y guarda la posición final usando S en el teclado.
    4. Salga del modo de calibración del émbolo de pipeta pulsando el método abreviado de teclado V.
  4. Calibre la posición del contenedor en relación con la punta de la pipeta.
    1. Presione el método abreviado de teclado P para seleccionar el tipo de pipeta. Asegúrese de que una punta esté conectada a la tubería seleccionada.
    2. Presione el método abreviado de teclado C para seleccionar el tipo de contenedor.
    3. Seleccione un incremento de movimiento apropiado y mueva la punta de la pipeta a las siguientes posiciones. Para las placas de pozo, calibre a la posición de pozo 'A1' en la parte inferior; Para el bastidor de punta, calibre a la posición 'A1'; Para la basura, elija una posición (definida como un punto) donde la punta se pueda expulsar a la basura.
    4. Presione el método abreviado de teclado S para guardar la posición.
    5. Repita los pasos 5.3.1−5.3.3 para todos los contenedores enumerados en 'C' para el tipo de pipeta seleccionado.
    6. Repita 5.3.1−5.3.5 para el segundo tipo de pipeta.
    7. Cierre el script de calibración.

6. Ejecución del protocolo con la estación de trabajo

NOTA: Los archivos de protocolo son accesibles a través del repositorio y también están disponibles como archivo complementario.

  1. Coloque el contenedor de basura, los bastidores de punta, la bandeja de entrada, la bandeja de mezcla y la salida en la cubierta (definido en el paso 4.3).
  2. Calibrar pipetas e instrumentos tal como se definen en la sección 5.
  3. Si es necesario, encienda la base de temperatura y seleccione la temperatura para la entrada y la bandeja de mezcla.
    NOTA: Los experimentos en este tutorial se llevaron a cabo sin control de temperatura y a 40 ° C para glicerol, y 37 ° C para GelMA y pipeteo de alginato.
  4. Coloque los tubos con reactivos de entrada en los bloques de aluminio en las bases de temperatura de acuerdo con la configuración seleccionada.
  5. Espere hasta que los reactivos de entrada hayan alcanzado la temperatura deseada.
    NOTA: Para garantizar una distribución adecuada de la temperatura, se recomienda un tiempo de incubación de 30 min para GelMA y alginato.
  6. Ejecute el archivo de protocolo haciendo clic en 'EJECUTAR PYTHON SCRIPT'
    Nota : el protocolo seleccionado ahora es ejecutado por la estación de trabajo. El video que lo acompaña destaca la mezcla automatizada de GelMA y la distribución de 60 μL en una placa de 96 pocillos.
  7. La ejecución se completa cuando se muestra 'Finalizado'.

7. Proceso de validación y verificación

  1. Retire la placa del pozo de la estación de trabajo y transporte la placa del pozo con las muestras a un espectrofotómetro.
  2. Lectura de absorbancia con un espectrofotómetro a 450 nm. Lea cada placa 2x para comparar resultados y garantizar resultados consistentes.
  3. Exporte y guarde lecturas de absorbancia.
  4. Análisis de datos.
    NOTA: Los datos experimentales se pueden procesar individualmente o copiar y pegar en la plantilla proporcionada para evaluar la media, la desviación estándar y el valor del coeficiente de varianza (CV) utilizando un software de hoja de cálculo.
    1. Abra el archivo complementario 'supplementary_template-analysis.xlsx", que también está disponible dentro del repositorio de GitHub en 'openworkstation/examples/publication-JoVE.
    2. Copie las lecturas de absorbancia en la hoja de "datos sin procesar", asegúrese de que todas las referencias de celdas estén correctamente definidas en todas las tablas y haga clic en la hoja de "análisis" para obtener información sobre los valores de promedio, desviación estándar y coeficiente de varianza (CV).
      NOTA: Dependiendo de la distribución de la muestra en una placa de pozo, los siguientes tipos de evaluación preestablecidos están disponibles con la plantilla: el tipo 'Uniforme' se usa cuando todas las muestras tienen la misma composición, el tipo 'Por filas' se usa cuando las muestras en diferentes filas tienen diferentes composiciones, el tipo 'Por columnas' se usa cuando las muestras en diferentes columnas tienen diferentes composiciones, y el tipo 'Personalizado' se utiliza cuando las posiciones de muestra son específicas del usuario.

Representative Results

Este tutorial presenta los resultados de los experimentos con glicerol (Figura 3) y GelMA con LAP y alginato (Figura 4).

Se investigó la generación de una solución de glicerol al 80% (v/v) sin control de temperatura (temperatura ambiente, 22 °C) y sin toque de punta (definido como configuración 1), con control de temperatura (40 °C) y sin toque de punta (configuración 2), o con control de temperatura (40 °C) y con punta táctil (configuración 3) (Figura 3a-i). Estos dos ajustes de temperatura se eligieron para evaluar la diferencia de manejo, ya que la viscosidad del glicerol está disminuyendo casi en un factor de 3 cuando se calienta de 22 °C (139,5 mPa·s) a 40 °C (46,6 mPa·s)30. Una solución madre de glicerol al 85% (v/v) se diluyó a una concentración final del 80% y se distribuyó uniformemente en una placa de 96 pocillos (n = 96 por configuración). El tiempo experimental, que incluye la dispensación de cada material en el tubo de mezcla, las respectivas tareas de mezcla y la distribución de la muestra en una placa de 96 pocillos, fue de 30 min 42 s. Para identificar diferencias entre las mezclas de dilución, se preparó agua ultrapura, como diluyente para el glicerol, con 1 mg/ml de naranja G. Las lecturas de absorbancia destacan que la integración del control de temperatura y el toque de la punta afecta significativamente a las mezclas (p < 0,0001). Además del análisis bidireccional de varianza (ANOVA) realizado, se calcularon los valores CV para evaluar la desviación estándar relativa. El coeficiente de variación describe un indicador estandarizado para identificar el grado de desviación en relación con la media y se expresa como un porcentaje. Si las medias muestrales no son particularmente el punto de interés, sino la variabilidad dentro de las mediciones, el coeficiente de variación proporciona información adicional para identificar mezclas reproducibles46. Dentro de este experimento con tres configuraciones diferentes, los valores de absorbancia mostraron valores CV decrecientes de 5.6%, 4.2%, a 2.0% para la configuración 1, configuración 2 y configuración 3, respectivamente, lo que demuestra la influencia significativa de la base de temperatura y la función táctil de punta en la producción de resultados confiables (Figura 3a-ii). El trazado de los valores de absorbancia de la muestra para la configuración 3 (número de muestra #1 a #96 en una placa de 96 pocillos) no produce valores crecientes o decrecientes a lo largo del experimento y, por lo tanto, no indica ninguna influencia de la posición de la muestra en los valores de absorbancia (Figura 3a-iii). La visualización de los datos de cada placa de pozo medida con mapas de calor proporciona información adicional para identificar heterogeneidades para una fila o columna específica, o valores de absorbancia variables a lo largo de las tareas de dispensación. Los mapas de calor visualizados para las tres configuraciones muestran heterogeneidades disminuidas en todas las placas de pozos desde la configuración 1 hasta la configuración 3 (Figura 3b). Finalmente, se evaluó la replicabilidad de la mezcla realizada dentro de ocho tiradas independientes (Figura 3c-i, ii), donde cada ejecución tomó 6 min 57 s. Las tiradas de mezcla simple mostraron valores cv bajos entre 1.1% y 2.6%, lo que indica tareas de mezcla y dispensación muy confiables para las ejecuciones individuales. Los valores de absorbancia de las ocho tiradas arrojaron un valor CV del 3,3% y demostraron la reproducibilidad del protocolo de mezcla establecido.

Las series de dilución de GelMA se prepararon diluyendo una solución madre al 20% (p/v) con PBS a 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 y 0% (p/v) y agregando LAP a una concentración constante de 0,15% (p/v) (Figura 4a-i), que tomó en total 55 min 12 s. Como se especifica en el script de protocolo experimental, el hidrogel se reticula durante 30 s con una intensidad de 2,0 mW/cm2 a 400 nm. Para evaluar las diferencias entre las mezclas, PBS, como diluyente para GelMA y alginato, se preparó con 1 mg / ml de naranja G. Por lo tanto, la diferencia de absorbancia entre las muestras dentro de una mezcla, así como entre las diluciones en serie, se identifican con un espectrofotómetro. Los valores de absorbancia medidos de cada paso de concentración son significativamente diferentes (p < 0,0001) y tienen valores CV muy bajos entre 1,2% y 3,4% a lo largo de los pasos de concentración (n = 12 por paso de concentración). La regresión lineal demostró un alto ajuste con un valor de R² de 0,9869 (Figura 4a-ii) y un mapa de calor confirmó la distribución homogénea para cada concentración y la diferencia entre las concentraciones (Figura 4a-iii). Se realizó la mezcla automatizada de cuatro reactivos para la generación de 5% (p/v) gelMA, 2% (p/v) de alginato, 0,15% (p/v) LAP y PBS como diluyente sin (configuración 2) y con (configuración 3) punta táctil (n = 96 para cada configuración) con los mismos parámetros de reticulación (30 s, 2,0 mW/cm2, 400 nm). La dispensación de los cuatro materiales, la mezcla y la distribución en una placa de 96 pozos tomó 32 min 22 s. Todos los experimentos con GelMA y alginato se realizaron a 37 °C para evitar la gelificación térmica que evita el pipeteo de GelMA. Con la opción de toque de punta, el valor CV se redujo del 5,2% al 3,4% y, especialmente, se evitaron los valores atípicos en la región inferior eliminando el exceso de material de la punta (Figura 4b-i). Aunque el valor medio de 1,927 y 1,944 para la configuración 2 y la configuración 3 están muy cerca, el coeficiente de variación destaca la desviación decreciente en relación con la media. Las filas individuales de la placa de 96 pocillos se pueden comparar entre sí utilizando una visualización de mapa de calor para detectar diferencias de fila y/o columna (Figura 4b-ii).

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo de protocolo con tareas individuales. El flujo de trabajo descrito se divide en siete tareas, que se separan en configuración, preparación, ejecución y análisis. Al principio, el software (tarea 1) así como el hardware (tarea 2) deben estar configurados. Después de la preparación de los materiales (tarea 3) y la generación del script de protocolo (tarea 4), el módulo de pipeteo se calibra definiendo las posiciones de la pipeta y el contenedor (tarea 5). A continuación, se ejecuta el script de protocolo en la estación de trabajo (tarea 6) y se lleva a cabo la validación y verificación (tarea 7) de mezclas para evaluar mezclas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Estación de trabajo de código abierto y configuración de cubierta del módulo de pipeteo. (a) La estación de trabajo desarrollada se inspira en un enfoque de línea de ensamblaje, donde las muestras se transportan a través de diferentes módulos, y consta de los siguientes módulos: pipeteo, reticulador, almacenamiento, transporte y módulo computacional. b) La cubierta del módulo de pipeteo se configura en función del diseño experimental (por ejemplo, tipo de placa de pozo, volumen de tubo, etc.). La configuración de la cubierta mostrada se utilizó para los experimentos presentados y consiste en pipetas de desplazamiento positivo con un rango de 10-100 μL (M100E) y 100-1,000 μL (M1000E), los bastidores de punta con pistones capilares (CP) para 100 μL (CP1000) y 1,000 μL (CP1000), un contenedor de basura, una bandeja de mezcla y una bandeja de entrada para los reactivos de entrada. (c) Las posiciones de cubierta disponibles se definen con los números mostrados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados para el pipeteo automatizado de mezclas de glicerol. a) El diseño flexible de la estación de trabajo permite la evaluación de tres configuraciones diferentes (i) para identificar parámetros óptimos para resultados reproducibles. ii) La adición de un toque de punta y el calentamiento del material dieron lugar a una disminución de los valores del coeficiente de varianza (CV) y a mezclas altamente reproducibles para el ajuste 3. Cada experimento se realizó con 96 muestras. iii) El trazado de valores de muestra única no influyó en la secuencia de pipeteo. (b) Los resultados experimentales de cada configuración se visualizaron con mapas de calor para identificar la influencia en las diferencias de crudo / columna, bordes o mezcla maestra. (c) La reproducibilidad de la configuración 3 se analizó dentro de ocho ejecuciones independientes utilizando (i) mediana, desviación estándar, valor CV y (ii) mapas de calor. Los datos en los paneles a-ii (n = 96) y b-i (n = 12) se presentan con las medias y los puntos de datos únicos. La significación estadística se definió como ****p < 0,0001 mediante el análisis bidireccional de varianza (ANOVA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados para la mezcla de tareas con hidrogeles. (a) A partir de una solución madre de metacriloilo de gelatina (GelMA) al 20% (p/v), se generó una dilución en serie de 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 y 0% (p/v) dentro de una tirada experimental utilizando una placa de 96 pocillos (n = 12 por concentración). (i) Los valores del coeficiente de varianza (CV) variaron entre 1,2% y 3,4% a lo largo de las concentraciones preparadas, y (ii) la regresión lineal mostró un ajuste alto con un valor R² de 0,9869. iii) Las diluciones homogéneas se confirmaron visualmente con el mapa de calor generado. (b) Se generaron hidrogeles de doble red con 5% (p/v) gelMA, 2% (p/v) de alginato y 0,15% (p/v) LAP (i) con y sin toque de punta (n = 96 para cada configuración) y reticulados durante 30 s con una intensidad de 2,0 mW/cm2 a 400 nm. La integración del toque de punta resultó en la disminución de los valores CV del 5,2% al 3,4%. (ii,iii) Los mapas de calor confirman menos desviaciones cuando se utiliza el toque de punta para eliminar el exceso de material de la punta. Los datos en los paneles a-i y b-i se presentan con las medias y los puntos de datos individuales. La significación estadística se definió como *p < 0,05, ***p < 0,001 y ****p < 0,0001 mediante análisis unidireccional de varianza (ANOVA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Resumen de la diferencia de tipo de pipeta y los problemas con los biomateriales viscosos. (a) El reactivo y el pistón están separados por un cojín de aire que se encoge durante los pasos de dispensación y se expande durante los pasos de aspiración. Al aspirar y dispensar materiales viscosos, el lento 'flujo' introduce problemas como burbujas de aire y comportamiento irregular del pipeteo. (b) Las pipetas de desplazamiento positivo permiten la aspiración y dispensación confiables de material viscoso mediante el uso de un pistón dentro de la punta. (c) El pipeteo de materiales altamente viscosos (por ejemplo, 4% (p/v) de alginato) puede resultar en la acumulación de exceso de material en la punta, lo que conduce a la inexactitud a lo largo de los experimentos. d) La colocación de una bandeja táctil de punta simple permite eliminar el exceso de material en la punta y da como resultado volúmenes precisos de aspiración y dispensación. Esto se realiza mediante el uso del lado interior de la tapa de la placa del pozo colocada en un recipiente de rejilla de punta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Material #1 (concentración de stock) Concentración final de material #1 Material #2 (concentración de stock) Concentración final de material #2 Materiales #3 (concentración de stock) Concentración final de material #3 Diluyente (solución de trabajo Orange G) Concentración final de Orange G en mezcla Se muestra en la figura
Glicerol (85% (p/v)) 80% (p/v) agua (1 mg/mL Naranja G) 0,059 mg/ml Figura 3a−c
GelMA (20% (p/v)) 0% (p/v) LAP (3% (p/v)) 0,15% (p/v) PBS (1 mg/ml de naranja G) 1 mg/ml Figura 4a
GelMA (20% (p/v)) 2% (p/v) LAP (3% (p/v)) 0,15% (p/v) PBS (1 mg/ml de naranja G) 0,85 mg/ml Figura 4a
GelMA (20% (p/v)) 4% (p/v) LAP (3% (p/v)) 0,15% (p/v) PBS (1 mg/ml de naranja G) 0,75 mg/ml Figura 4a
GelMA (20% (p/v)) 6% (p/v) LAP (3% (p/v)) 0,15% (p/v) PBS (1 mg/ml de naranja G) 0,65 mg/ml Figura 4a
GelMA (20% (p/v)) 8% (p/v) LAP (3% (p/v)) 0,15% (p/v) PBS (1 mg/ml de naranja G) 0,55 mg/ml Figura 4a
GelMA (20% (p/v)) 10% (p/v) LAP (3% (p/v)) 0,15% (p/v) PBS (1 mg/ml de naranja G) 0,45 mg/ml Figura 4a
GelMA (20% (p/v)) 12% (p/v) LAP (3% (p/v)) 0,15% (p/v) PBS (1 mg/ml de naranja G) 0,35 mg/ml Figura 4a
GelMA (20% (p/v)) 14% (p/v) LAP (3% (p/v)) 0,15% (p/v) PBS (1 mg/ml de naranja G) 0,25 mg/ml Figura 4a
GelMA (20% (p/v)) 5% (p/v) Alginato (4% (p/v)) 2% (p/v) LAP (3% (p/v)) 0,15% (p/v) PBS (1 mg/ml de naranja G) 0,2 mg/ml Figura 4b

Tabla 1: Descripción general de los parámetros para los experimentos realizados.

Paso de protocolo Problema Posible razón Solución
1.1 El software no se puede instalar ni actualizar Quedarse sin espacio en disco en la tarjeta SD Compruebe el espacio en disco en la tarjeta SD. Si es necesario, retire los elementos innecesarios, vacíe la papelera o use una tarjeta SD del tamaño adecuado
1.2 No se puede instalar la API La capacidad de instalación de los usuarios está restringida (sin permiso de usuario root) Utilice el comando 'sudo' delante de los comandos especificados para obtener derechos de administrador. En Linux, este tipo de acceso se conoce como el superusuario.
3.1 Problemas con GelMA Funcionalización, diálisis o liofilización Protocolo detallado paso a paso que incluye la lista de solución de problemas disponible en Loessner et al.33.
5.1 y 6.2 La estación de trabajo no reacciona a los comandos Problemas de conexión Gire todo y apague la computadora. Apague la fuente de alimentación durante 10 s. Vuelva a encender la computadora y la estación de trabajo.
5.1 y 6.2 La estación de trabajo no reacciona a los comandos Problemas de conexión Compruebe si el ordenador está reconociendo la conexión USB y el puerto USB está definido correctamente. Asegúrese de que el firewall no impide el proceso de conexión (consulte el enlace a continuación de la Tabla 2).
5.1 y 6.2 No se puede abrir el archivo Directorio incorrecto Compruebe el director (ruta de la carpeta) para asegurarse de que se está utilizando la ruta correcta. Si no se puede encontrar un archivo (por ejemplo, interface.py), es probable que se esté utilizando la ruta incorrecta.
6.6.2 La punta no está correctamente sujeta o se cae durante el movimiento Problema de calibración Repita los pasos de calibración para la pipeta y asegúrese de que el pistón capilar esté conectado correctamente con la pipeta.
6.6.2 La punta no está correctamente sujeta o se cae durante el movimiento Problema de datos adjuntos La pipeta no está conectada correctamente al eje de la pipeta y se mueve durante los pasos de movimiento. Apriete los tornillos firmemente para evitar esto.
6.6.2 La punta está aspirando por encima del material Problema de calibración Repita la calibración de este tipo de bandeja para definir la altura correctamente.
6.6.2 La punta está aspirando por encima del material Problema de calibración Compruebe el volumen en el tubo y asegúrese de que el volumen es igual al volumen definido en la aplicación del diseñador de protocolos.
6.6.2 El material se sumerge durante el movimiento Demasiado exceso de material en la punta Agregue la opción de base táctil de punta; opcionalmente, también se puede aumentar el tiempo para el toque de punta.
6.6.2 El material es sólido o demasiado viscoso para pipetear Comportamiento termosensible del material Verifique la caracterización del material termosensible y ajuste la temperatura de calentamiento / enfriamiento del muelle de temperatura en consecuencia.
https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting

Tabla 2: Tabla de solución de problemas con problemas identificados, posibles razones y soluciones para resolver los problemas.

Archivo complementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El pipeteo de materiales viscosos, especialmente hidrogeles para aplicaciones biomédicas19,20,21,33,47, son tareas rutinarias en muchos laboratorios de investigación para preparar una concentración definida por el usuario o una serie de dilución con concentraciones variables. Aunque es repetitivo y la ejecución es bastante simple, se realiza principalmente manualmente con bajo rendimiento de muestra18. Este tutorial presenta el funcionamiento de una estación de trabajo de código abierto, que ha sido diseñada específicamente para materiales viscosos, para permitir la mezcla automatizada de materiales viscosos para la generación reproducible de las concentraciones deseadas. Esta estación de trabajo está optimizada para pipetear hidrogeles para permitir un manejo automatizado y altamente confiable mediante la integración de muelles de temperatura para materiales termosensibles, pipetas de desplazamiento positivo para materiales viscosos y un muelle táctil de punta opcional para eliminar el exceso de material de la punta. El módulo de pipeteo se ha optimizado específicamente para permitir el procesamiento de material viscoso de manera estandarizada y automatizada. En comparación con las pipetas de cojín de aire (Figura 5a), las pipetas de desplazamiento positivo (Figura 5b) dispensan materiales viscosos sin dejar material residual en la punta, lo que resulta en volúmenes precisos de aspiración y dispensación. La base táctil de punta opcional elimina el exceso de material de muestra de la punta (Figura 5c, d), que es útil para materiales pegajosos (por ejemplo, 4% (p/v) de alginato).

La aplicación del diseñador de protocolos ha sido programada específicamente para hidrogeles y permite la dilución de hasta cuatro reactivos con diferentes concentraciones y hasta dos diluyentes. El riesgo de errores en el cálculo de las diluciones finales se evita en esta aplicación, ya que los usuarios solo eligen la concentración deseada o los pasos de dilución en serie. Los volúmenes de aspiración y dispensación requeridos se calculan automáticamente, se guardan en un archivo de texto de documentación independiente y, a continuación, se rellenan en el script de protocolo. Esta aplicación de diseño de protocolos proporciona al usuario un control total de todos los parámetros experimentales (por ejemplo, la velocidad de pipeteo) y garantiza la documentación interna de los parámetros importantes. La aplicación de diseño de protocolo tiene en cuenta el nivel de llenado del depósito (por ejemplo, pozo) y varía la altura de aspiración / dispensación para evitar la inmersión innecesaria en los materiales viscosos. Esta característica integrada evita la acumulación de material en la pared exterior de la punta y, por lo tanto, garantiza tareas de aspiración y dispensación confiables durante todo el protocolo. Aunque la aplicación de diseño de protocolos se ha desarrollado para los pasos de dilución de hidrogel, también se puede utilizar para la dilución de líquidos no visuales, como los colorantes Orange G. La aplicación de diseño de protocolos, a la que se puede acceder a través del repositorio en '/examples/publication-JoVE', es la versión que se explica en la sección de protocolo y se destaca en el vídeo. Esta versión no se actualizará. Sin embargo, una versión actualizada de la aplicación de diseño de protocolos está disponible a través de la página principal del repositorio. El terminal de calibración fue desarrollado inicialmente por Sanderson48 y ha sido optimizado para la calibración de pipetas de desplazamiento positivo.

Como se describe en la sección 4 del protocolo, las pipetas y los contenedores deben calibrarse inicialmente. Este proceso de calibración es crucial para definir y guardar las posiciones que luego se utilizan para calcular los incrementos de movimiento. Por lo tanto, la ejecución exitosa del protocolo se basa en posiciones de calibración bien definidas, ya que los puntos de calibración incorrectos podrían provocar el choque de la punta en un contenedor. Dado que las posiciones del émbolo de las pipetas deben calibrarse manualmente, la exactitud y precisión del pipeteo dependen en gran medida de la calibración realizada. Estos procedimientos de calibración dependen en gran medida de la experiencia del usuario con el módulo de pipeteo y, por lo tanto, se recomienda la capacitación con personal experimentado al principio para garantizar los procedimientos de calibración adecuados. Además de la calibración manual en el módulo de pipeteo, la pipeta en sí debe calibrarse para garantizar un pipeteo preciso. Se recomienda calibrar las pipetas al menos cada 12 meses para cumplir con los criterios de aceptación especificados en ISO 8655. Para evaluar internamente la calibración de la pipeta, la validación y la verificación están disponibles según lo descrito por Stangegaard et al.16.

Para la generación de un conjunto de datos confiable, es crucial comenzar con reactivos de alta calidad. Esto es especialmente importante para las tareas de procesamiento de hidrogel, ya que las variaciones de lote a lote pueden afectar los resultados generados dentro de este protocolo. Además de las variaciones de lote a lote, los cambios sutiles en la preparación de pequeños volúmenes también pueden contribuir a las diferencias de propiedad. Para evitar esto, se recomienda la preparación de volúmenes más grandes, que se pueden usar para todos los experimentos.

Los procedimientos de validación y verificación se basan en el uso de un tinte para identificar mezclas confiables. El protocolo presentado describe la aplicación de Orange G, pero el protocolo general y el flujo de trabajo de análisis también se pueden adaptar a colorantes fluorescentes49,50. El uso de Orange G reduce los requisitos técnicos del espectrofotómetro y elimina las precauciones tomadas para evitar el blanqueo de los colorantes fluorescentes después de la exposición a la luz. No se han observado problemas en el comportamiento de disolución o la formación de grupos del tinte con los materiales presentados durante los experimentos, pero pueden aparecer con otros materiales. La posible formación de grupos y, por lo tanto, la interacción entre el tinte y el material podría detectarse fácilmente con un microscopio.

Los procedimientos y técnicas presentados en este tutorial agregan capacidad de automatización a los flujos de trabajo actuales para materiales viscosos para lograr tareas altamente confiables con un mínimo de mano de obra humana. La tabla de solución de problemas proporcionada (Tabla 2) incluye los problemas identificados y presenta las posibles razones, así como las soluciones para resolver los problemas. La estación de trabajo presentada se ha aplicado con éxito a materiales poliméricos naturales (gelatina, goma gellan, matrigel) y sintéticos (por ejemplo, poli(etilenglicol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) para tareas de pipeteo automatizado. En particular, la combinación de una estación de trabajo de código abierto y una aplicación de diseño de protocolo de código abierto diseñada para materiales viscosos será muy útil para los investigadores que trabajan en los campos de la ingeniería biomédica, la ciencia de los materiales y la microbiología.

Disclosures

CM y DWH son fundadores y accionistas de Gelomics Pty Ltd. CM es también el Director de Gelomics Pty Ltd. Los autores declaran que no hay conflicto de intereses relevante para el tema de este artículo. Los autores no tienen otras afiliaciones relevantes o participación financiera con ninguna organización o entidad con un interés financiero o conflicto financiero con el tema o los materiales discutidos en el artículo, aparte de los divulgados.

Acknowledgments

Los autores reconocen a los miembros del Centro de Medicina Regenerativa de QUT, en particular, Antonia Horst y Pawel Mieszczanek por sus útiles sugerencias y comentarios. Este trabajo fue apoyado por el Premio de Investigación de Postgrado de QUT para SE, y por el Consejo Australiano de Investigación (ARC) bajo el acuerdo de subvención IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB fue apoyado por un Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 reaction tubes Fisher Scientific, Inc. (USA) 14-959-53A
5 mL tubes Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) SCT-5ML size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name
50 mL reaction tubes Fisher Scientific, Inc. (USA) 14-432-22
70% w/w Ethanol LabChem, Inc. (USA) aja726-5Lpl
96-well plate Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055
Alginate NovaMatrix 4200001 https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/
Demineralized or ultrapure (MilliQ) water
Gelatin methacryloyl (GelMA) Synthetized in-house detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma-Aldrich, Inc. (USA) 900889
M4 and M5 Allen key OpenBuilds, inc. (USA) 179, 190 also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/
OrangeG Fisher Scientific (USA) O267-25 https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) 14190-144 alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)
Equipment
Aluminium blocks for temperature dock Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) SB16 blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html
Analytical balance Sartorius AG (Germany) ED224S
Open source liquid handling robot: commercial product Opentrons Laboratories, Inc. (USA) OT-One S Pro https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro
Open source liquid handling robot: open source hardware Assembled in-house following an open source approach hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24
Positive displacement pipette: MicromanE Gilson, Inc. (USA) FD10006 depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html
Spectrophotometer BMG LABTECH GmbH (Germany) CLARIOstar
Tips: capillary pistons Gilson, Inc. (USA) F148180 depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191

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References

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Una plataforma tecnológica de código abierto para fabricar modelos de cultivo 3D basados en hidrogel de manera automatizada y estandarizada
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Eggert, S., Kahl, M., Kent, R., Gaats, L., Bock, N., Meinert, C., Hutmacher, D. W. An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion. J. Vis. Exp. (181), e61261, doi:10.3791/61261 (2022).

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