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Bioengineering

एक स्वचालित और मानकीकृत फैशन में हाइड्रोजेल-आधारित 3 डी संस्कृति मॉडल के निर्माण के लिए एक ओपन सोर्स टेक्नोलॉजी प्लेटफॉर्म

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/61261
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1,3,4,5, 1,2, 1,2,3,4,6
1Centre in Regenerative Medicine, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 2School of Mechanical, Medical and Process Engineering, Science and Engineering Faculty, Queensland University of Technology, 3School of Biomedical Sciences, Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Australian Prostate Cancer Research Centre, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 5Translational Research Institute, Queensland University of Technology, 6ARC ITTC in Additive Biomanufacturing, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology

Summary

यह प्रोटोकॉल एक उपन्यास ओपन सोर्स ऑटोमेशन तकनीक के साथ चिपचिपा सामग्री के मानकीकृत और पुन: प्रस्तुत करने योग्य मिश्रण के लिए एक व्यापक ट्यूटोरियल के रूप में कार्य करता है। एक नए विकसित ओपन सोर्स वर्कस्टेशन के संचालन, एक ओपन सोर्स प्रोटोकॉल डिज़ाइनर के उपयोग, और पुन: प्रस्तुत करने योग्य मिश्रण की पहचान करने के लिए सत्यापन और सत्यापन पर विस्तृत निर्देश प्रदान किए जाते हैं।

Abstract

चिपचिपा सामग्री के वर्तमान मिश्रण चरण दोहराए जाने वाले और समय लेने वाले कार्यों पर निर्भर करते हैं जो मुख्य रूप से कम थ्रूपुट मोड में मैन्युअल रूप से किए जाते हैं। ये मुद्दे वर्कफ़्लो में कमियों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो अंततः अनुसंधान निष्कर्षों की अपरिवर्तनीयता में परिणाम कर सकते हैं। मैनुअल-आधारित वर्कफ़्लो आगे जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले हाइड्रोजेल जैसे चिपचिपा सामग्री की प्रगति और व्यापक रूप से अपनाने को सीमित कर रहे हैं। पुनरुत्पादन बढ़ाने के लिए मानकीकृत मिश्रण प्रक्रियाओं के साथ स्वचालित वर्कफ़्लो का उपयोग करके इन चुनौतियों को दूर किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम एक ओपन सोर्स प्रोटोकॉल डिजाइनर का उपयोग करने, एक ओपन सोर्स वर्कस्टेशन संचालित करने और पुन: प्रस्तुत करने योग्य मिश्रण की पहचान करने के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रस्तुत करते हैं। विशेष रूप से, ओपन सोर्स प्रोटोकॉल डिज़ाइनर प्रयोगात्मक पैरामीटर चयन के माध्यम से उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करता है और कार्यस्थान को संचालित करने के लिए एक रेडी-टू-यूज प्रोटोकॉल कोड उत्पन्न करता है। इस workstation चिपचिपा सामग्री के pipetting के लिए अनुकूलित है स्वचालित और अत्यधिक विश्वसनीय thermoresponsive सामग्री के लिए तापमान डॉक के एकीकरण द्वारा हैंडलिंग सक्षम करने के लिए, चिपचिपा सामग्री के लिए सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स, और पिपेट टिप से अतिरिक्त सामग्री को हटाने के लिए एक वैकल्पिक टिप स्पर्श डॉक. मिश्रणों का सत्यापन और सत्यापन ऑरेंज जी के एक तेज और सस्ती अवशोषण माप द्वारा किया जाता है। यह प्रोटोकॉल 80% (v / v) ग्लिसरॉल मिश्रण, जिलेटिन मेथाक्रिलोयल (GelMA) के लिए एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला, और 5% (w / v) GelMA और 2% (w / v) एल्गिनेट के डबल नेटवर्क हाइड्रोजेल प्राप्त करने के लिए परिणाम प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल अपनाने वाले उपयोगकर्ताओं का समर्थन करने के लिए एक समस्या निवारण मार्गदर्शिका शामिल है. वर्णित वर्कफ़्लो को स्वचालित फैशन में उपयोगकर्ता-परिभाषित सांद्रता उत्पन्न करने के लिए कई चिपचिपा सामग्री पर मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

पुनरुत्पादन और replicability वैज्ञानिक कार्य में सर्वोपरि महत्व के हैं1,2,3,4. हालांकि, हाल के सबूतों ने मौलिक विज्ञान में उच्च प्रभाव वाले बायोमेडिकल अध्ययनों को दोहराने के साथ-साथ ट्रांसलेशनल शोध 4,5,6,7 को दोहराने में महत्वपूर्ण चुनौतियों पर प्रकाश डाला है। अपरिवर्तनीय परिणामों में योगदान करने वाले कारक जटिल और कई गुना हैं, जैसे कि खराब या पक्षपाती अध्ययन डिजाइन 6,8, अपर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति 3,9, रिपोर्टिंग मानकों के साथ लापता अनुपालन7,10,11, प्रकाशन के लिए दबाव6, या अनुपलब्ध तरीके या सॉफ़्टवेयर कोड6,9 . उनमें से, प्रोटोकॉल में सूक्ष्म परिवर्तन और प्रयोगों के निष्पादन में मानवीय त्रुटियों को आगे के तत्वों के रूप में पहचाना गया है जो अपरिवर्तनीयता के लिए लेखांकन करते हैं। उदाहरण के लिए, मैन्युअल पिपेटिंग कार्य इंट्रा- और इंटर-इंडिविजुअल imprecision12,13 का परिचय देते हैं और मानव त्रुटियों की संभावना को बढ़ाते हैं। जबकि वाणिज्यिक तरल हैंडलिंग रोबोट इन कमियों को दूर करने में सक्षम हैं और तरल पदार्थ 15,16,17 के लिए बढ़ी हुई विश्वसनीयता का प्रदर्शन किया है, महत्वपूर्ण चिपचिपा गुणों के साथ सामग्री की स्वचालित हैंडलिंग अभी भी चुनौतीपूर्ण है।

वाणिज्यिक तरल हैंडलिंग रोबोट आमतौर पर एयर कुशन पिपेट्स का उपयोग करते हैं, जिसे एयर पिस्टन या एयर विस्थापन पिपेट्स के रूप में भी जाना जाता है। अभिकर्मक और पिस्टन को एक एयर कुशन द्वारा अलग किया जाता है जो वितरण चरणों के दौरान सिकुड़ता है और एस्पिरेटिंग चरणों के दौरान फैलता है। एयर कुशन पिपेट्स का उपयोग करते हुए, चिपचिपा सामग्री 'प्रवाह' केवल धीरे-धीरे टिप के अंदर और बाहर, और जलाशय से पिपेट की शुरुआती वापसी के परिणामस्वरूप हवा के बुलबुले की आकांक्षा हो सकती है। वितरण कार्यों के दौरान, चिपचिपा सामग्री आंतरिक टिप की दीवार पर एक फिल्म छोड़ देती है जो हवा द्वारा मजबूर होने पर केवल धीरे-धीरे या बिल्कुल भी नहीं बहती है। इन मुद्दों को दूर करने के लिए, सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स को एक ठोस पिस्टन का उपयोग करके टिप से चिपचिपा सामग्री को सक्रिय रूप से बाहर निकालने के लिए व्यावसायिक रूप से पेश किया गया था। यद्यपि ये सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स चिपचिपा सामग्री के सटीक और विश्वसनीय हैंडलिंग को सक्षम करते हैं, सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स के साथ स्वचालित समाधान अभी भी अकादमिक प्रयोगशाला सेटिंग्स के लिए बहुत महंगे हैं, और इसलिए, चिपचिपा सामग्री वाले अधिकांश वर्कफ़्लो पूरी तरह से मैनुअल पिपेटिंग कार्यों पर भरोसा करते हैं18।

सामान्य तौर पर, चिपचिपाहट को प्रवाह के लिए एक तरल पदार्थ के प्रतिरोध के रूप में परिभाषित किया जाता है, और चिपचिपा सामग्री को पानी की अधिक चिपचिपाहट (25 डिग्री सेल्सियस पर 0.89 mPa · s) के साथ सामग्री के रूप में परिभाषित किया जा रहा है। बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के क्षेत्र में, प्रयोगात्मक सेटअप में अक्सर पानी की तुलना में अधिक चिपचिपाहट के साथ कई सामग्री होती है, जैसे कि डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ; 25 डिग्री सेल्सियस पर 1.99 एमपीए ·एस), ग्लिसरॉल (208.1 एमपीए · एस 25 डिग्री सेल्सियस पर 90% ग्लिसरॉल [v / v]), ट्राइटन एक्स -100 (25 डिग्री सेल्सियस पर 240 एमपीए · एस), और पानी में सूजन वाले पॉलिमर, हाइड्रोजेल 1 के रूप में संदर्भित, और पानी में सूजन वाले पॉलिमर, हाइड्रोजेल 1 के रूप में संदर्भित २० । हाइड्रोजेल हाइड्रोफिलिक बहुलक नेटवर्क हैं जो विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले भौतिक या / और रासायनिक मोड में व्यवस्थित होते हैं, जिसमें सेल एनकैप्सुलेशन, ड्रग डिलीवरी और सॉफ्ट एक्ट्यूएटर्स 19,20,21,22 शामिल हैं। हाइड्रोजेल की चिपचिपाहट बहुलक एकाग्रता और आणविक भार 19 पर निर्भर करती है। बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले हाइड्रोजेल 1 और 1000 mPa · s के बीच चिपचिपाहट मूल्यों को प्रदर्शित करते हैं, जबकि विशिष्ट हाइड्रोजेल सिस्टम को 6 x 107 mPa · s19,23,24 तक के मूल्यों के साथ रिपोर्ट किया गया है। हालांकि, हाइड्रोजेल के चिपचिपाहट माप माप प्रोटोकॉल और नमूना तैयारी के संदर्भ में मानकीकृत नहीं हैं, और इसलिए, विभिन्न अध्ययनों के बीच चिपचिपाहट मूल्यों की तुलना करना मुश्किल है।

चूंकि विशेष रूप से हाइड्रोजेल के लिए डिज़ाइन किए गए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित समाधान या तो गायब हैं या बहुत महंगे हैं, इसलिए हाइड्रोजेल के लिए वर्तमान वर्कफ़्लो मैनुअल हैंडलिंग 18 पर निर्भर करते हैं। हाइड्रोजेल के पिपेटिंग के लिए वर्तमान मैनुअल-आधारित वर्कफ़्लो की सीमाओं को समझने के लिए, आवश्यक हैंडलिंग कार्यों को समझना महत्वपूर्ण है18। उदाहरण के लिए, एक बार एक उपन्यास हाइड्रोजेल सामग्री को सिंथेटाइज़ किया गया है, एक वांछित एकाग्रता या अलग-अलग सांद्रता के साथ एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला को विश्वसनीय संश्लेषण प्रोटोकॉल और यांत्रिक गुणों के बाद के विश्लेषण के साथ क्रॉसलिंकिंग विशेषताओं की पहचान करने के लिए उत्पन्न किया जाता है25,26,27,28 . सामान्य तौर पर, एक स्टॉक समाधान तैयार या खरीदा जाता है, और बाद में मिश्रण प्राप्त करने के लिए एक डिलुएंट और / या अन्य अभिकर्मकों के साथ मिलाया जाता है। मिश्रण कार्य ज्यादातर एक अच्छी तरह से प्लेट (या किसी भी आउटपुट प्रारूप) में सीधे नहीं किए जाते हैं, और बल्कि एक अलग प्रतिक्रिया ट्यूब में किए जाते हैं, जिसे आमतौर पर मास्टर मिक्स के रूप में जाना जाता है। इन तैयारी कार्यों के दौरान, चिपचिपा सामग्री (ओं) को स्थानांतरित करने, अभिकर्मकों को मिलाने, और मिश्रण को आउटपुट प्रारूप (जैसे, एक 96 अच्छी तरह से प्लेट) में स्थानांतरित करने के लिए विभिन्न एस्पिरेटिंग और वितरण चरणों की आवश्यकता होती है। इन कार्यों के लिए मानव श्रम की एक उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है18, लंबे प्रयोगात्मक घंटे, और मानव त्रुटियों की संभावना बढ़ जाती है जो संभावित रूप से गलत परिणामों के रूप में प्रकट हो सकती है। इसके अलावा, मैनुअल हैंडलिंग विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए विभिन्न पैरामीटर संयोजनों को स्क्रीन करने के लिए उच्च नमूना संख्याओं की कुशल तैयारी को रोकता है। मैनुअल प्रसंस्करण भी उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए हाइड्रोजेल के उपयोग में बाधा डालता है, जैसे कि दवा के विकास के दौरान होनहार यौगिकों की पहचान। वर्तमान मैनुअल-आधारित तैयारी कदम हजारों दवाओं से युक्त दवा पुस्तकालयों की जांच करने के लिए संभव नहीं हैं। इन कारणों से, एक कुशल विकास प्रक्रिया प्रदान करने और दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए हाइड्रोजेल के सफल अनुवाद को सक्षम करने के लिए स्वचालित समाधानों की आवश्यकता होती है।

मैन्युअल-आधारित वर्कफ़्लोज़ से स्वचालित प्रक्रियाओं में जाने के लिए, हमने थर्मोरेस्पॉन्सिव सामग्री के लिए तापमान डॉक के एकीकरण द्वारा चिपचिपा सामग्री से निपटने के लिए एक वाणिज्यिक ओपन सोर्स पिपेटिंग रोबोट को अनुकूलित किया है, केशिका पिस्टन युक्तियों का उपयोग करके ऑफ-द-शेल्फ सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स का उपयोग, और पिपेट टिप सफाई के लिए एक वैकल्पिक टिप टच डॉक। इस pipetting रोबोट आगे एक नए विकसित खुला स्रोत workstation है, जो तैयार करने के लिए स्थापित और अनुकूलन मॉड्यूल के होते हैं में एक pipetting मॉड्यूल के रूप में एकीकृत किया गया है 18,29. हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर फ़ाइलों सहित विकसित कार्यस्थान के लिए विस्तृत असेंबली निर्देश GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) और Zenodo रिपॉजिटरी (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757) से स्वतंत्र रूप से सुलभ हैं। हार्डवेयर विकास के अलावा, एक ओपन सोर्स प्रोटोकॉल डिज़ाइन एप्लिकेशन को पैरामीटर चयन प्रक्रिया के माध्यम से उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करने और एक रेडी-टू-यूज प्रोटोकॉल कोड (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp) उत्पन्न करने के लिए प्रोग्राम और जारी किया गया है। यह कोड वाणिज्यिक ओपन सोर्स पिपेटिंग रोबोट के साथ-साथ विकसित ओपन सोर्स वर्कस्टेशन पर भी चलता है।

यहाँ, एक व्यापक ट्यूटोरियल खुला स्रोत workstation के संचालन पर प्रदान की जाती है चिपचिपा सामग्री के लिए मिश्रण कार्यों को स्वचालित करने के लिए (चित्रा 1). ट्यूटोरियल-विशिष्ट प्रोटोकॉल चरणों को विकसित ओपन सोर्स वर्कस्टेशन के साथ-साथ वाणिज्यिक ओपन सोर्स पिपेटिंग रोबोट के साथ किया जा सकता है। एक इन-हाउस विकसित ओपन सोर्स प्रोटोकॉल डिजाइन एप्लिकेशन, स्वचालित मिश्रण और ग्लिसरॉल, जिलेटिन मेथाक्रिलोयल (GelMA) और एल्गिनेट के लिए आवश्यक सांद्रता की तैयारी द्वारा समर्थित है। ग्लिसरॉल को इस ट्यूटोरियल में चुना गया है, क्योंकि यह अच्छी तरह से विशेषता है30,31, यह सस्ती और आसानी से उपलब्ध है, और इसलिए, यह आमतौर पर स्वचालित पिपेटिंग कार्यों के लिए चिपचिपा संदर्भ सामग्री के रूप में उपयोग किया जाता है। बायोमेडिकल अनुप्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले हाइड्रोजेल के उदाहरणों के रूप में, GelMA और alginate हाइड्रोजेल अग्रदूत समाधान स्वचालित मिश्रण प्रयोगों के लिए लागू किए गए हैं। GelMA सेल encapsulation अध्ययन 32,33 के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया hydrogels में से एक प्रस्तुत करता है, और एल्गिनेट डबल नेटवर्क hydrogels34,35 के निर्माण की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए इस अध्ययन में चुना गया था। एक डाई के रूप में ऑरेंज जी का उपयोग करते हुए, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 16 के साथ मिश्रण परिणामों को मान्य करने और सत्यापित करने के लिए एक तेज और सस्ती प्रक्रिया लागू की गई थी।

एक वाणिज्यिक ओपन सोर्स पिपेटिंग रोबोट को विकसित ओपन सोर्स वर्कस्टेशन (चित्रा 2 ए) में एक पिपेटिंग मॉड्यूल के रूप में एकीकृत किया गया है, और इसलिए, नाम 'पिपेटिंग मॉड्यूल' का उपयोग आगे पिपेटिंग रोबोट का वर्णन करने के लिए किया जाता है। स्थापित हार्डवेयर का एक विस्तृत विवरण इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे है और प्रदान किए गए रिपॉजिटरी के माध्यम से उपलब्ध है जिसमें ओपन सोर्स प्लेटफ़ॉर्म की सामान्य असेंबली के लिए चरण-दर-चरण निर्देश भी शामिल हैं। पिपेटिंग मॉड्यूल को दो पिपेट्स (एकल- या 8-चैनल पिपेट) से सुसज्जित किया जा सकता है जो अक्ष ए (दाएं) और अक्ष बी (बाएं) (चित्रा 2 बी) पर स्थापित हैं। पिपेटिंग मॉड्यूल अमेरिकन नेशनल स्टैंडर्ड्स इंस्टीट्यूट / सोसाइटी फॉर लेबोरेटरी ऑटोमेशन एंड स्क्रीनिंग (एएनएसआई / एसएलएएस) मानकों के अनुसार 10-डेक क्षमता प्रदान करता है, और निम्नलिखित स्थान पदों को डेक पर परिभाषित किया गया है: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (चित्रा 2c)। हाइड्रोजेल समाधानों के फोटो-प्रेरित पोलीमराइजेशन को शुरू करने के लिए, एक अलग क्रॉसलिंकर मॉड्यूल की आवश्यकता होती है और इसे वर्कस्टेशन में जोड़ा गया है। क्रॉसलिंकर मॉड्यूल 400 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ एलईडी से सुसज्जित है और इसलिए, दृश्यमान प्रकाश तरंग दैर्ध्य पर उत्तेजित करने वाले पदार्थों का उपयोग वर्तमान प्रणालियों के साथ किया जा सकता है, जैसे कि लिथियम फिनाइल -2,4,6 ट्राइमिथाइलबेंजॉयलफॉस्फिनेट (एलएपी) 36,37। एल ई डी की तीव्रता (mW / cm2 में) को क्रॉसलिंकिंग व्यवहार 38 का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल डिज़ाइन एप्लिकेशन में उपयोगकर्ता द्वारा संबोधित किया जा सकता है। वर्कस्टेशन में वृद्धि हुई थ्रूपुट अध्ययनों को सक्षम करने के लिए एक भंडारण मॉड्यूल भी शामिल है; हालांकि, इस मॉड्यूल का उपयोग इस अध्ययन के भीतर नहीं किया जाता है और इसलिए, आगे वर्णित नहीं किया गया है। सामान्य तौर पर, नमूना संदूषण से बचने के लिए जैविक सुरक्षा कैबिनेट में पिपेटिंग मॉड्यूल को संचालित करने की सिफारिश की जाती है। पिपेटिंग मॉड्यूल को संचालित करने के लिए मुख्य पावर सर्किट एक 12 वी सर्किट है, जिसे अधिकांश देशों में कम वोल्टेज एप्लिकेशन के रूप में माना जाता है। सभी विद्युत घटक एक समर्पित नियंत्रण बॉक्स में आधारित होते हैं जो उपयोगकर्ताओं को विद्युत खतरे के स्रोत के संपर्क में आने से रोकते हैं।

इन मानकीकृत मिश्रण प्रोटोकॉल का पालन करके, शोधकर्ता एक स्वचालित फैशन में चिपचिपा के साथ-साथ गैर-चिपचिपा सामग्री के लिए विश्वसनीय मिश्रण प्राप्त करने में सक्षम हैं। ओपन सोर्स दृष्टिकोण उपयोगकर्ताओं को मिश्रण अनुक्रमों को अनुकूलित करने और समुदाय के साथ नए विकसित प्रोटोकॉल साझा करने की अनुमति देता है। आखिरकार, यह दृष्टिकोण विभिन्न कारकों के बीच अंतर-निर्भरताओं की जांच करने के लिए कई पैरामीटर संयोजनों की स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करेगा और इस प्रकार, बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए चिपचिपा सामग्री के विश्वसनीय अनुप्रयोग और विकास में तेजी लाएगा।

Protocol

नोट:: प्रोटोकॉल (1) सॉफ़्टवेयर और (2) आवश्यक स्थापनाओं और कार्यस्थान के साथ उपयोगकर्ता परिचित करने के लिए हार्डवेयर सेटअप के लिए एक परिचय के साथ प्रारंभ होता है। (3) सामग्री की तैयारी और (4) प्रोटोकॉल डिजाइनर एप्लिकेशन के उपयोग पर एक अनुभाग के बाद, (5) पिपेटिंग मॉड्यूल का अंशांकन और (6) स्वचालित प्रोटोकॉल के निष्पादन पर विस्तार से प्रकाश डाला गया है। अंत में, (7) सत्यापन और सत्यापन प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है, जिसमें अवशोषण पठन और डेटा विश्लेषण शामिल हैं। अलग-अलग कार्यों के साथ एक सामान्य प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो चित्र 1 में प्रदर्शित होता है.

1. सॉफ्टवेयर सेटअप

नोट:: इस अनुभाग अनुप्रयोग प्रोग्रामिंग इंटरफ़ेस (API) के साथ-साथ आवश्यक प्रोटोकॉल डिज़ाइनर अनुप्रयोग और अंशांकन टर्मिनल को स्थापित करने के लिए एक विस्तृत अनुदेश शामिल हैं। रास्पबेरी पाई (RPi) एकल-बोर्ड कंप्यूटर के लिए निम्नलिखित निर्देश लिखे गए हैं; हालांकि, विंडोज 8, 10 और मैकओएस 10.13 + को एपीआई और अनुप्रयोगों के साथ सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।

  1. कंप्यूटर वातावरण सेट करें।
    नोट: Python39 की मूल बातें से परिचित रहें, रास्पबेरी Pi40,41 को कैसे सेट करें और उपयोग करें, और Internet42 से कैसे कनेक्ट करें। निम्नलिखित ट्यूटोरियल चरणों प्रोटोकॉल-विशिष्ट चरणों पर ध्यान केंद्रित और एक रास्पबेरी पाई के उपयोग पर अतिरिक्त जानकारी ऑनलाइन 40 उपलब्ध है।
    1. कार्यपट्टी या अनुप्रयोग मेनू से टर्मिनल विंडो खोलें.
    2. सिस्टम की पैकेजसूची अद्यतन करें:
      sudo apt-get update
    3. सभी स्थापित पैकेजों का नवीनीकरण करें:
      sudo apt-get dist-upgrade
    4. रास्पबेरी पाई पुनरारंभ करें:
      सूडो रिबूट
    5. स्थापित पायथन संस्करण की जाँच करें:
      python3 --संस्करण
      सुनिश्चित करें कि कम से कम पायथन 3.5 स्थापित है; यदि नहीं, तो नवीनतम संस्करण 43 स्थापित करें।
    6. पायथन पाइप स्थापित करें, जो पायथन पैकेज इंडेक्स 44 के साथ पायथन पैकेज प्रकाशित करता है:
      sudo apt-get install python3-pip
    7. निर्भरताएँ स्थापित करें:
      पाइप स्थापित numpy
      पाइप स्थापित पायथन-आकार बदलें छवि
      नोट:: यदि आप Windows का उपयोग कर रहे हैं, तो आप के माध्यम से Windows-शाप पैकेज स्थापित करने की आवश्यकता है: पायथन -m पाइप स्थापित खिड़कियों-अभिशाप
  2. अनुप्रयोग प्रोग्रामिंग इंटरफ़ेस (API) स्थापित करें।
    नोट:: एपीआई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्क्रिप्ट लिखने और कार्यस्थान संचालित करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक साधारण पायथन फ्रेमवर्क प्रदान करता है। जनरेट किए गए प्रोटोकॉल कोड को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए निम्न दो APIs की आवश्यकता होती है।
    1. कार्यस्थान API स्थापित करें:
      पिप अधिष्ठापन ओपनवर्कस्टेशन
    2. पिपेटिंग मॉड्यूल को संचालित करने के लिए Opentrons API स्थापित करें:
      पाइप opentrons स्थापित = = 2.5.2
    3. सत्यापित करें, यदि API सफलतापूर्वक स्थापित है:
      python3
      >>> आयात openworkstation
      >>> opentrons आयात
      नोट:: API और प्रोटोकॉल डिज़ाइन अनुप्रयोग का आकार क्रमशः 2.2 MB और 1.2 MB है। सीमित डिस्क स्थान (200 MB) के साथ उपयोग किए जाने पर स्थापना के दौरान कोई समस्या अनुभव नहीं की गई थी. हालाँकि, डिस्क स्थान आवश्यकताएँ ऑपरेटिंग सिस्टम पर निर्भर करती हैं।
  3. फ़ाइल डाउनलोड (अंशांकन टर्मिनल, प्रोटोकॉल डिज़ाइन अनुप्रयोग, आदि) के लिए एक निर्देशिका का चयन करें.
    नोट:: फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाई जा सकती है और बाद में कहीं और चिपकाया जा सकता है।
  4. GitHub रिपॉजिटरी से क्लोन फ़ाइलें:
    गिट क्लोन https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
    नोट:: 'गिट क्लोन' आदेश क्लोन और बाद में निर्देशिका, जो इस समय टर्मिनल में खुला है में सभी फ़ाइलों को सहेजता है। चूंकि रिपॉजिटरी में असेंबली के लिए हार्डवेयर फ़ाइलें भी शामिल हैं, इसलिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल को निष्पादित करने के लिए पूरे रिपॉजिटरी की आवश्यकता नहीं है। प्रयोगों को दोहराने के लिए सभी आवश्यक फ़ाइलें पूरक फ़ाइल के रूप में और "/उदाहरण/प्रकाशन-JoVE" के तहत GitHub रिपॉजिटरी में उपलब्ध हैं।
  5. डाउनलोड किए गए फ़ोल्डर को खोलें। यदि संपूर्ण भंडार डाउनलोड किया गया था, तो के माध्यम से 'प्रकाशन-JoVE' फ़ोल्डर पर नेविगेट करें
    cd openworkstation/examples/publication-JoVE
    नोट:: इस फ़ोल्डर कार्यस्थान की कार्रवाई और प्रोटोकॉल डिज़ाइनर अनुप्रयोग और अंशांकन टर्मिनल के उपयोग के लिए आवश्यक फ़ाइलें शामिल हैं।

2. हार्डवेयर सेटअप

  1. नमूना संदूषण से बचने के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में वर्कस्टेशन रखें।
  2. कार्यस्थान पर पिपेट्स स्थापित करें.
    1. प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर पिपेट आकार का चयन करें। सामान्य तौर पर, एक पिपेट आकार लें जो एस्पिरेटेड होने वाली मात्रा सीमा के उच्च अंत पर है। यदि 1 एमएल से अधिक वॉल्यूम के साथ मिश्रण कार्यों को एक विशिष्ट सेटअप के लिए आवश्यक है (उदाहरण के लिए, 2 एमएल की एस्पिरेटिंग / डिस्पेंसिंग), तो पिपेटिंग चरणों को कम करने और समय बचाने के लिए 1,000 μL की अधिकतम एस्पिरेशन / डिस्पेंसिंग वॉल्यूम के साथ M1000E चुनें।
      नोट: हवा विस्थापन पिपेट्स के लिए एक विस्तृत निर्देश ऑनलाइन 45 उपलब्ध है। विकसित पिपेटिंग मॉड्यूल निम्नलिखित ऑफ-द-शेल्फ सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स को एकीकृत करने में सक्षम है: M10E (1-10 μL), M25E (3–25 μL), M50E (20-50 μL), M100E (10-100 μL), M250E (50-250 μL), M1000E (100–1,000 μL)।
    2. शिकंजा ढीला करने और कसने के लिए एक M4 एलन कुंजी का उपयोग करें।
    3. एल्यूमीनियम रेल के लिए दो पिपेट फिक्सेशन प्लेटों (सफेद ऐक्रेलिक प्लेटों) संलग्न करें और M5 शिकंजा ढीले कस।
    4. दो पिपेट निर्धारण प्लेटों में पिपेट डालें और सुनिश्चित करें कि पिपेट की एर्गोनोमिक पूंछ ऐक्रेलिक माउंटिंग प्लेट के विपरीत पक्ष पर आराम कर रही है।
    5. दो पिपेट निर्धारण प्लेटों के चार शिकंजा को मजबूती से कसें।
    6. दो वर्ग फास्टनिंग नट्स को स्लाइड करें, जो ऐक्रेलिक माउंटिंग प्लेट से जुड़े होते हैं, जेड-अक्ष के एक्सट्रूज़न स्लॉट में और शिकंजा कसते हैं।
      नोट: ऑपरेशन के दौरान किसी भी आंदोलन से बचने के लिए पिपेट को कसकर जकड़नें।

3. सामग्री की तैयारी

नोट: चिपचिपा सामग्री (ग्लिसरॉल, GelMA, alginate) इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है, और इसलिए, तैयार मात्रा और हैंडलिंग कार्यों (उदाहरण के लिए, 5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों में स्टॉक समाधान के 5 एमएल जोड़ें) विशेष रूप से इस प्रयोगात्मक सेटअप के लिए हैं।

  1. जिलेटिन मेथाक्रिलोयल (GelMA)
    नोट: GelMA functionalization, डायलिसिस, और lyophilization इस पेपर का दायरा नहीं हैं, और एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल Loessner et al.33 में उपलब्ध है। प्रोटोकॉल lyophilized GelMA का उपयोग करना शुरू कर देता है, जिसे घर में तैयार किया जा सकता है या व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है।
    1. समीकरण का उपयोग करके वांछित अंतिम स्टॉक एकाग्रता (cGelMA) और मात्रा (VGelMA) के आधार पर GelMA (mGelMA) के आवश्यक द्रव्यमान की गणना करें:
      mGelMA = cGelMA x VGelMA
      नोट: VGelMA प्रयोगात्मक सेटअप पर निर्भर करता है और यह 20-30% अतिरिक्त सामग्री तैयार करने के लिए अनुशंसित है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक स्टॉक समाधान के रूप में 20% (डब्ल्यू / वी) गेलएमए के 5 एमएल के साथ शुरू होते हैं।
    2. lyophilized GelMA की आवश्यक मात्रा का वजन करें, इसे 50 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में जोड़ें और फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पीबीएस) की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
    3. GelMA को या तो रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर विलायक में भिगोकर या पानी के स्नान में 6 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके मिलाएं।
      नोट: बाँझ GelMA समाधान कम से कम छह महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित किया जा सकता है।
    4. 5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों में GelMA के 5 mL भरें।
  2. फोटोइनिशिएटर: लिथियम फिनाइल-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)
    नोट: कमरे की रोशनी के लिए अतिरिक्त जोखिम से बचें, क्योंकि LAP प्रकाश संवेदनशील है।
    1. समीकरण का उपयोग करके वांछित अंतिम स्टॉक एकाग्रता (cLAP) और आवश्यक मात्रा (VLAP) के आधार पर LAP (mLAP) के आवश्यक द्रव्यमान की गणना करें:
      mLAP = cLAP x VLAP
      नोट: यह एक 3% (w / v) स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए अनुशंसित है।
    2. एलएपी की आवश्यक मात्रा का वजन करें, इसे 15 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में जोड़ें और पीबीएस जोड़ें।
    3. फोटो प्रेरित अपघटन को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटें।
    4. 2 घंटे के लिए या पूरी तरह से भंग होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में प्रतिक्रिया ट्यूब रखकर एलएपी को भंग करें।
    5. 5 mL ट्यूबों में LAP स्टॉक समाधान के 1 mL भरें।
  3. Alginate
    1. समीकरण का उपयोग करके वांछित अंतिम स्टॉक एकाग्रता (calginate) और आयतन (Valginate) के आधार पर alginate (malginate) की आवश्यक मात्रा की गणना करें:
      malginate = calginate x Valginate
      नोट: Valginate प्रयोगात्मक सेटअप पर निर्भर करता है और यह 20-30% अतिरिक्त सामग्री तैयार करने के लिए अनुशंसित है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक स्टॉक समाधान के रूप में 4% (डब्ल्यू / वी) एल्गिनेट के 5 एमएल के साथ शुरू होते हैं।
    2. एल्गिनेट के आवश्यक द्रव्यमान का वजन करें, इसे 50 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में जोड़ें, और पीबीएस जोड़ें।
    3. 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में alginate मिश्रण जगह.
      नोट: एक भंवर मिक्सर का उपयोग विघटन प्रक्रिया में तेजी लाएगा, लेकिन हवा के बुलबुले भी उत्पन्न करेगा। भंग alginate कम से कम छह महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. 5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में एल्गिनेट के 5 मिलीलीटर भरें।
  4. 5 मिली प्रतिक्रिया ट्यूबों में ग्लिसरॉल के 5 मिलीलीटर भरें।
  5. नारंगी जी समाधान
    1. एक 50 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में ऑरेंज जी का 10 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें।
      नोट:: वॉल्यूम प्रयोगों की संख्या पर निर्भर करता है। डिलुएंट प्रकार के आधार पर, अल्ट्राप्योर पानी, पीबीएस या एक उपयुक्त डिलुएंट अभिकर्मक में स्टॉक समाधान तैयार करें। प्रस्तुत प्रयोगों में, गेलएमए और एल्गिनेट को पतला करने के लिए ग्लिसरॉल और पीबीएस को पतला करने के लिए अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग किया गया था। पीबीएस का उपयोग GelMA और alginate के लिए एक डिलुएंट के रूप में किया गया था, और या तो गोलियों का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है या ऑफ-द-शेल्फ खरीदा जा सकता है।
    2. भंवर द्वारा 10 s के लिए मिश्रण.
    3. फोटो प्रेरित अपघटन को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटें।
      नोट: स्टॉक समाधान का उपयोग ऑरेंज जी के उचित विघटन को सुनिश्चित करने के लिए 24 घंटे के बाद किया जा सकता है।
    4. एक 50 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में एक 1 मिलीग्राम / एमएल काम करने वाले समाधान के लिए स्टॉक समाधान को पतला करें।
    5. प्रयोगात्मक सेटअप के लिए उपयुक्त फ्लास्क / ट्यूबों के लिए काम करने वाले समाधान को स्थानांतरित करें।
      नोट: प्रस्तुत प्रयोगों के लिए, काम कर रहे समाधान 5 mL ट्यूबों में भर गया था। ऑरेंज जी स्टॉक और काम करने वाले समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और तैयारी पर तीन महीने के भीतर उपयोग किया जा सकता है।
    6. 5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में 1 मिलीग्राम / एमएल ऑरेंज जी काम करने वाले समाधान के 5 मिलीलीटर भरें।

4. प्रोटोकॉल डिजाइनर अनुप्रयोग के साथ प्रोटोकॉल कोड उत्पन्न

नोट:: चरण 4.2−4.7 में निर्दिष्ट पैरामीटर सामग्री के स्टॉक एकाग्रता और अंतिम आउटपुट एकाग्रता को छोड़कर, सभी आयोजित प्रयोगों के लिए समान हैं। इन पैरामीटरों को तालिका 1 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है और, निम्नलिखित में, पैरामीटर का उपयोग 5% (w / v) GelMA, 2% (w / v) alginate, 0.15% (w / v) LAP, और PBS के साथ डबल नेटवर्क हाइड्रोजेल तैयार करने के लिए किया जाता है।

  1. 'ProtocolDesignApp.html' चलाकर प्रोटोकॉल डिज़ाइनर अनुप्रयोग खोलें।
    नोट:: अनुप्रयोग "ProtocolDesignApp.html" पैरामीटर चयन प्रक्रिया के माध्यम से उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करता है और स्वचालित रूप से कार्यस्थान को संचालित करने के लिए उपयोग के लिए तैयार प्रोटोकॉल जनरेट करता है। उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस हर आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले इंटरनेट ब्राउज़र (यानी क्रोम, फ़ायरफ़ॉक्स, सफारी, एज, इंटरनेट एक्सप्लोरर) पर चलता है।
  2. सेटअप पृष्ठ पर प्रोटोकॉल नाम (जैसे, डबल-नेटवर्क-हाइड्रोजेल) दर्ज करें.
  3. प्रोटोकॉल नाम की पुष्टि करने के लिए 'जारी रखें' पर क्लिक करें और अगले चरण पर आगे बढ़ें।
  4. ड्रॉप-डाउन मेनू और निम्न इनपुट पैरामीटर से '3x4 हीटिंग ब्लॉक' का चयन करके इनपुट ट्रे निर्धारित करें:
    1. ड्रॉप-डाउन मेनू से 'जेल 1' का चयन करें, नाम 'GelMA' दर्ज करें, स्टॉक-एकाग्रता '20%' दर्ज करें, एक कॉलम को भरने के लिए 'नमूनों की संख्या' को '3' पर सेट करें। प्रविष्टियों को सहेजने के लिए '+add' पर क्लिक करें.
    2. ड्रॉप-डाउन मेनू से 'जेल 2' का चयन करें, नाम दर्ज करें: 'Alginate', स्टॉक-एकाग्रता '4%' दर्ज करें, एक कॉलम को भरने के लिए 'नमूनों की संख्या' को '3' पर सेट करें। प्रविष्टियों को सहेजने के लिए '+add' पर क्लिक करें.
    3. ड्रॉप-डाउन मेनू से 'Photoinitiator' चुनें, नाम दर्ज करें: 'LAP', स्टॉक-एकाग्रता '3%' दर्ज करें, एक कॉलम भरने के लिए 'नमूनों की संख्या' को '3' पर सेट करें। प्रविष्टियों को सहेजने के लिए '+add' पर क्लिक करें.
    4. ड्रॉप-डाउन मेनू से 'डिलुएंट 1' का चयन करें, नाम दर्ज करें: 'पीबीएस', एक कॉलम को भरने के लिए 'नमूनों की संख्या' को '3' पर सेट करें। प्रविष्टियों को सहेजने के लिए '+add' पर क्लिक करें.
      नोट:: इनपुट ट्रे का विज़ुअलाइज़ेशन स्वचालित रूप से अद्यतन, एक बार '+जोड़ें' क्लिक किया जाता है। यदि ट्रे की क्षमता से अधिक इनपुट जोड़े जाते हैं, तो चेतावनी 'इस ट्रे के लिए बहुत अधिक नमूने' उपयोगकर्ता को दिखाई जाएगी।
  5. 'फोटो क्रॉसलिंकिंग' की जांच करके क्रॉसलिंकिंग पैरामीटर को परिभाषित करें और सेकंड में समय टाइप करें, '30', और '2' के साथ तीव्रता W / m2 ।
  6. 'CONTINUE' पर क्लिक करके इनपुट सेटअप समाप्त करें.
  7. अच्छी तरह से प्लेट प्रकार के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू में '96 अच्छी तरह से प्लेट' का चयन करके आउटपुट ट्रे सेटअप को परिभाषित करें।
  8. नमूनों का एक समूह बनाकर आउटपुट को परिभाषित करने के लिए 'Group1' पर क्लिक करें।
    1. प्रत्येक इनपुट के लिए फ़ील्ड में वांछित सांद्रता और नमूना मात्रा दर्ज करके आउटपुट संरचना निर्दिष्ट करें: GelMA = '5', Alginate = '2', LAP = '0.15', कुल आयतन = '60'.
    2. उन्नत मिश्रण प्रोटोकॉल लागू करने के लिए चेक बॉक्स.
  9. 'नमूनों की संख्या' फ़ील्ड में नमूनों की संख्या दर्ज करके नमूनों की संख्या निर्दिष्ट करें: '96'.
    नोट:: नमूना ट्रे का विज़ुअलाइज़ेशन स्वचालित रूप से अद्यतन, एक बार '+जोड़ें समूह' क्लिक किया गया है। यदि ट्रे की क्षमता से अधिक नमूने जोड़े जाते हैं, तो चेतावनी 'इस ट्रे के लिए बहुत अधिक नमूने' उपयोगकर्ता को दिखाई जाएगी।
  10. 'जारी रखें' पर क्लिक करके आउटपुट सेटअप समाप्त करें।
    1. डेक लेआउट पर ट्रे की स्थिति का चयन करें और तदनुसार प्लेटफ़ॉर्म तैयार करें:
    2. फ़ील्ड 'SLOT A1' में चेकमार्क की जाँच करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से 'Empty_Cell' चुनें.
    3. फ़ील्ड 'SLOT A2' में चेकमार्क की जाँच करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से 'Trash_Cell' का चयन करें।
    4. फ़ील्ड 'SLOT B1' में चेकमार्क की जाँच करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से 'Tips_Cell_100 μL' का चयन करें।
    5. फ़ील्ड 'SLOT B2' में चेकमार्क की जाँच करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से 'Tips_Cell_1000 μL' का चयन करें।
    6. फ़ील्ड 'SLOT C1' में चेकमार्क की जाँच करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से 'Input_Cell' का चयन करें।
    7. फ़ील्ड 'SLOT C2' में चेकमार्क की जाँच करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से 'Empty_Cell' का चयन करें।
    8. फ़ील्ड 'SLOT D1' में चेकमार्क की जाँच करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से 'Mixing_Cell' का चयन करें।
    9. फ़ील्ड 'SLOT D2' में चेकमार्क की जाँच करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से 'Output_Cell' का चयन करें।
    10. 'पिपेट लेफ्ट' की जांच करके पहले पिपेट (M100E) के प्रकार और विशेषताओं को परिभाषित करें, ड्रॉप-डाउन मेनू से '10-100μL सकारात्मक विस्थापन' का चयन करें और एस्पिरेटिंग गति = '600' सेट करें, वितरण गति = '800'।
    11. 'पिपेट राइट' की जांच करके, ड्रॉप-डाउन मेनू से '100-1000μL सकारात्मक विस्थापन' का चयन करके दूसरे पिपेट (M1000E) के प्रकार और विशेषताओं को परिभाषित करें और एस्पिरेशन गति = '800' सेट करें, वितरण गति = '1200'।
  11. सेटअप की पुष्टि करने और प्रोटोकॉल स्क्रिप्ट उत्पन्न करने के लिए 'जनरेट प्रोटोकॉल' पर क्लिक करें।
    नोट:: विकसित प्रोटोकॉल डिज़ाइनर अनुप्रयोग स्वचालित रूप से एक नया फ़ोल्डर जनरेट करता है जब भी एक नया प्रोटोकॉल जनरेट किया गया है। इस प्रयोग के लिए और कार्यस्थान को संचालित करने के लिए आवश्यक सभी फ़ाइलें इस फ़ोल्डर में सहेजी जाती हैं जिसका नाम प्रोटोकॉल नाम के नाम पर रखा गया है। फ़ोल्डर समस्याओं के कारण के बिना विभिन्न निर्देशिकाओं में प्रतिलिपि बनाई जा सकती है।
  12. इंटरफ़ेस को बंद न करें, क्योंकि इसका उपयोग प्रोटोकॉल को निष्पादित करने के लिए किया जाएगा (चरण 6.6 देखें.).

5. pipetting मॉड्यूल के अंशांकन

नोट: कंटेनर (उदाहरण के लिए, अच्छी तरह से प्लेटों, टिप रैक, कचरा) और पिपेट्स (जैसे, M1000E) को शुरू में कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। यदि कोई कंटेनर और/या पिपेट स्थिति संशोधित/परिवर्तित की जाती है, तो नई स्थिति को कैलिब्रेट किया जाना चाहिए।

  1. प्रोटोकॉल फ़ोल्डर पर नेविगेट करें और टर्मिनल windox में फ़ाइल 'calibrate.py' निष्पादित करके अंशांकन टर्मिनल खोलें (चरण 1.1.1 देखें):
    phython.calibrate.py
    नोट:: 'calibrate.py' इंटरफ़ेस डेक सेटअप और पिपेट्स के अंशांकन के माध्यम से उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करता है। सुनिश्चित करें कि फ़ाइल प्रोटोकॉल फ़ाइल और मॉड्यूल फ़ाइलों के रूप में एक ही फ़ोल्डर में है। यह स्वचालित रूप से चरण 4.10 में उत्पन्न होता है।
  2. संख्यात्मक कीपैड (1−8) के साथ प्लंजरक्स, y, z आंदोलन के लिए आंदोलन वृद्धि का चयन करें: 0.1 मिमी के लिए '1', 0.5 मिमी के लिए '2', 1 मिमी के लिए '3', 5 मिमी के लिए '4', 10 के लिए '5', 20 मिमी के लिए '6', 40 मिमी के लिए '7', और 80 मिमी के लिए '8'।
  3. पिपेट को कैलिब्रेट करें।
    1. पिपेट आकार का चयन करने के लिए कुंजीपटल शॉर्टकट P दबाएँ.
    2. प्लंजर अंशांकन मोड दर्ज करने के लिए कुंजीपटल शॉर्टकट V दबाएँ.
      नोट: पिपेट सिर की वृद्धि आकार और आंदोलन कार्रवाई से परिचित होने के लिए छोटे वेतन वृद्धि (2, 5, और 10 मिमी) के साथ शुरू करने की सिफारिश की जाती है।
    3. एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट के लिए निम्नलिखित प्लंजर पदों को कैलिब्रेट करें: टी-टॉप = आराम की स्थिति; बी-बॉटम = प्लंजर को तब तक धक्का दिया जाता है जब तक कि प्रतिरोध पूरा नहीं हो जाता है; पी-पिक-अप = प्लंजर को एक ऐसी स्थिति में धकेल दिया जाता है जहां एक पिस्टन टिप संलग्न की जा सकती है; E-Eject = plunger को तब तक धक्का दिया जाता है जब तक कि एक संलग्न टिप को बाहर नहीं निकाला जाता है। कुंजीपटल पर ऊपर और नीचे तीर का उपयोग कर प्लंजर पदों को अलग-अलग करें, और कुंजीपटल पर एस का उपयोग करके अंतिम स्थिति को सहेजें।
    4. कुंजीपटल शॉर्टकट V दबाकर पिपेट प्लंजर अंशांकन मोड छोड़ दें।
  4. पिपेट टिप के सापेक्ष कंटेनर स्थिति कैलिब्रेट करें।
    1. पिपेट प्रकार का चयन करने के लिए कुंजीपटल शॉर्टकट P दबाएँ. सुनिश्चित करें कि कोई युक्ति चयनित पिपेट से कनेक्टेड है.
    2. कंटेनर प्रकार का चयन करने के लिए कुंजीपटल शॉर्टकट C दबाएँ.
    3. एक उपयुक्त आंदोलन वृद्धि का चयन करें और पिपेट टिप को निम्न स्थितियों में ले जाएँ। अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, नीचे 'ए 1' अच्छी स्थिति में कैलिब्रेट करें; टिप रैक के लिए, 'ए 1' स्थिति के लिए कैलिब्रेट करें; ट्रैश के लिए, एक ऐसी स्थिति चुनें (जिसे एक बिंदु के रूप में परिभाषित किया गया है) जहां टिप को कचरे में निकाला जा सकता है।
    4. स्थिति को सहेजने के लिए कुंजीपटल शॉर्टकट S दबाएँ.
    5. चयनित पिपेट प्रकार के लिए 'C' के अंतर्गत सूचीबद्ध सभी कंटेनरों के लिए चरण 5.3.1−5.3.3 दोहराएँ।
    6. दूसरे पिपेट प्रकार के लिए 5.3.1−5.3.5 को दोहराएं।
    7. अंशांकन स्क्रिप्ट बंद करें।

6. कार्यस्थान के साथ प्रोटोकॉल निष्पादन

नोट:: प्रोटोकॉल फ़ाइलें रिपॉजिटरी के माध्यम से पहुँच योग्य हैं और पूरक फ़ाइल के रूप में भी उपलब्ध हैं।

  1. स्थिति कचरा कंटेनर, टिप रैक, इनपुट ट्रे, मिश्रण ट्रे, और डेक पर आउटपुट (चरण 4.3 में परिभाषित).
  2. कैलिब्रेट पिपेट्स और उपकरणों के रूप में अनुभाग 5 में परिभाषित किया गया है।
  3. यदि आवश्यक हो, तो तापमान डॉक को चालू करें और इनपुट और मिक्सिंग ट्रे के लिए तापमान का चयन करें।
    नोट: इस ट्यूटोरियल में प्रयोगों तापमान नियंत्रण के बिना और ग्लिसरॉल के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किए गए थे, और GelMA और alginate pipetting के लिए 37 डिग्री सेल्सियस.
  4. चयनित सेटअप के अनुसार तापमान डॉक पर एल्यूमीनियम ब्लॉकों में इनपुट अभिकर्मकों के साथ स्थिति ट्यूब।
  5. तब तक प्रतीक्षा करें जब तक इनपुट अभिकर्मक वांछित तापमान तक नहीं पहुंच जाते।
    नोट: उचित तापमान वितरण सुनिश्चित करने के लिए, GelMA और alginate के लिए 30 मिनट का एक इनक्यूबेशन समय अनुशंसित है।
  6. 'RUN PYTHON SCRIPT' पर क्लिक करके प्रोटोकॉल फ़ाइल निष्पादित करें
    नोट:: चयनित प्रोटोकॉल अब कार्यस्थान द्वारा निष्पादित किया गया है। साथ के वीडियो GelMA के स्वचालित मिश्रण और एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में 60 μL के वितरण पर प्रकाश डाला गया है.
  7. 'समाप्त' प्रदर्शित किया जाता है, जब चलाएँ पूर्ण हो गया है।

7. सत्यापन और सत्यापन प्रक्रिया

  1. वर्कस्टेशन से अच्छी तरह से प्लेट निकालें और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए नमूनों के साथ अच्छी तरह से प्लेट परिवहन।
  2. 450 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ अवशोषण पढ़ें। परिणामों की तुलना करने और लगातार परिणाम सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक प्लेट 2x पढ़ें।
  3. निर्यात और absorbance रीडिंग बचाने के लिए।
  4. डेटा विश्लेषण।
    नोट:: प्रयोगात्मक डेटा को व्यक्तिगत रूप से संसाधित किया जा सकता है या स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके माध्य, मानक विचलन और विचरण के गुणांक (CV) मान का मूल्यांकन करने के लिए प्रदान किए गए टेम्पलेट में प्रतिलिपि बनाई और चिपकाई जा सकती है.
    1. 'supplementary_template-विश्लेषण.xlsx" पूरक फाइल को खोलें, जो 'openworkstation/examples/publication-JoVE' के तहत GitHub रिपॉजिटरी के भीतर भी उपलब्ध है।
    2. 'कच्चे डेटा' शीट में absorbance रीडिंग की प्रतिलिपि बनाएँ, सुनिश्चित करें कि सभी सेल संदर्भ सभी तालिकाओं में सही ढंग से परिभाषित किए गए हैं, और औसत, मानक विचलन, और विचरण के गुणांक (CV) मानों पर जानकारी के लिए 'विश्लेषण' पत्रक पर क्लिक करें।
      नोट:: एक अच्छी तरह से प्लेट पर नमूना वितरण के आधार पर, निम्न पूर्व निर्धारित मूल्यांकन प्रकार टेम्पलेट के साथ उपलब्ध हैं: 'यूनिफ़ॉर्म' प्रकार का उपयोग तब किया जाता है जब सभी नमूनों में समान संरचना होती है, 'पंक्तियों द्वारा' प्रकार का उपयोग तब किया जाता है जब विभिन्न पंक्तियों में नमूनों में अलग-अलग रचनाएं होती हैं, 'स्तंभों द्वारा' प्रकार का उपयोग किया जाता है जब विभिन्न स्तंभों में नमूनों में अलग-अलग रचनाएं होती हैं, और 'अनुकूलित' प्रकार का उपयोग तब किया जाता है जब नमूना स्थिति उपयोगकर्ता विशिष्ट होती है।

Representative Results

यह ट्यूटोरियल ग्लिसरॉल (चित्रा 3) और जेलएमए के साथ एलएपी और एल्गिनेट (चित्रा 4) के साथ प्रयोगों के लिए परिणाम प्रस्तुत करता है।

एक 80% (v / v) ग्लिसरॉल समाधान की पीढ़ी की जांच या तो तापमान नियंत्रण (कमरे का तापमान, 22 डिग्री सेल्सियस) के बिना और टिप स्पर्श के बिना (सेटअप 1 के रूप में परिभाषित), तापमान नियंत्रण (40 डिग्री सेल्सियस) के साथ और टिप स्पर्श (सेटअप 2) के बिना, या तापमान नियंत्रण (40 डिग्री सेल्सियस) के साथ और टिप टच (सेटअप 3) (चित्रा 3ए-आई) के साथ की गई थी। इन दो तापमान सेटिंग्स को हैंडलिंग अंतर का मूल्यांकन करने के लिए चुना गया था, क्योंकि ग्लिसरॉल की चिपचिपाहट लगभग 3 के एक कारक से कम हो रही है जब 22 डिग्री सेल्सियस (139.5 mPa · s) से 40 डिग्री सेल्सियस (46.6 mPa · s) 30 तक गर्म किया जाता है। ग्लिसरॉल के एक 85% (v / v) स्टॉक समाधान को 80% की अंतिम एकाग्रता में पतला किया गया था और समान रूप से 96 अच्छी तरह से प्लेट (n = 96 प्रति सेटअप) में वितरित किया गया था। प्रयोगात्मक समय, जिसमें मिश्रण ट्यूब में प्रत्येक सामग्री का वितरण, संबंधित मिश्रण कार्य, और 96 अच्छी तरह से प्लेट में नमूना वितरण शामिल है, 30 मिनट 42 सेकंड था। कमजोर पड़ने वाले मिश्रणों के बीच अंतर की पहचान करने के लिए, अल्ट्राप्योर पानी- ग्लिसरॉल के लिए डिलुएंट के रूप में- 1 मिलीग्राम / एमएल ऑरेंज जी के साथ तैयार किया गया था। absorbance रीडिंग पर प्रकाश डाला गया है कि तापमान नियंत्रण और टिप स्पर्श का एकीकरण मिश्रण को काफी प्रभावित करता है (पी < 0.0001)। विचरण (एनोवा) के दो-तरफ़ा विश्लेषण के अलावा, सापेक्ष मानक विचलन का मूल्यांकन करने के लिए CV मानों की गणना की गई थी। भिन्नता का गुणांक माध्य के संबंध में विचलन की डिग्री की पहचान करने के लिए एक मानकीकृत संकेतक का वर्णन करता है और इसे प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। यदि नमूना का मतलब विशेष रूप से ब्याज का बिंदु नहीं है, लेकिन माप के भीतर परिवर्तनशीलता है, तो भिन्नता का गुणांक पुनरुत्पादक मिश्रण की पहचान करने के लिए अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करता है46। तीन अलग-अलग सेटअप के साथ इस प्रयोग के भीतर, अवशोषण मूल्यों ने क्रमशः सेटअप 1, सेटअप 2, और सेटअप 3 के लिए 5.6%, 4.2%, से 2.0% तक सीवी मूल्यों को कम करते हुए दिखाया, तापमान डॉक के महत्वपूर्ण प्रभाव का प्रदर्शन किया और विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न करने पर टिप टच फ़ंक्शन (चित्रा 3a-ii)। सेटअप 3 के लिए नमूना absorbance मानों की साजिश (नमूना संख्या # 1 से # 96 एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में) प्रयोग के दौरान कोई वृद्धि या घटती मान उपज और इसलिए, absorbance मानों पर नमूना स्थिति का कोई प्रभाव इंगित नहीं करता है (चित्रा 3a-iii). गर्मी मानचित्रों के साथ प्रत्येक मापा अच्छी तरह से प्लेट के लिए डेटा visualizing एक विशिष्ट पंक्ति या स्तंभ, या वितरण कार्यों के दौरान अलग absorbance मूल्यों के लिए heterogenities की पहचान करने के लिए अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। तीन setups के लिए visualized heatmaps सेटअप 1 से सेटअप 3 (चित्रा 3b) के लिए पूरे अच्छी तरह से प्लेटों में heterogenities में कमी प्रदर्शित करते हैं। अंत में, आयोजित मिश्रण की replicability आठ स्वतंत्र रन (चित्रा 3c-i, ii) के भीतर मूल्यांकन किया गया था, जहां प्रत्येक रन में 6 मिनट 57 सेकंड लगे। एकल मिश्रण रन ने 1.1% से 2.6% के बीच कम सीवी मान दिखाए, जो व्यक्तिगत रन के लिए बहुत विश्वसनीय मिश्रण और वितरण कार्यों को इंगित करते हैं। सभी आठ रन के absorbance मूल्यों ने 3.3% का CV मान प्राप्त किया और स्थापित मिश्रण प्रोटोकॉल की पुनरुत्पादन क्षमता का प्रदर्शन किया।

GelMA कमजोर पड़ने श्रृंखला को PBS के साथ 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2, और 0% (w / v) के साथ 20% (w / v) स्टॉक समाधान को पतला करके तैयार किया गया था और 0.15% (w / v) (चित्रा 4a-i) की निरंतर एकाग्रता में LAP जोड़कर तैयार किया गया था, जिसमें कुल 55 मिनट 12 s लगे थे। जैसा कि प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्क्रिप्ट में निर्दिष्ट किया गया है, हाइड्रोजेल 400 एनएम पर 2.0 mW / cm2 की तीव्रता के साथ 30 s के लिए क्रॉसलिंकिंग कर रहा था। मिश्रणों के बीच के अंतर का मूल्यांकन करने के लिए, PBS- GelMA और alginate के लिए diluent के रूप में - 1 mg / mL ऑरेंज G के साथ तैयार किया गया था। इसलिए, एक मिश्रण के भीतर नमूनों के साथ-साथ सीरियल dilutions के बीच absorbance अंतर को एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ पहचाना जाता है। प्रत्येक एकाग्रता चरण के मापा absorbance मान काफी अलग हैं (पी < 0.0001) और एकाग्रता चरणों (एन = 12 प्रति एकाग्रता चरण) के दौरान 1.2% और 3.4% के बीच बहुत कम सीवी मान हैं। रैखिक प्रतिगमन ने 0.9869 (चित्रा 4a-ii) के R² मान के साथ उच्च फिट का प्रदर्शन किया और एक हीटमैप ने प्रत्येक एकाग्रता के लिए समरूप वितरण और सांद्रता के बीच के अंतर की पुष्टि की (चित्रा 4a-iii)। चार अभिकर्मकों का स्वचालित मिश्रण 5% (डब्ल्यू / वी) गेलएमए, 2% (डब्ल्यू / वी) एल्गिनेट, 0.15% (डब्ल्यू / वी) एलएपी, और पीबीएस को (सेटअप 2) के बिना डिलुएंट के रूप में और (सेटअप 3) टच टिप (एन = 96 प्रत्येक सेटअप के लिए) के साथ एक ही क्रॉसलिंकिंग पैरामीटर (30 एस, 2.0 एमडब्ल्यू / सेमी 2, 400 एनएम) के साथ आयोजित किया गया था। चार सामग्रियों का वितरण, मिश्रण, और एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में वितरित करने में 32 मिनट 22 सेकंड का समय लगा। GelMA और alginate के साथ सभी प्रयोगों को थर्मल जेलिंग को रोकने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया गया था जो GelMA के pipetting को रोकता है। टिप टच विकल्प के साथ, सीवी मान को 5.2% से 3.4% तक कम कर दिया गया था और, विशेष रूप से, निचले क्षेत्र में बाहरी लोगों को टिप से अतिरिक्त सामग्री को हटाकर रोका गया था (चित्रा 4b-i)। यद्यपि सेटअप 2 और सेटअप 3 के लिए 1.927 और 1.944 का औसत मान बहुत करीब है, भिन्नता का गुणांक माध्य के संबंध में घटते विचलन पर प्रकाश डालता है। 96 अच्छी तरह से प्लेट की एकल पंक्तियों की तुलना पंक्ति और / या कॉलम अंतर का पता लगाने के लिए हीटमैप विज़ुअलाइज़ेशन का उपयोग करके एक दूसरे के साथ की जा सकती है (चित्रा 4b-ii)।

Figure 1
चित्र 1: अलग-अलग कार्यों के साथ प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो. वर्णित वर्कफ़्लो को सात कार्यों में विभाजित किया गया है, जिन्हें सेटअप, तैयारी, निष्पादन और विश्लेषण में विभाजित किया गया है। शुरुआत में, सॉफ़्टवेयर (कार्य 1) के साथ-साथ हार्डवेयर (कार्य 2) सेट किया जाना चाहिए। सामग्री (कार्य 3) की तैयारी और प्रोटोकॉल स्क्रिप्ट (कार्य 4) की पीढ़ी के बाद, पिपेटिंग मॉड्यूल को पिपेट और कंटेनर पदों (कार्य 5) को परिभाषित करके कैलिब्रेट किया जाता है। इसके बाद, प्रोटोकॉल स्क्रिप्ट को वर्कस्टेशन (कार्य 6) पर निष्पादित किया जाता है और मिश्रण का मूल्यांकन करने के लिए मिश्रण ों का सत्यापन और सत्यापन (कार्य 7) किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: खुला स्रोत वर्कस्टेशन और pipetting मॉड्यूल के डेक सेटअप. (क) विकसित वर्कस्टेशन एक असेंबली लाइन दृष्टिकोण से प्रेरित है, जहां नमूनों को विभिन्न मॉड्यूलों के माध्यम से ले जाया जा रहा है, और इसमें निम्नलिखित मॉड्यूल शामिल हैं: पिपेटिंग, क्रॉसलिंकर, भंडारण, परिवहन और कम्प्यूटेशनल मॉड्यूल। (ख) पिपेटिंग मॉड्यूल का डेक प्रयोगात्मक लेआउट (जैसे, अच्छी तरह से प्लेट प्रकार, ट्यूब वॉल्यूम, आदि) के आधार पर स्थापित किया जाता है। प्रदर्शित डेक सेटअप का उपयोग प्रस्तुत प्रयोगों के लिए किया गया था और इसमें 10−100 μL (M100E) और 100−1,000 μL (M1000E) से एक सीमा के साथ सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स होते हैं, 100 μL (CP1000) और 1,000 μL (CP1000) के लिए केशिका पिस्टन (CP) के साथ टिप रैक, एक कचरा कंटेनर, एक मिश्रण ट्रे, और इनपुट अभिकर्मकों के लिए एक इनपुट ट्रे। (ग) उपलब्ध डेक पदों को प्रदर्शित संख्याओं के साथ परिभाषित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ग्लिसरॉल मिश्रण के स्वचालित pipetting के लिए परिणाम. (क) लचीला वर्कस्टेशन डिजाइन तीन अलग-अलग सेटअपों के मूल्यांकन को सक्षम बनाता है (i) पुनरुत्पादक परिणामों के लिए इष्टतम पैरामीटरों की पहचान करने के लिए। (ii) सामग्री के टिप स्पर्श और हीटिंग के अतिरिक्त के परिणामस्वरूप प्रसरण (सीवी) मूल्यों का गुणांक कम हो गया और सेटअप 3 के लिए अत्यधिक पुनरुत्पादक मिश्रण हुआ। प्रत्येक प्रयोग 96 नमूनों के साथ किया गया था। (iii) एकल नमूना मानों की साजिश ने पिपेटिंग अनुक्रम पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया। (ख) कच्चे/स्तंभ अंतर, किनारों, या मास्टर मिश्रण पर प्रभाव की पहचान करने के लिए प्रत्येक सेटअप के प्रयोगात्मक परिणामों को गर्मी मानचित्रों के साथ विज़ुअलाइज़ किया गया था। (ग) सेटअप 3 की पुनरुत्पादकता का विश्लेषण (i) माध्यिका, मानक विचलन, सीवी मान और (ii) हीटमैप्स का उपयोग करके आठ स्वतंत्र रन के भीतर किया गया था। पैनल a-ii (n = 96) और b-i (n = 12) में डेटा को साधनों और एकल डेटा बिंदुओं के साथ प्रस्तुत किया जाता है। सांख्यिकीय महत्व को *******p < 0.0001 के रूप में परिभाषित किया गया था, जिसमें प्रसरण (एनोवा) के दो-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: हाइड्रोजेल के साथ कार्यों के मिश्रण के लिए परिणाम। (ए) एक जिलेटिन मेटाक्राइल (जेलएमए) 20% (डब्ल्यू / वी) स्टॉक समाधान से, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2, और 0% (डब्ल्यू / वी) का एक सीरियल कमजोर पड़ने का एक प्रयोगात्मक रन के भीतर 96 अच्छी तरह से प्लेट (एन = 12 प्रति एकाग्रता) का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। (i) प्रसरण गुणांक (सीवी) मान तैयार सांद्रता के दौरान 1.2% और 3.4% के बीच भिन्न होते हैं, और (ii) रैखिक प्रतिगमन ने 0.9869 के R² मान के साथ एक उच्च फिट दिखाया। (iii) उत्पन्न हीटमैप के साथ नेत्रहीन रूप से समरूप कमजोर पड़ने की पुष्टि की गई थी। (ख) डबल नेटवर्क हाइड्रोजेल 5% (डब्ल्यू /वी) गेलएमए, 2% (डब्ल्यू / वी) एल्जिनेट, और 0.15% (डब्ल्यू / वी) एलएपी (i) के साथ और बिना टिप टच (एन = 96 प्रत्येक सेटअप के लिए) के साथ और बिना के उत्पन्न किए गए थे और 400 एनएम पर 2.0 एमडब्ल्यू / सेमी 2 की तीव्रता के साथ 30 सेकंड के लिए क्रॉसलिंक किए गए थे। टिप स्पर्श के एकीकरण के परिणामस्वरूप सीवी मानों को 5.2% से 3.4% तक कम कर दिया गया। (ii,iii) हीटमैप टिप से अतिरिक्त सामग्री को हटाने के लिए टिप स्पर्श का उपयोग करते समय कम विचलन की पुष्टि करते हैं। पैनलों a-i और b-i में डेटा को साधनों और एकल डेटा बिंदुओं के साथ प्रस्तुत किया जाता है। सांख्यिकीय महत्व को *p < 0.05, ***p < 0.001, और *******p < 0.0001 के रूप में परिभाषित किया गया था, जो विचरण (एनोवा) के एक तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग करके 0.0001 था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: पिपेट प्रकार के अंतर और चिपचिपा biomaterials के साथ मुद्दों का सारांश. (ए) अभिकर्मक और पिस्टन को एक एयर कुशन द्वारा अलग किया जाता है जो वितरण चरणों के दौरान सिकुड़ता है और एस्पिरेटिंग चरणों के दौरान फैलता है। जब चिपचिपा सामग्री aspirating और वितरण, धीमी गति से 'प्रवाह' हवा के बुलबुले और अनियमित pipetting व्यवहार के रूप में समस्याओं का परिचय देता है। (ख) सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स टिप के अंदर पिस्टन के उपयोग से चिपचिपा सामग्री के विश्वसनीय एस्पिरेटिंग और वितरण को सक्षम करते हैं। (ग) अत्यधिक चिपचिपा पदार्थों (जैसे, 4% (डब्ल्यू / वी) एल्गिनेट) के पिपेटिंग के परिणामस्वरूप टिप पर अतिरिक्त सामग्री का संचय हो सकता है, जिससे पूरे प्रयोगों में अशुद्धि होती है। (घ) एक साधारण टिप टच ट्रे का कार्यान्वयन टिप पर अतिरिक्त सामग्री को हटाने में सक्षम बनाता है और परिणामस्वरूप सटीक एस्पिरेटिंग और वितरण वॉल्यूम होता है। यह एक टिप रैक कंटेनर पर रखे गए अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन के आंतरिक पक्ष का उपयोग करके महसूस किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सामग्री # 1 (स्टॉक एकाग्रता) सामग्री # 1 की अंतिम एकाग्रता सामग्री # 2 (स्टॉक एकाग्रता) सामग्री की अंतिम एकाग्रता # 2 सामग्री # 3 (स्टॉक एकाग्रता) सामग्री # 3 की अंतिम एकाग्रता Diluent (ऑरेंज जी काम समाधान) मिश्रण में अंतिम नारंगी जी एकाग्रता आकृति में प्रदर्शित
ग्लिसरॉल (85% (w / v)) 80% (w/v) पानी (1 mg/mL Orange G) 0.059 mg/mL चित्र 3a−c
GelMA (20% (w / v)) 0% (w/v) LAP (3% (w/v)) 0.15% (w/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 1 mg/mL चित्र 4a
GelMA (20% (w / v)) 2% (w/v) LAP (3% (w/v)) 0.15% (w/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0.85 mg/mL चित्र 4a
GelMA (20% (w / v)) 4% (w/v) LAP (3% (w/v)) 0.15% (w/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0.75 mg/mL चित्र 4a
GelMA (20% (w / v)) 6% (w/v) LAP (3% (w/v)) 0.15% (w/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0.65 mg/mL चित्र 4a
GelMA (20% (w / v)) 8% (w/v) LAP (3% (w/v)) 0.15% (w/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0.55 mg/mL चित्र 4a
GelMA (20% (w / v)) 10% (w/v) LAP (3% (w/v)) 0.15% (w/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0.45 mg/mL चित्र 4a
GelMA (20% (w / v)) 12% (w/v) LAP (3% (w/v)) 0.15% (w/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0.35 mg/mL चित्र 4a
GelMA (20% (w / v)) 14% (w/v) LAP (3% (w/v)) 0.15% (w/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0.25 mg/mL चित्र 4a
GelMA (20% (w / v)) 5% (w/v) Alginate (4% (w / v)) 2% (w/v) LAP (3% (w/v)) 0.15% (w/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0.2 mg/mL चित्रा 4b

तालिका 1: आयोजित प्रयोगों के लिए पैरामीटर अवलोकन।

प्रोटोकॉल चरण समस्या संभावित कारण घोल
1.1 सॉफ़्टवेयर स्थापित या अद्यतन नहीं किया जा सकता SD कार्ड पर डिस्क स्थान से बाहर चल रहा है SD कार्ड पर डिस्क स्थान की जाँच करें. यदि आवश्यक हो, तो अनावश्यक आइटम, खाली बिन निकालें, या उचित आकार के SD कार्ड का उपयोग करें
1.2 API स्थापित नहीं किया जा सकता स्थापना के लिए उपयोगकर्ता क्षमता प्रतिबंधित है (कोई रूट उपयोगकर्ता अनुमति नहीं) व्यवस्थापक अधिकार प्राप्त करने के लिए निर्दिष्ट आदेशों के सामने 'sudo' आदेश का उपयोग करें. लिनक्स में, इस तरह की पहुंच को सुपरयूज़र के रूप में जाना जाता है।
3.1 GelMA के साथ समस्याएं Functionalization, डायलिसिस या lyophilization Loessner et al.33 में उपलब्ध समस्या निवारण सूची सहित विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल.
5.1 और 6.2 कार्यस्थान आदेशों पर प्रतिक्रिया नहीं कर रहा है कनेक्शन समस्याएँ सब कुछ की बारी और कंप्यूटर बंद करो. 10 सेकंड के लिए बिजली की आपूर्ति बंद करें। पावर कंप्यूटर और कार्यस्थान वापस चालू करें।
5.1 और 6.2 कार्यस्थान आदेशों पर प्रतिक्रिया नहीं कर रहा है कनेक्शन समस्याएँ जाँचें कि क्या कंप्यूटर USB कनेक्शन को पहचान रहा है और USB पोर्ट ठीक से निर्धारित किया गया है। सुनिश्चित करें कि फ़ायरवॉल कनेक्शन प्रक्रिया को रोक नहीं रहा है (तालिका 2 के नीचे लिंक देखें)।
5.1 और 6.2 फ़ाइल नहीं खोल सकता गलत निर्देशिका यह सुनिश्चित करने के लिए कि सही पथ का उपयोग किया जा रहा है, निदेशक (फ़ोल्डर पथ) की जाँच करें. यदि कोई फ़ाइल (जैसे, interface.py) नहीं मिल सकती है, तो यह संभावना है कि गलत पथ का उपयोग किया जा रहा है।
6.6.2 युक्ति ठीक से संलग्न नहीं है या आंदोलन के दौरान गिर जाती है अंशांकन समस्या पिपेट के लिए अंशांकन चरणों को दोहराएं और सुनिश्चित करें कि केशिका पिस्टन पिपेट के साथ ठीक से जुड़ा हुआ है।
6.6.2 युक्ति ठीक से संलग्न नहीं है या आंदोलन के दौरान गिर जाती है अनुलग्नक समस्या पिपेट ठीक से पिपेट अक्ष से जुड़ा नहीं है और आंदोलन चरणों के दौरान चलता है। इसे रोकने के लिए शिकंजा मजबूती से कस लें।
6.6.2 टिप सामग्री के ऊपर aspirating है अंशांकन समस्या ऊंचाई को ठीक से परिभाषित करने के लिए इस ट्रे प्रकार का अंशांकन दोहराएँ.
6.6.2 टिप सामग्री के ऊपर aspirating है अंशांकन समस्या ट्यूब में वॉल्यूम की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि वॉल्यूम प्रोटोकॉल डिज़ाइनर अनुप्रयोग में परिभाषित वॉल्यूम के बराबर है।
6.6.2 सामग्री आंदोलन के दौरान डुबकी है टिप पर बहुत अधिक अतिरिक्त सामग्री टिप स्पर्श डॉक विकल्प जोड़ें; वैकल्पिक रूप से, टिप टच के लिए समय भी बढ़ाया जा सकता है।
6.6.2 सामग्री ठोस या pipetting के लिए बहुत चिपचिपा है सामग्री का थर्मोरेस्पॉन्सिव व्यवहार Thermoresponsive सामग्री लक्षण वर्णन की जाँच करें और तदनुसार तापमान डॉक के हीटिंग / शीतलन तापमान को समायोजित करें।
https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting

तालिका 2: पहचानी गई समस्याओं, संभावित कारणों के साथ-साथ समस्याओं को हल करने के लिए समाधान के साथ समस्या निवारण तालिका।

पूरक फ़ाइल. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

चिपचिपा सामग्री, विशेष रूप से बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए हाइड्रोजेल 19,20,21,33,47 के लिए पिपेटिंग, कई शोध प्रयोगशालाओं में एक उपयोगकर्ता-परिभाषित एकाग्रता या अलग-अलग सांद्रता के साथ एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला तैयार करने के लिए नियमित कार्य हैं। यद्यपि यह दोहरावदार है और निष्पादन बल्कि सरल है, यह ज्यादातर कम नमूना throughput18 के साथ मैन्युअल रूप से किया जाता है। यह ट्यूटोरियल एक ओपन सोर्स वर्कस्टेशन के संचालन को पेश कर रहा है, जिसे विशेष रूप से चिपचिपा सामग्री के लिए डिज़ाइन किया गया है, ताकि वांछित सांद्रता की पुनरुत्पादक पीढ़ी के लिए चिपचिपा सामग्री के स्वचालित मिश्रण को सक्षम किया जा सके। इस workstation hydrogels के pipetting के लिए अनुकूलित करने के लिए thermoresponsive सामग्री के लिए तापमान डॉक्स के एकीकरण द्वारा स्वचालित और अत्यधिक विश्वसनीय हैंडलिंग सक्षम करने के लिए, चिपचिपा सामग्री के लिए सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स, और टिप से अतिरिक्त सामग्री को हटाने के लिए एक वैकल्पिक टिप स्पर्श गोदी. पिपेटिंग मॉड्यूल को विशेष रूप से एक मानकीकृत और स्वचालित तरीके से चिपचिपा सामग्री के प्रसंस्करण को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया गया है। एयर कुशन पिपेट्स (चित्रा 5 ए) की तुलना में, सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स (चित्रा 5 बी) टिप में छोड़ी गई अवशिष्ट सामग्री को छोड़ने के बिना चिपचिपा सामग्री को वितरित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सटीक एस्पिरेटिंग और वितरण वॉल्यूम होते हैं। वैकल्पिक टिप टच डॉक टिप (चित्रा 5c, d) से अतिरिक्त नमूना सामग्री को हटा देता है, जो गोंद सामग्री (उदाहरण के लिए, 4% (w / v) alginate) के लिए उपयोगी है।

प्रोटोकॉल डिजाइनर आवेदन विशेष रूप से hydrogels के लिए क्रमादेशित किया गया है और विभिन्न सांद्रता और दो diluents तक के साथ चार अभिकर्मकों के लिए कमजोर पड़ने की अनुमति देता है। अंतिम dilutions की गणना में त्रुटियों का जोखिम इस आवेदन में रोका जाता है, क्योंकि उपयोगकर्ता केवल वांछित एकाग्रता या सीरियल कमजोर पड़ने वाले चरणों का चयन करते हैं। आवश्यक aspirating और वितरण वॉल्यूम स्वचालित रूप से परिकलित किए जाते हैं, एक अलग प्रलेखन पाठ फ़ाइल में सहेजे जाते हैं, और फिर प्रोटोकॉल स्क्रिप्ट में भर जाते हैं। यह प्रोटोकॉल डिजाइन एप्लिकेशन उपयोगकर्ता को सभी प्रयोगात्मक मापदंडों (जैसे, पिपेटिंग गति) का पूर्ण नियंत्रण देता है और महत्वपूर्ण मापदंडों के आंतरिक प्रलेखन को सुनिश्चित करता है। प्रोटोकॉल डिजाइन ऐप जलाशय के भरने के स्तर को ध्यान में रखता है (उदाहरण के लिए, अच्छी तरह से) और चिपचिपा सामग्री में अनावश्यक डुबकी को रोकने के लिए एस्पिरेशन / वितरण ऊंचाई को बदलता है। यह एकीकृत सुविधा टिप की बाहरी दीवार पर सामग्री संचय से बचती है, और इस प्रकार, पूरे प्रोटोकॉल में विश्वसनीय एस्पिरेटिंग और वितरण कार्यों को सुनिश्चित करती है। यद्यपि प्रोटोकॉल डिजाइनर एप्लिकेशन को हाइड्रोजेल कमजोर पड़ने के चरणों के लिए विकसित किया गया है, इसका उपयोग गैर-चिपचिपा तरल पदार्थों के कमजोर पड़ने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि ऑरेंज जी रंजक। प्रोटोकॉल डिजाइनर एप्लिकेशन, जो '/उदाहरण/प्रकाशन-JoVE' के तहत रिपॉजिटरी के माध्यम से सुलभ है, वह संस्करण है जिसे प्रोटोकॉल अनुभाग में समझाया गया है और वीडियो में हाइलाइट किया गया है। यह संस्करण अद्यतन नहीं किया जाएगा. हालांकि, प्रोटोकॉल डिज़ाइनर अनुप्रयोग का एक अद्यतन संस्करण मुख्य रिपॉजिटरी पृष्ठ के माध्यम से उपलब्ध है। अंशांकन टर्मिनल शुरू में Sanderson48 द्वारा विकसित किया गया था और सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स के अंशांकन के लिए अनुकूलित किया गया है।

जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग 4 में वर्णित है, पिपेट्स के साथ-साथ कंटेनरों को शुरू में कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। यह अंशांकन प्रक्रिया उन स्थितियों को परिभाषित करने और सहेजने के लिए महत्वपूर्ण है जो तब आंदोलन वृद्धि की गणना करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। इसलिए, सफल प्रोटोकॉल निष्पादन अच्छी तरह से परिभाषित अंशांकन स्थितियों पर निर्भर करता है, क्योंकि गलत अंशांकन बिंदुओं के परिणामस्वरूप टिप को कंटेनर में क्रैश किया जा सकता है। चूंकि पिपेट्स के प्लंजर पदों को मैन्युअल रूप से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए, इसलिए पिपेटिंग सटीकता और परिशुद्धता निष्पादित अंशांकन पर बहुत निर्भर करती है। ये अंशांकन प्रक्रियाएं पिपेटिंग मॉड्यूल के साथ उपयोगकर्ता अनुभव पर अत्यधिक निर्भर करती हैं, और इसलिए, उचित अंशांकन प्रक्रियाओं को सुनिश्चित करने के लिए शुरुआत में अनुभवी कर्मचारियों के साथ प्रशिक्षण की सिफारिश की जाती है। pipetting मॉड्यूल पर मैनुअल अंशांकन के अलावा, pipette ही सटीक pipetting सुनिश्चित करने के लिए कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। आईएसओ 8655 में निर्दिष्ट स्वीकृति मानदंडों को पूरा करने के लिए कम से कम हर 12 महीने में पिपेट्स को कैलिब्रेट करने की सिफारिश की जाती है। आंतरिक रूप से पिपेट अंशांकन का मूल्यांकन करने के लिए, सत्यापन और सत्यापन उपलब्ध हैं जैसा कि Stangegaard et al.16 द्वारा वर्णित है।

एक विश्वसनीय डेटा सेट की पीढ़ी के लिए, उच्च गुणवत्ता के अभिकर्मकों के साथ शुरू करना महत्वपूर्ण है। यह हाइड्रोजेल प्रसंस्करण कार्यों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि बैच-टू-बैच विविधताएं इस प्रोटोकॉल के भीतर उत्पन्न परिणामों को प्रभावित कर सकती हैं। बैच-टू-बैच विविधताओं के अलावा, छोटे वॉल्यूम की तैयारी में सूक्ष्म परिवर्तन भी संपत्ति के अंतर में योगदान कर सकते हैं। इसे रोकने के लिए, बड़े संस्करणों की तैयारी की सिफारिश की जाती है, जिसका उपयोग पूरे प्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

सत्यापन और सत्यापन प्रक्रियाएं विश्वसनीय मिश्रण की पहचान करने के लिए एक डाई के उपयोग पर निर्भर करती हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल ऑरेंज जी के आवेदन का वर्णन करता है, लेकिन सामान्य प्रोटोकॉल और विश्लेषण वर्कफ़्लो को फ्लोरोसेंट रंजक 49,50 के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। ऑरेंज जी का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की तकनीकी आवश्यकताओं को कम करता है और प्रकाश के संपर्क में आने के बाद फ्लोरोसेंट रंजक के ब्लीचिंग को रोकने के लिए बरती गई सावधानियों को समाप्त करता है। भंग व्यवहार या डाई के क्लस्टर गठन में मुद्दों को प्रयोगों के दौरान प्रस्तुत सामग्री के साथ नहीं देखा गया है, लेकिन अन्य सामग्रियों के साथ दिखाई दे सकता है। संभावित क्लस्टर गठन और इसलिए, डाई और सामग्री के बीच बातचीत को माइक्रोस्कोप के साथ आसानी से पता लगाया जा सकता है।

इस ट्यूटोरियल में प्रस्तुत प्रक्रियाओं और तकनीकों को कम से कम मानव श्रम के साथ अत्यधिक विश्वसनीय कार्यों को प्राप्त करने के लिए चिपचिपा सामग्री के लिए वर्तमान वर्कफ़्लो में स्वचालन क्षमता जोड़ते हैं। प्रदान की गई समस्या निवारण तालिका (तालिका 2) में पहचानी गई समस्याएं शामिल हैं और समस्याओं को हल करने के लिए संभावित कारणों के साथ-साथ समाधान प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तुत वर्कस्टेशन को स्वचालित पिपेटिंग कार्यों के लिए प्राकृतिक (जिलेटिन, गेलन गम, मैट्रिगेल) और सिंथेटिक (जैसे, पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) [पीईजी], प्लुरोनिक एफ 127, ल्यूट्रोल एफ 127) बहुलक सामग्री पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है। विशेष रूप से, एक ओपन सोर्स वर्कस्टेशन और चिपचिपा सामग्री के लिए डिज़ाइन किए गए एक ओपन सोर्स प्रोटोकॉल डिज़ाइन एप्लिकेशन का संयोजन बायोमेडिकल इंजीनियरिंग, सामग्री विज्ञान और माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में काम करने वाले शोधकर्ताओं के लिए बहुत उपयोगी होगा।

Disclosures

मुख्यमंत्री और DWH Gelomics Pty Ltd के संस्थापक और शेयरधारक हैं। मुख्यमंत्री Gelomics Pty Ltd के निदेशक भी हैं। लेखकइस लेख के विषय के लिए प्रासंगिक हितों का कोई संघर्ष घोषित नहीं करते हैं। लेखकों के पास किसी भी संगठन या इकाई के साथ कोई अन्य प्रासंगिक संबद्धता या वित्तीय भागीदारी नहीं है, जिसमें वित्तीय हित या लेख में चर्चा की गई विषय वस्तु या सामग्री के साथ वित्तीय संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने क्यूयूटी में पुनर्योजी चिकित्सा में केंद्र के सदस्यों को स्वीकार किया, विशेष रूप से, एंटोनिया होर्स्ट और पावेल मिज़ज़ज़नेक उनके सहायक सुझावों और प्रतिक्रिया के लिए। इस काम को एसई के लिए क्यूयूटी के स्नातकोत्तर अनुसंधान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था, और अनुदान समझौते IC160100026 (Additive Biomanufacturing में ARC औद्योगिक परिवर्तन प्रशिक्षण केंद्र) के तहत ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (एआरसी) द्वारा समर्थित था। एनबी को एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी) पीटर डोहर्टी अर्ली करियर रिसर्च फैलोशिप (APP1091734) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 reaction tubes Fisher Scientific, Inc. (USA) 14-959-53A
5 mL tubes Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) SCT-5ML size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name
50 mL reaction tubes Fisher Scientific, Inc. (USA) 14-432-22
70% w/w Ethanol LabChem, Inc. (USA) aja726-5Lpl
96-well plate Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055
Alginate NovaMatrix 4200001 https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/
Demineralized or ultrapure (MilliQ) water
Gelatin methacryloyl (GelMA) Synthetized in-house detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma-Aldrich, Inc. (USA) 900889
M4 and M5 Allen key OpenBuilds, inc. (USA) 179, 190 also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/
OrangeG Fisher Scientific (USA) O267-25 https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) 14190-144 alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)
Equipment
Aluminium blocks for temperature dock Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) SB16 blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html
Analytical balance Sartorius AG (Germany) ED224S
Open source liquid handling robot: commercial product Opentrons Laboratories, Inc. (USA) OT-One S Pro https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro
Open source liquid handling robot: open source hardware Assembled in-house following an open source approach hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24
Positive displacement pipette: MicromanE Gilson, Inc. (USA) FD10006 depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html
Spectrophotometer BMG LABTECH GmbH (Germany) CLARIOstar
Tips: capillary pistons Gilson, Inc. (USA) F148180 depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191

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References

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एक स्वचालित और मानकीकृत फैशन में हाइड्रोजेल-आधारित 3 डी संस्कृति मॉडल के निर्माण के लिए एक ओपन सोर्स टेक्नोलॉजी प्लेटफॉर्म
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Eggert, S., Kahl, M., Kent, R., Gaats, L., Bock, N., Meinert, C., Hutmacher, D. W. An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion. J. Vis. Exp. (181), e61261, doi:10.3791/61261 (2022).

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