Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Published: October 13, 2020 doi: 10.3791/61799
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

Summary

Bu protokol, gelişmiş özellik ekstraksiyonu ve biyoinformatik analiz yazılımı ile birlikte sıvı kromatografi kütle spektrometresi kullanılarak peptidoglikan bileşiminin ayrıntılı bir analizini kapsar.

Abstract

Peptidoglikan, bakteriyel hücre duvarlarının önemli bir bileşenidir ve antimikrobiyaller için ortak bir hücresel hedeftir. Peptidoglikan yapısının yönleri tüm bakterilerde oldukça korunmuş olsa da, Gram-pozitifler / negatifler arasında ve türler arasında da önemli farklılıklar vardır. Ek olarak, büyüme fazına ve / veya çevresel uyaranlara yanıt olarak bir bakteri türünde meydana gelebilecek peptidoglikan için bilinen çok sayıda varyasyon, modifikasyon veya adaptasyon vardır. Bu varyasyonlar, büyüme / bölünme, antibiyotik direnci ve konakçı savunmasından kaçınma dahil olmak üzere birçok hücresel fonksiyona katıldığı bilinen oldukça dinamik bir yapı üretir. Peptidoglikan içindeki varyasyonu anlamak için, genel yapı kurucu parçalarına (muropeptitler olarak bilinir) ayrılmalı ve genel hücresel kompozisyon için değerlendirilmelidir. Peptidoglycomics, peptidoglikan kompozisyonunu ince ayrıntılarla incelemek için yüksek güçlü biyoinformatik veri analizi ile birlikte gelişmiş kütle spektrometresi kullanır. Aşağıdaki protokol, peptidoglikanın bakteri kültürlerinden saflaştırılmasını, bir sıvı kromatograf - kütle spektrometresi aracılığıyla muropeptid yoğunluk verilerinin elde edilmesini ve biyoinformatik kullanılarak peptidoglikan bileşiminin diferansiyel analizini açıklamaktadır.

Introduction

Peptidoglikan (PG), proteinler ve diğer hücresel bileşenler için yapısal destek sağlarken, hücre morfolojisini korumaya yarayan bakterilerin tanımlayıcı bir özelliğidir 1,2. PG'nin omurgası alternatif β-1,4'e bağlı N-asetil muramik asit (MurNAc) ve N-asetil glukozamin (GlcNAc)1,2'den oluşur. Her MurNAc, bitişik disakkarit bağlantılı peptitlere çapraz bağlanabilen ᴅ-laktil kalıntısına bağlı kısa bir peptide sahiptir (Şekil 1A, B). Bu çapraz bağlama, tüm hücreyi kapsayan ve genellikle sakkül olarak adlandırılan ağ benzeri bir yapı üretir (Şekil 1C). PG sentezi sırasında, öncüller sitoplazmada üretilir ve sitoplazmik membran boyunca flippaslar tarafından taşınır. Öncüller daha sonra sırasıyla glikosidik ve peptid bağlarını üreten transglikozilaz ve transpeptidaz enzimleri tarafından olgun PG'ye dahil edilir3. Bununla birlikte, bir kez monte edildikten sonra, büyüme ve bölünme de dahil olmak üzere bir dizi hücresel işlemi gerçekleştirmek için PG'yi değiştiren ve / veya bozan bakteriler tarafından üretilen çok sayıda enzim vardır. Ek olarak, PG'nin çeşitli modifikasyonlarının, hücre sinyalizasyonu, antimikrobiyal direnç ve konakçı immün kaçınma4 ile ilişkili olan suş, büyüme koşulları ve çevresel strese özgü adaptasyonlar sağladığı gösterilmiştir. Örnek olarak, yaygın bir modifikasyon, MurNAc üzerine, PG 4,5,6'yı bozan konakçı tarafından üretilen lizozim enzimlerine glikan β-1,4 bağlantılarına erişimi sınırlayarak direnç kazandıran bir C6 asetil grubunun eklenmesidir. Enterokoklarda, peptit yan zincirinin ᴅ-Ala terminalinin ᴅ-Lac ile değiştirilmesi, antimikrobiyal, vankomisin 7,8'e karşı daha büyük bir direnç sağlar.

PG izolasyonu ve saflaştırma için genel prosedür, 1960'larda tanımlandığından beri nispeten değişmeden kalmıştır9. Bakteriyel membranlar SDS ile ısıl işlemle çözülür, ardından bağlı proteinlerin, glikolipidlerin ve kalan DNA'nın enzimatik olarak uzaklaştırılması sağlanır. Saflaştırılmış bozulmamış sakkül daha sonra GlcNAc ve MurNAc arasındaki β-1,4 bağlantısının hidrolizi ile bireysel bileşenlere sindirilebilir. Bu sindirim, herhangi bir yapısal modifikasyon ve / veya çapraz bağ bozulmadan GlcNAc-MurNAc disakkaritleri üretir ve muropeptitler olarak adlandırılır (Şekil 1B).

PG'nin bileşimsel analizi başlangıçta her bir muropeptidi saflaştırmak için yüksek basınçlı sıvı kromatografik separasyonu (HPLC) yoluyla gerçekleştirildi ve ardından muropeptitlerin manuel olarak tanımlanması10,11 yapıldı. O zamandan beri bunun yerini, algılama hassasiyetini artıran ve her bir muropeptidi saflaştırmanın manuel iş yükünü azaltan sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi (LC-MS) almıştır. Bununla birlikte, muropeptitlerin manuel olarak tanımlanmasının zaman alıcı ve karmaşık doğası, yapılan çalışmaların sayısını azaltarak sınırlayıcı bir faktör olarak kalmıştır. Son yıllarda "omik" teknolojilerin ortaya çıkmasıyla birlikte, otomatik LC-MS özellik ekstraksiyonu, çok büyük veri kümelerinden karmaşık örneklerdeki bireysel bileşiklerin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan güçlü bir araç haline gelmiştir. Özellikler tanımlandıktan sonra, biyoinformatik yazılım, karmaşık veri kümesi arasındaki minimum farklılıkları bile izole eden ve bunları kullanıcıya grafiksel olarak görüntüleyen diferansiyel analiz kullanarak örnekler arasındaki varyasyonu istatistiksel olarak karşılaştırır. PG kompozisyonunun analizi için özellik ekstraksiyon yazılımının uygulanması daha yeni keşfedilmeye başlanmıştır 12,13,14 ve biyoinformatik analiz 12 ile birleştirilmiştir. Tam otomatik tanımlamaya izin veren peptid parçalanmasını öngören hazır protein veritabanlarından yararlanan proteomik analizin aksine, peptidoglycomics için şu anda parçalanma kütüphanesi yoktur. Bununla birlikte, özellik ekstraksiyonu, muropeptid tanımlamasını tahmin etmek için bilinen ve tahmin edilen yapısal veritabanlarıyla birleştirilebilir12. Burada, PG kompozisyonunun otomatik tanımlanması ve biyoinformatik diferansiyel analizi için bir muropeptid kütüphanesi ile birlikte LC-MS tabanlı özellik ekstraksiyonunun kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz (Şekil 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Peptidoglikan numune hazırlama

  1. Bakteri kültürlerinin büyümesi
    NOT: Bakteri kültürlerinin büyümesi, bakteri türlerine ve incelenen büyüme koşullarına bağlı olarak değişecektir. Test edilecek deneysel parametreler büyüme koşullarını tanımlayacaktır.
    1. Bakteri suşu ve deneysel tasarım için gerekli büyüme koşulları altında bakteri kültürleri yetiştirin. Bakterileri üçlü kültürler (biyolojik kopyalar) olarak, yani suş veya büyüme koşulu başına üç ayrı koloni olarak büyütün.
      NOT: Büyüme koşullarının ve büyüme fazının PG bileşimi 1,2,10 üzerinde önemli etkileri olduğu bilinmektedir. Kompozisyon değişikliklerinin deneysel hatadan değil, deneysel parametrelerden kaynaklandığından emin olmak için kültürler ve kopyalar arasındaki tutarlılığı korumak için büyük özen gösterilmelidir.
    2. Kültürü hızla 4 °C'ye soğutun, santrifüjleme ile toplayın (11.000 x g, 10 dakika, 4 °C) ve hücre peletini -20 °C'de dondurun. Donmadan önce hücre peletini önceden soğutulmuş 4 °C, 20 mM sodyum fosfat pH 6.5 ile yıkayın. Dondurulmuş hücre peletinin üretimi, toplama işlemi sırasında PG'yi değiştirebilecek ve / veya bozabilecek enzimlerin aktivitesini sınırlamak için numuneler arasında mümkün olduğunca hızlı ve tutarlı bir şekilde yapılmalıdır. Numuneler donmadan doğrudan ekstraksiyon işlemi (bölüm 1.2) yoluyla işlenebilir; Ancak, tüm numunelerin benzer şekilde işlendiğinden emin olun.
      NOT: Daha sonraki adımlar için yeterli ürün sağlamak için, önemli büyüklükte bir ıslak hücreli pelet kullanılır. Bu, tekrarlayan yıkama adımları (bölüm 1.2.5 ve 1.2.14) sırasında önemli bir ürün kaybı olmadan kolayca görselleştirilen ve bakımı yapılan yeterince büyük bir sakkül pelet üretir. Bakteri ve büyüme koşullarına bağlı olarak, bu verim muhtemelen değişecektir. Gram-negatif bakteri Pseudomonas aeruginosa, PAO1 için, 0.5 OD600 kültürünün 4 L'si 3-4 g'lık bir hücre peleti üretti ve ~ 10 mg saflaştırılmış sakkül üretmek için yeterliydi (bölüm 1.2.17)12. Bu, LC-MS için gerekli olandan çok daha fazla miktarda sakküldür (bölüm 2); ancak, ölçüm doğruluğuna (bölüm 1.2.17) ve normalleştirmeye (bölüm 1.3) yardımcı olacaktır.
  2. Peptidoglikan sakkül ekstraksiyonu
    NOT: PG'nin ekstraksiyonu için protokol ref'den uyarlanmıştır.9,11,15. Bu protokol, PG'yi bireysel bakteri hücrelerinden, diğer hücresel bileşenlerden arındırılmış bir bütün olarak çıkaracaktır. Protokol, Gram-negatif veya Gram-pozitif bakterilerle kullanılabilir. Bununla birlikte, Gram-pozitif hücreler için, daha kalın PG yapısını izole etmek ve hücre duvarı ile ilişkili polimerleri çıkarmak için ayarlamalar gerekli olabilir; teikoik asitler gibi.
    1. Dondurulmuş hücre peletlerini, 20 mM sodyum fosfat pH 6.5'lik orijinal kültür hacminin yaklaşık 1:10'unda yeniden askıya alın. Bu adımı 4 °C'de gerçekleştirin (11,12 mL tampon başına 1-8 mg ıslak hücre pelet ağırlığı olabilir).
      NOT: PG'nin asetilasyon durumunu korumak için, 6,5 veya daha düşük bir pH15,16 gereklidir.
    2. Son 1:1 hacim için kaynar %8 sodyum dodesil sülfat (SDS) 20 mM sodyum fosfat pH 6,5'e hücre süspansiyonunu damla damla ekleyin (yani, nihai konsantrasyon %4 SDS'dir), su soğutmalı bir kondenserle donatılmış yuvarlak tabanlı bir şişede hafifçe karıştırın. (Şekil 2, adım 2)
    3. Tam membran ayrışmasını sağlamak için karıştırarak 30 dakika ila 3 saat boyunca hafifçe kaynatın. Elde edilen karışımın, kalan hücre kümeleri veya viskozitesi olmadan tamamen berrak olduğundan emin olun. Tam ayrışmayı garanti etmek için daha uzun kaynama tercih edilir.
    4. Oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Numune gece boyunca oda sıcaklığında bırakılabilir.
      NOT: SDS mevcut olduğunda, SDS'yi çözelti içinde tutmak için numuneleri oda sıcaklığında tutun.
    5. Sakkülü'yü 25 ° C'de 40 dakika boyunca 70.000 x g'de ultra santrifüjleme yoluyla pelet olarak toplayın (veya sakuliyi tamamen çökeltmek için gereken süre).
    6. Sakkuliyi ardışık ultrasantrifüjleme (bölüm 1.2.5) ve ~ 50 mL oda sıcaklığında süspansiyon ile tekrar tekrar yıkayın, 20 mM sodyum fosfat pH 6.5, yıkama tamponu ~% 0.001'lik bir SDS konsantrasyonuna sahip olana kadar. Tipik olarak, 5 ila 7 yıkama yeterlidir.
      NOT: Yıkama tamponunda kalan SDS'nin konsantrasyonunu test etmek için, kolorimetrik boya olan Stains-all17'yi kullanın.
    7. Sakkuliyi 5-10 mL oda sıcaklığında, 20 mM sodyum fosfatta, pH 6.5'te tekrar askıya alın.
    8. Kümeleri dağıtmak için numuneyi oda sıcaklığında kısaca (~% 40, 50 W, 20 kHz, 20 s) sonikleştirin.
      NOT: Genişletilmiş sonikasyon mekanik olarak PG yapısınınkesilmesine neden olacaktır 18.
    9. Numuneyi her biri 50 μg / mL, amilaz, DNaz ve RNaz, 10 mM magnezyum sülfat ile destekleyin ve ajitasyon veya nutasyon ile 1 saat boyunca 37 ° C'de sindirin.
      NOT: Amilaz sindirimi, sakkül11 içinde sıkışmış kalan glikojenleri giderir.
    10. 100 μg / mL pronaz ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de ajitasyon veya nutasyon ve ~% 0.02 sodyum azid ile sindirin.
      NOT: Pronaz sindirimi, eklenen enzimleri (bölüm 1.2.9'dan) ve PG'ye kovalent olarak bağlı olan lipoproteinleri uzaklaştırır.
      DİKKAT: Sodyum azid oldukça toksiktir ve uygun kullanım/bertaraf yöntemleri gerektirir.
    11. Sodyum azidi gidermek için 25 ° C'de 40 dakika boyunca 70.000 x g'de ultrasantrifüj (veya tamamen tortu sacculi için gereken süre).
    12. Peletin 25 mL'sinde %2 SDS 20 mM sodyum fosfat pH 6.5'te tekrar askıya alın.
    13. Bir buharlı pişiricide veya su soğutmalı kondenserli yuvarlak tabanlı şişede 1 saat kaynatın (bölüm 1.2.2).
      NOT: İkinci SDS kaynatma adımı, kalan tüm proteinleri ve kirleticileri sakulden uzaklaştırır.
    14. Sakküli yıkamayı (bölüm 1.2.6) ~50 mL oda sıcaklığında çift damıtılmış su (ddH2O) ile SDS konsantrasyonu ~% 0.001 olana kadar tekrarlayın.
    15. Sakuli'yi askıya almak için peleti yeterli miktarda ddH2O ile tekrar askıya alın, ayrıca kabı yıkayın (örneğin, 25 mL) ve gece boyunca -80 ° C'de dondurun. Numune bir sonraki adımda liyofilize edileceği için hacim değişebilir, ancak daha küçük hacimler liyofilize etmek için daha az zaman gerektirir.
    16. Ertesi gün, süspansiyonu liyofilize edin ve oda sıcaklığında saklayın.
    17. Analitik terazide elde edilen liyofilize sakkül miktarını ölçün.
    18. Sakkuliyi ddH2O ila 10 mg / mL arasında seyreltin ve daha fazla analizden önce kümeleri parçalamak için kısaca sonikleştirin.
  3. Saflaştırılmış peptidoglikanın miktarının belirlenmesi
    1. Diferansiyel analiz sırasında kütle spesifikasyon verilerinin eşitlendiğinden emin olmak için bölüm 1.2.18'deki saflaştırılmış sakkuli miktarını ölçmek (bölüm 3.2). Referans15'te özetlenen ayrıntılı metodolojiyi izleyin.
      NOT: Saflaştırılmış sakkül (bölüm 1.2.18), asit hidrolizi ile ayrı ayrı şeker ve amino asit bileşenlerine ayrılır. Tek tek bileşenler, darbeli-amperometrik algılama kullanılarak anyon değişim kromatografisi ile ayrılır ve ölçülür. PG'nin yapısı göz önüne alındığında (Şekil 1), bireysel muropeptitler tek bir MurNAc ve tek bir GlcNAc kalıntısından oluşur. Bu nedenle, her iki kalıntının konsantrasyonunun ölçülmesi, numune içindeki muropeptitlerin 1: 1 miktarını temsil eder. MurNAc, kromatografi16 sırasında diğer PG bileşenlerinden temiz pik ayrımı nedeniyle tercih edilir.

2. Kütle spektrometresi veri toplama

  1. Kütle spektrometrisi için muropeptitlerin hazırlanması
    1. 100 μg reaksiyonda 100 μg / mL mutanolizin, 100 mM amonyum asetat pH 5.5 ve 50 mM magnezyum klorür ile 800 μg saflaştırılmış sakkuli takviyesi yapın.
    2. Gece boyunca 37 ° C'de sindirin.
    3. 1:1 hacim 0.5 M borat tampon pH 9.0 ekleyin ve ~ 10 mg / mL sodyum borohidrit (NaBH4) ile takviye edin.
      NOT: α ve β anomerik formlar arasında siklik şekerlerin mutarotasyonu, muropeptitlerin sıvı kromatografisinin ayrılması sırasında çoklu pik oluşumlarına neden olacaktır. NaBH4 ile tedavi, MurNAc'yi muramitol11'e indirgeyerek iki form arasındaki dönüşümü ortadan kaldırır. İşlem, 1,6-anhydro MurNAc veya 1,4'e bağlı şeker kalıntılarını azaltmaz.
      DİKKAT: NaBH4'ün reaksiyonu az miktarda hidrojen gazı üretir. NaBH4 reaksiyonu kabarcıklar oluşturacaktır ve gazın kaçmasına izin vermek için mikrofüj tüpleri açık tutulmalıdır.
    4. Numuneyi oda sıcaklığında ~ 20-30 dakika inkübe edin.
    5. Numuneyi mikrofüj tüpüne yerleştirmek ve kabarcıkları çıkarmak için kısaca santrifüjleyin.
    6. 5 μL'lik artışlarla eklenen 1:5 fosforik asit kullanarak pH'ı <4,0'a ayarlayın. Turnusol pH test şeritlerini kullanarak pH'ı test edin.
    7. Kalan çözünmeyen malzemeleri çökeltmek için 1 dakika boyunca ~ 17.000 x g'de santrifüj.
    8. 0,2 μm mikrosantrifüj filtreler kullanarak filtreleyin.
    9. Numuneler, herhangi bir partikülün MS'e enjekte edilmemesini sağlamak için LC-MS'e enjeksiyondan önce 30.000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edilir.
  2. LC-MS kurulumu
    1. Yüzeysel olarak gözenekli bir C18 parçacık sütununu (100 mm x 2,1 mm, gözenek boyutu <3 μm), minimum dört ondalık nokta m/z algılama doğruluğuna sahip bir Quadrupole-Time of Flight (QTOF) kütle spektrometresine takın.
    2. Muropeptitlerin sıvı kromatografisi ayrımını gerçekleştirin
      NOT: Her biyolojik üçlü (bölüm 1.1.1) LC-MS'den (bölüm 2.2.2 ila 2.2.3) üç kez (teknik üçlü) geçirilmelidir. Bu nedenle, test edilen her koşulda toplam dokuz LC-MS veri dosyası bulunur. Veri toplama, ticari olarak temin edilebilen yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz. Bununla birlikte, satın alma yazılımı MS makinelerine göre seçilmelidir. Aşağıda, MS'yi bu protokolü çalıştırmaya özgü parametrelerle ayarlamak için bir kılavuz gösterilmektedir. Ayrıntılı bir açıklama için lütfen üreticinin el kitabına bakın.
      1. Kromatografik ayırma için, aşağıdaki çözücüleri% 0.1 formik asit (A) ve% 0.1 formik asit (B) ile asetonitril hazırlayın.
      2. Aşağıdaki parametreleri kullanarak kromatografik ayırma için bir yöntem ayarlayın.
      3. Akış hızını 0,4 mL/dak olarak ayarlayın.
      4. Sütunu %2 B'de (~24 sütun hacmi) 10 dakika koşullandırın.
      5. Bir otomatik numune alma cihazı kullanarak, bölüm 2.1.9'dan 10 μL numune enjekte edin.
        NOT: Veri toplamaya başlamadan önce LC-MS protokolü aracılığıyla bir başlangıç örneği çalıştırın. Bu çalıştırma veriler için değil, sonraki tüm çalıştırmalar için bekletme süresi tekrarlanabilirliğini artırmak için kullanılır. Kütle-yük oranı (m/z ) piklerinin doğru tanımlanması ve gruplandırılması için spektral işleme sırasında (bölüm 3.1) tutma süresinin tekrarlanabilirliği gereklidir.
      6. Muropeptitleri 5 dakika boyunca% 2 B kullanarak ayırın (~ 12 sütun hacmi), daha sonra 13 dakika içinde% 15 B'ye (~ 30 sütun hacmi), 10 dakika içinde% 50 B'ye (~ 24 sütun hacmi) yükseltin ve son olarak 2 dakika içinde% 98 B'ye (~ 5 sütun hacmi) yükseltin.
        NOT: Degradenin ilk 2 dakikasını ve son 5 dakikasını atın (çöpe gönderin).
      7. 6 dakika (~14 sütun hacmi) ve 20 dakika (~47 sütun hacmi) yeniden dengeleme için %98 B'de bir kolon yıkama ile bitirin.
    3. Muropeptitlerin kütle spektrometresi tespitini gerçekleştirin
      1. MS üreticisinin talimatlarını izleyerek LC-MS referans kütle standartlarını içeren asetonitrilde bir ayar karışımı kullanarak kütle eksenini pozitif modda kalibre edin.
        NOT: MS, kromatografik çalışmaların başlamasından önce ayarlanır (bölüm 2.2.2.1).
      2. Aşağıdaki parametreleri kullanarak MS veri toplama için bir yöntem ayarlayın.
        NOT: MS ve MS/MS verileri, muropeptitlerin kromatografik ayrımı (bölüm 2.2.2.4 ve 2.2.2.5) ile eş zamanlı olarak (bölüm 2.2.3.2 ila 2.2.3.6) toplanır. Hem kromatografik hem de MS parametreleri (bölüm 2.2.2.2 ve 2.2.3.2), birden fazla numuneyi sırayla çalıştırmak için bir iş listesinin kurulumu sırasında eklenen tek bir yöntemdir.
      3. Elektrosprey kılcal voltajını 4,0 kV'a ve kurutma gazı sıcaklığını 13 L/dak akış hızıyla 350°C'ye ayarlayın.
        NOT: Azot (saflık >%99), tüm kütle spektrometrisi veri toplama sırasında nebülizasyon, kurutma ve çarpışma gazı olarak kullanılmalıdır.
      4. Nebülizatör basıncını 40 psi'ye ayarlayın ve parçalayıcıyı 150 V'a ayarlayın.
      5. Nozul, sıyırıcı ve oktapol RF voltajlarını sırasıyla 1000 V, 65 V ve 750 V olarak ayarlayın.
      6. Tarama aralığını 4 GHz (genişletilmiş dinamik aralık) pozitif iyon modunda 300–2.000 m/z olarak ayarlayın.
      7. 1 spektrum/saniyelik MS ve MS/MS tarama hızıyla veriye bağımlı MS/MS alımını kullanarak veri toplamayı ayarlayın. Döngü başına beş öncü kütleyi, tek, iki ve üçlü yüklü sırayla seçin.
      8. MS/MS parçalanma çarpışma enerjilerini 15, 20 ve 30 eV'ye ayarlayın.

3. Muropeptid bolluğunun diferansiyel analizi

  1. LC-MS kromatogram spektral işleme
    NOT: Özyinelemeli özellik ayıklama, ticari olarak temin edilebilen yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz. Diğer özellik çıkarma yazılımları kullanılabilir. Bununla birlikte, diğer yazılımlar son derece sağlam özyinelemeli ayıklamayı gerçekleştirmek için ek manuel veri işleme gerektirebilir. Çeşitli yazılımlar terminoloji özelliğini, varlığı ve bileşiği neredeyse birbirinin yerine kullanır. PG analizi için, hepsi bireysel bir muropeptidin LC-MS iyon kromatogramı temsilcisinin tanımlanmasına atıfta bulunur (örneğin, Şekil 3). Spektral işleme sırasında (bölüm 3.1), bir özellik, tek bir bileşik etiketi altında bir araya getirilen tek bir muropeptitin çoklu olası iyon türlerini kapsayan çoklu m / z zirvelerini temsil eder.
    1. Dosya altında, yeni bir proje başlatın.
    2. LC-MS QTOF veri dosyalarını ekleyin ve bireysel veri dosyalarını deneysel bir koşula/gruba, örneğin iki farklı büyüme koşuluna atayın.
    3. Veri işleme sihirbazı Toplu özyinelemeli özellik ayıklama (küçük moleküller/peptitler) uygulamasını çalıştırın ve bireysel muropeptitleri temsil eden m/z piklerini doğru bir şekilde tanımlamak, gruplandırmak ve doğrulamak için veri işleme filtrelerini LC-MS koşullarının ve enstrümantasyonunun parametreleriyle eşleşecek şekilde ayarlayın. Kromatografardan, başlangıç filtre parametrelerini ayarlamak için tutma süresi sürüklenmesini ve bilinen benzer piklerin m / z varyasyonunu inceleyin.
      NOT: Özyinelemeli özellik ayıklama, tüm veri dosyalarında kromatogram özelliklerini (m/z tepe noktaları) tanımlamak ve hizalamak için başlangıçta hedeflenmemiş bir moleküler özellik çıkarma algoritması kullanır. Oluşturulduktan sonra, bu özellikler, tanımlanan özelliklerin güvenilirliğini ve doğruluğunu artırmak için hedeflenen bir moleküler özellik çıkarma algoritması ile orijinal veri dosyalarını (özyinelemeli) yeniden değerlendirmek için kullanılır. İlk hedefsiz ayıklamayı dar bir algılama penceresiyle ayarlamak ve ilk ayıklamada eksik olabilecek tüm veri dosyalarındaki tepe noktalarını belirlemek üzere özyinelemeli ayıklama için daha geniş algılama parametreleri kullanmak en iyisidir. Özyinelemeli özellik ayıklamanın çalıştırılması, örnek sayısına, verilerin karmaşıklığına ve mevcut bilgisayar donanımına bağlı olarak saatler sürebilir
    4. Özellik ayıklama sonuçlarını gözden geçirin. Bir grupta önemli sayıda özellik hizalanamadıysa, algılama penceresini gerektiği gibi genişletmek/kısıtlamak için özyinelemeli filtreleme parametrelerini ayarlayın. Bunu başarmak için, özellik algılamanın tüm veri dosyalarında benzer şekilde gerçekleştirildiğinden emin olmak için ayıklanan her özelliğin kromatogramını ve izotopik profilini inceleyin. Ayrıca, bir veri dosyasında tanımlanan her özellik için puanı, uyarıları ve özelliğin seçilen filtre parametrelerini geçip geçmediğini inceleyin.
      NOT: Algılama pencerelerinin, farklı özelliklerin yanlışlıkla birlikte gruplandırılmaması için yeterince dar tutulmasına özen gösterilmelidir. Bu genellikle veri dosyaları arasındaki farklı izotopik profiller veya önemli m / z / tutma süresi varyasyonları ile not edilir. Tersine, benzer m/z ve bekletme sürelerine sahip birden fazla özellik varsa, filtre parametrelerinin çok katı olması ve bir MS zirvesinin iki özelliğe bölünmesi mümkündür. Bu nedenle, bu özelliklerin daha iyi gruplandırılmasını sağlamak için özellik ayıklamayı (bölüm 3.1.3) ayarlanmış bekletme süresi filtre parametreleriyle yeniden çalıştırın. En düşük bolluk zirvelerinin görselleştirilmesi, kullanılan filtrelerin (bölüm 3.1.3) arka plan gürültüsünün üzerindeki zirveleri doğru bir şekilde tanımlayıp tanımlamadığını gösterir. En düşük bolluk zirveleri arka plana benzer görünüyorsa, özellik ayıklamayı yeni arka plan filtresi parametreleriyle yeniden çalıştırın.
    5. Verileri bileşik değişim dosyası (.cef) (istatistiksel yazılım programıyla uyumlu bir biçim) veya her örnek için her özelliğin kütlesini, saklama süresini ve bolluğunu içeren sütunla ayrılmış bir dosya (.csv) olarak dışa aktarın.
  2. Spektral özelliklerin diferansiyel analizi
    NOT: Diferansiyel analiz, ticari olarak temin edilebilen yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz. Diğer biyoinformatik yazılımlar kullanılabilir.
    1. Programı açın ve talimat verildiğinde yeni bir proje başlatın.
    2. Veri içe aktarma ve veri analizi için yönergeleri izleyin. Verileri içe aktarma sırasında, özellik ayıklanan dosyaları yükleyin (bölüm 3.1). Veri analizi sırasında, diferansiyel analiz için anlamlılığı seçin ve değişikliği katlayın ve verileri tüm veri dosyalarındaki medyan yoğunluğa göre temel almayı seçin. Herhangi bir veri filtresi ayarlamayın (eğer bu önceki spektrum işleme adımında (bölüm 3.1) yapıldıysa), filtreleri tekrar uygulamak sağlam özyinelemeli özellik ayıklamayı olumsuz yönde etkiler. Bununla birlikte, özellik çıkarmaya benzer şekilde, diferansiyel analiz, LC-MS veri koleksiyonundaki sapma nedeniyle kütle (m / z) ve tutma süresine göre hizalanmalıdır. Özellik ayıklamada belirlenen parametreleri kullanın (bölüm 3.1).
      NOT: Varyasyonların sakkoli saflaştırmasındaki değişikliklerden değil, deneysel parametrelerden kaynaklandığından emin olmak için muropeptid kantitasyonunu (bölüm 1.3) kullanarak veri dosyaları arasında normalleştirin (bölüm 1.2). Her veri dosyasını numune MurNAc konsantrasyonundaki farklılıklara göre ayarlamak için harici ölçekleyici seçeneğini kullanın.
    3. Analiz tamamlandıktan sonra, test edilen deneysel koşullar arasında önemli bir bolluk değişikliği gösteren muropeptitleri tanımlamak için elde edilen grafik ve istatistiksel analizleri inceleyin.
    4. Proje gezgininin altında, çeşitli analizlere sağ tıklayın ve özellik ayrıntılarını, her özellik için m/z, bekletme süresi, ham ve normalleştirilmiş yoğunluk değerleri, p değeri, FDR ve katlama değişikliklerini içeren sütunla ayrılmış (.csv) bir veri dosyası olarak kaydetmek için bir dışa aktarma seçeneği belirleyin. İlgili tüm verileri elde etmek için çoklu analizler kaydedilmelidir.
    5. Yalnızca p değeri <0,05 ve katlama değişimi >2 dahil olmak üzere istatistiksel analizleri aşan muropeptitleri içeren ikinci bir .csv dosyasını dışa aktarın.
  3. Muropeptid kimliğinin spektral özelliklere açıklanması
    NOT: Tanımlanan her özelliğe m/z'ye dayalı olarak tahmin edilen bir muropeptid yapısı atanmalı ve bu ek açıklama MS/MS parçalanması incelenerek doğrulanmalıdır. Ek açıklamaları onayladıktan sonra, diferansiyel analizin yapılması ve iyileştirilmesi gerekebilir (bölüm 3.2).
    1. Diferansiyel analiz yazılımında, sonuç yorumlama altında, ID browser'ı seçin. Beklenen muropeptit yapılarından oluşan bir kütüphane ekleyin ve daha önce kullanılana benzer parametreleri seçin (bölüm 3.1.3). Bu, tanımlanan her özellik için tahmin edilen bir muropeptid ek açıklaması üretecektir. Tahmin edilen muropeptid yapıları ve MS veritabanı yazılımı için m / z kullanılarak bir muropeptid yapıları kütüphanesi üretilebilir (bkz. Bununla birlikte, >6.000 olası muropeptitten oluşan m / z'nin bir kütüphanesi Referans12'de bulunabilir.
    2. Eşleşen skora ve tahmin edilen muropeptidin biyolojik alaka düzeyine dayanarak tahmin edilen muropeptid ek açıklamasını seçin, yani biyolojik numunede bulunacak en olası muropeptidi seçin.
    3. MS/MS kromatogramının m/z piklerini, bilinen bir muropeptid yapısının tüm olası parçalanmalarının tahmin edilen m/z ile karşılaştırarak tahmin edilen muropeptid ek açıklamasını manuel olarak onaylayın (örneğin, Şekil 4).
      1. MS ve MS/MS verilerini bir kromatogram görüntüleme programı kullanarak görüntüleyin (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 4).
      2. Tahmin edilen muropeptid yapısını moleküler bir editör (kimyasal yapı çizim programı) kullanarak çizin (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 4, gri iç kısım). Her bağ ayrı ayrı veya kombinasyon halinde kırıldığında MS parçalarının m / z'sini göstermek için kütle parçalanma aracını kullanın.
        NOT: MS / MS için kullanılan parçalanma enerjisine bağlı olarak, parçalanma muropeptid yapısındaki herhangi bir bağda gerçekleşebilir. Bununla birlikte, bazı bağlar daha düşük enerji seviyelerinde daha kolay / sıklıkla parçalanır. Örneğin, peptid yan zincirindeki parçalanma en sık amino asitler arasındaki amid bağında meydana gelir. Parçalanmayı değerlendirirken, GlcNAc kalıntılarının muropeptitten çok kolay bir şekilde parçalandığını not etmek önemlidir. Bu nedenle, bilinen muropeptid yapısının parçalanması GlcNAc ile ve GlcNAc olmadan değerlendirilmelidir. GlcNAc'ın kaynak içi parçalanması nedeniyle, spektral işlemede ekstrakte edilen çeşitli özellikler (bölüm 3.1) tek bir muropeptit yapısını temsil edebilir. Bulunursa, bu özellikler birleştirilmeli ve diferansiyel analiz yeniden değerlendirilmelidir.
      3. Belirlenen muropeptid yapısının olası tüm parçalanmalarını (bölüm 3.3.3.2) MS/MS kromatogramı (bölüm 3.3.3.1) ile karşılaştırın. Muropeptid ek açıklamasını doğrulamak için, birden fazla parçanın m /z pikleri MS/MS kromatogramında çok az m/z hizalama penceresi ile bulunmalıdır (Şekil 4).
      4. Belirsiz MS / MS parçalanması durumunda muropeptid kimliğini aydınlatmak için, ek MS / MS veri alımı için ek MS / MS veri toplama için 2.2.2 ila 2.2.3 bölümlerini örneklerle (bölüm 2.1.9) tekrarlayın, tercih edilen bir öncü m m / z listesi ve ek MS / MS parçalanma çarpışma enerjileri ile tutma süresi içerir.
    4. Aynı muropeptid olarak ek açıklamalı birlikte salınımlı varlıklar için, diferansiyel analizi (bölüm 3.2.2) tekrar çalıştırın ve ayıklanan özellikleri birleştirin.
  4. Muropeptid modifikasyonlarındaki küresel değişikliklerin değerlendirilmesi
    1. İstatistiksel olarak anlamlı yüksek kıvrım değişikliği muropeptitlerinin .csv dosyasını (bölüm 3.2.4), her bir muropeptid modifikasyonu için tek bir sütun içerecek şekilde düzenleyin. Bu sütunu, açıklamalı her bir muropeptid için bir atama ile doldurun (bölüm 3.3) (örneğin, asetillenmiş ve de-N-asetillenmiş GlcNAc veya MurNAc).
    2. Değiştirilen .csv dosyasını Perseus22,23'e yükleyin. Normalleştirilmiş yoğunluk değerlerini Ana içe aktarma kutusuna alın ve değişiklik atamasını Kategorik içe aktarma kutusuna alın.
    3. Satırlara Açıklama Ekle altında, Satırlara Kategorik Olarak Açıklama Ekle'ye tıklayın ve her deneysel parametreye veri dosyaları ekleyin.
    4. Test altında, bir öğrencinin t-testini gerçekleştirmek için iki örnek teste tıklayın (p değeri < 0.05, FDR < 0.05, s0 = 1).
    5. 1D ek açıklama22,23 gerçekleştirmek için 1D'ye tıklayın. 1B ek açıklama FDR < 0.05, test edilen deneysel parametreler arasındaki muropeptid modifikasyonu için önemli bir bolluk değişikliğini gösterir. Eşik değeri (s0) = 1 olarak ayarlandığında, tüm muropeptitler için 1B ek açıklama FDR puanları görüntülenir.
    6. Bir grafik yazılımı içinde (bkz. Malzeme Tablosu), her bir muropeptid modifikasyonu için bolluk kıvrım değişiminin bir ısı haritasını oluşturun ve önemi göstermek için 1B ek açıklama puanını gösterin (Şekil 5B). Her bir muropeptid modifikasyonunun kıvrım değişimi, modifikasyonu içeren tüm bireysel muropeptitlerin ham yoğunlukları kullanılarak Microsoft Excel'de üretilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MS makinelerinin artan algılama hassasiyeti, yüksek güçlü tepe tanıma yazılımı ile birleştiğinde, karmaşık numunelerin madde bileşimlerini çok küçük ayrıntılarla izole etme, izleme ve analiz etme yeteneğini geliştirmiştir. Bu teknolojik gelişmeleri kullanarak, peptidoglikan bileşimi üzerine yapılan son çalışmalar, eski HPLC tabanlı metodoloji 11,25,26,27,28,29,30,31 üzerinde otomatik LC-MS özellik ekstraksiyon teknikleri 12,13,14,24 kullanmaya başlamıştır . Çok sayıda genel özellik çıkarma yazılım paketi mevcut olmasına rağmen, özyinelemeli özellik çıkarma kullanan ticari yazılım, LC-MS veri kümesinde bulunan her bir muropeptidin tüm yüklerini, izotoplarını ve addukt versiyonlarını otomatik olarak tanımlayarak ve birleştirerek hızlı ve oldukça sağlamdır (Şekil 3). Ek olarak, ayıklanan özelliklerin ilk saklama süreleri, m/z ve izotopik desenleri, tüm veri dosyalarındaki her bir özelliğin doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlamak üzere veri kümesini yeniden değerlendirmek (özyinelemeli) için kullanılır. Bu nedenle, özyinelemeli algoritma, en yüksek tanımlamaya olan güveni doğrulamaya ve artırmaya yardımcı olur. Çoğu genel özellik çıkarma programı, yükleri/izotopları vb. gruplandırmaz. ve bunu ek bir manuel adım olarak gerektirecektir. Ayrıca, özellikler özyinelemeli algoritmanın bir parçası olan veri kümesinin tamamı olarak değil, her veri dosyası içinde ayrı ayrı ayıklandığı için genel programlar daha az sağlam olacaktır.

Burada sunulan peptidoglikomik protokol yakın zamanda PG'nin iki fizyolojik büyüme koşulu, yani serbest yüzme planktonik ve sabit komünal biyofilm12 arasındaki bileşimsel değişikliklerini incelemek için kullanılmıştır. Özyinelemeli özellik ekstraksiyonu ile birlikte oldukça hassas bir QTOF MS kullanılarak, 160 farklı muropeptit tanındı ve izlendi. Bu, daha önce 29,32 olan bu organizmada tanımlanan muropeptit sayısının sekiz katını ve diğer organizmalarda diğer metodolojiler kullanılarak tanımlanan muropeptitlerin iki katından fazlasını temsil ediyordu10,14,24.

MS verilerinden çıkarılan her m / z pikinin belirli bir muropeptid ile ilişkilendirilmesi, bilinen ve tahmin edilen muropeptid yapılarının bir veritabanı ile çapraz referanslama ile kolaylaştırılmıştır. Çıkarılan her özellik için parçalanma MS/MS kromatogramı (Şekil 4), veritabanı kullanılarak önerilen muropeptidin parçalanma profili (Şekil 4, gri girinti) ile karşılaştırılır.

Peptidoglycomic veriler, deney kurulumuna ve sorulan sorulara bağlı olarak birkaç farklı şekilde görüntülenebilir. Bu tür grafik analizler, temel bileşenler analizini (PCA), dağılım grafiklerini, volkan grafiklerini, ısı haritalarını ve hiyerarşik kümeleme analizini içerebilir. Örneğin, volkan arazileri, test edilen koşullar arasında istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek bir bolluk değişimi büyüklüğü gösteren muropeptitleri vurgulamaktadır (Şekil 5A). Test edilen koşullar arasında önemli bolluk değişikliklerini temsil eden bu seçilmiş muropeptitler, muropeptid modifikasyonları için daha fazla incelenebilir. Bu modifikasyonlar, amino asit ikamelerinin varlığını, asetilasyon değişikliklerini veya amidaz aktivitesinin varlığını içerebilir. Birlikte incelendiğinde, aynı modifikasyona sahip çoklu muropeptitler, bir deneysel duruma (Şekil 5A - vurgulanan yeşil noktalar) ve tüm grubun anlamlılık açısından değerlendirildiği (Şekil 5B) bir eğilim açısından incelenebilir. Bir muropeptid modifikasyonunu bu şekilde izlemek, deneysel parametreden etkilenen belirli bir enzimatik aktiviteyi gösterebilir. Ek olarak, bu eğilimdeki aykırı değerler, belirli bir özgüllüğe veya biyolojik fonksiyona sahip enzimatik aktiviteyi gösterebilir (Şekil 5A—vurgulanan noktalar turuncu).

Figure 1
Şekil 1: Tipik bir Gram-negatif peptidoglikan yapısı örneği. (A) Gram-negatif bakterilerde, peptidoglikan iç ve dış zarlar arasındaki periplazmada bulunur. (B) Tek bir muropeptit, β-1,4'e bağlı bir N-asetil glukozamin (GlcNAc) (mavi) ve eklenmiş bir peptid yan zinciri (turuncu) ile bir N-asetil muramik asit (MurNAc) (mor) oluşur. Peptid yan zinciri, olgun ağ benzeri peptidoglikan (A) üreten bitişik muropeptidin yan zincirine çapraz bağlanabilir. Saflaştırma, peptidoglikanın tüm hücreden, diğer tüm hücresel materyalin sıyrıldığı bir sakkül olarak izole edilmesini içerir. (C) Bir peptidoglikan sacculi'nin transmisyon elektron mikrografisi. Buna karşılık, Gram-pozitif PG, yapıdaki daha geniş bir varyasyon dizisinden oluşabilir ve Gram-pozitif taksonomik sınıflandırma33'ün bir parçasıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Peptidoglycomics iş akışı. Numune Hazırlama. Adım 1, bakteri hücrelerini büyütür ve pelet eder (bölüm 1.1). Adım 2, peptidoglikan sakkuli% 4 SDS kaynatma ile saflaştırın (bölüm 1.2). Veri Toplama. Adım 3, peptidoglikan omurgasının N-asetilglukozamin (GlcNAc) ve N-asetilmuramik asit (MurNAc) arasındaki β-1,4-bağlantısının kırılmasıyla muropeptitler üretmek için sakkolinin enzimatik sindirimi (bölüm 2.1). Adım 4, LC-MS/MS ile muropeptid yoğunluğunun analizi (bölüm 2.2). Veri Analizi. Adım 5, özyinelemeli özellik ekstraksiyonu, tek bir muropeptit ile ilişkili tüm yükleri, katkıları ve izotopları tanımlar ve toplar (bölüm 3.1). Adım 6, öngörülen parçalanmayı MS/MS kromatogramları ile karşılaştırarak muropeptitlerin tanımlanması (bölüm 3.3). Adım 7, farklı deneysel parametreler arasındaki peptidoglikan bileşimsel değişikliklerini karşılaştıran biyoinformatik diferansiyel analiz (bölüm 3.2). Adım 8, 1D ek açıklama kullanarak farklı deneysel parametreler içindeki muropeptid modifikasyonlarındaki küresel değişimi inceleyin (bölüm 3.4). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Özyinelemeli özellik ayıklama örneği. Alanin (A), izo-ᴅ-glutamat (E), mezo-diaminopimelik asit (m), alanin (A), bitişik muropeptid yan zincirinin AE m A'sına çapraz bağlanmış bir peptid yan zincirini temsil eden bir muropeptid için (1864.8 m / z). 1864,8 m/z için çıkarılan özelliğe yükler (+1, +2 ve +3), ekler (örneğin, sodyum ve potasyum), GlcNAc kaybı (1 veya 2 GlcNAc) ve her varyasyon için çoklu izotopik pikler (örneğin, yakınlaştırılmış giriş) dahildir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Muropeptid parçalanması ve tanımlanması. Ek açıklama için, MS kromatogramından çıkarılan her m / z tepe noktası (özellik), bir muropeptid kütüphanesine benzerliğe dayanarak önerilen bir muropeptid yapısı verilir. Bu önerilen yapıyı doğrulamak için, tahmin edilen MS / MS parçaları kimyasal bir çizim programı (gri girinti) kullanılarak üretilir. Bu öngörülen parçalanma MS/MS kromatogramı ile karşılaştırılmıştır. Tahmin edilen fragmanlar (gri girinti) MS / MS kromatogramı ile eşleştiğinde, önerilen muropeptit yapısı doğrulanır. Şekil Referans12'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Peptidoglikan bileşiminin diferansiyel analizi. (A) Serbest yüzme planktonik veya sabit biyofilm kültürü olarak yetiştirilen P. aeruginosa'dan saflaştırılan peptidoglikan arasındaki kıvrım değişiminin volkan değişimi ve muropeptid yoğunluğundaki değişikliklerin istatistiksel önemi. Peptit yan zinciri içindeki tipik amino asit düzenlemesinde bir değişikliği temsil eden bir modifikasyona sahip tüm muropeptitler vurgulanmıştır. Biyofilm kaynaklı peptidoglikanda bolluğun azalmasına yönelik bir eğilim gösteren amino asit ikame edilmiş muropeptitler yeşil renkle vurgulanır. Bu eğilime aykırı olan ve biyofilm kaynaklı peptidoglikanda artan bolluk gösteren amino asit ikame edilmiş muropeptitler turuncu renkte vurgulanır. (B) Biyofilmlerde artan bolluk (turuncu) ve azalmış bolluk (yeşil) ile ikame edilen tüm amino asit muropeptitlerinin bolluğundaki küresel kıvrım değişiminin ısı haritası. Bu muropeptitler yeniden gruplandırıldı ve monomerlerde, çapraz bağlı dimerlerde amino asit ikamesinin meydana gelip gelmediği veya dördüncü (AE m+), beşinci (AEmA +) veya her iki amino asidin (AEm ++) ikame edilip edilmediği değerlendirildi. Her bir muropeptit grubunun önemi, anlamlılık için FDR < 0.05 ile 1D ek açıklama ile değerlendirildi ve ilişkili 1D skoru görüntülendi. 1D ek açıklama yalnızca 2'den fazla muropeptit üzerinde gerçekleştirilebilir (örneğin, AEm ++ ikamesi yalnızca iki muropeptitte bulunmuştur). Bu nedenle, bu durumda, grup üzerinde değil, bireysel muropeptitler için önem incelenmelidir. Şekil Referans12'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, peptidoglikanı bakteri kültürlerinden arındırmak, LC-MS tespiti için işlem yapmak ve biyoinformatik teknikleri kullanarak kompozisyonu analiz etmek için bir yöntem açıklamaktadır. Burada, Gram-negatif bakterilere odaklanıyoruz ve Gram-pozitif bakterilerin analizini sağlamak için bazı hafif değişiklikler gerekecektir.

Muropeptitlerin hazırlanması, 1960'larda ilk kez üretildiğinden beri neredeyse aynı kalmıştır 9,11,15. Saflaştırıldıktan sonra, sakkül (bölüm 1.2.18), Streptomyces globisporus'tan muramidaz enzimi mutanolizin kullanılarak bireysel muropeptitlere sindirilir. Mutanolizin, PG yapısını β-1,4-glikosidik bağlantıyı kırarak sindirir ve eklenmiş peptid yan zincirine sahip bir GlcNAc-MurNAc disakkaritinden oluşan bireysel muropeptitleri serbest bırakır ve herhangi bir modifikasyon veya çapraz bağlantı içerir (Şekil 1).

PG kompozisyonunu incelemek için kullanılan önceki metodolojinin bir sınırlaması, muropeptitlerin zaman alıcı manuel olarak tanımlanması olmuştur. Karmaşıklık ve zorluk nedeniyle, katkılar, yükler ve / veya izotoplar analize dahil edilmiş olabilir veya olmayabilir. Ek olarak, çoğu çalışma analizi en bol, dolayısıyla saflaştırılması en kolay olan muropeptitlerle sınırlandırdı. Bu nedenle, metodolojinin karmaşık doğası nedeniyle, nispeten az sayıda üst düzey ayrıntılı PG kompozisyon analizi gerçekleştirilmiştir. "Omik" tip analizler, biyolojik sistemlere üst düzey genel bakış için nispeten büyük ve karmaşık LC-MS veri kümelerinin üretimi ve istatistiksel analizi için son teknolojik gelişmeleri kullanmıştır. Peptidoglycomics uygulaması, PG kompozisyonunun çok ince ayrıntılarla analiz edilmesini sağlayacaktır.

Peptidoglycomics'te, özyinelemeli özellik ayıklama manuel iş yükünü azaltır ve tüm veri dosyalarını aynı anda inceleyerek doğruluğu artırır. Özyinelemeli bir özellik çıkarma algoritması, birden fazla LC-MS kromatografik veri dosyasında benzersiz spektral özellikleri (m / z pikleri) tanımlamak, hizalamak ve gruplandırmak için kullanılır ve muropeptid m / z piklerinin tanımlanmasını otomatik hale getirir. Bu algoritma, çok sayıda potansiyel izotopu, iyon katkısını ve yük durumunu alan ve çoklu m / z zirvelerini, bu durumda tek bir muropeptidi temsil edecek olan temsili tek bileşiğine (veya özelliğine) yoğunlaştıran izotopik desen eşleştirmesini kullanır (Şekil 3). Spektral özellik grubunun doğrulanması, özelliğin tüm veri kümesinde sağlam bir şekilde çıkarılmasını sağlamak için her kromatografik veri dosyasındaki tutma süresi, m/z ve izotopik desen eşleşmesi karşılaştırılarak gerçekleştirilir. Genel özellik bulma algoritmaları, birden fazla numunede izotop eşleştirme veya m/z piklerini hizalama, gruplandırma veya doğrulama içermeyebilir ve bu özellik ayıklamayı gerçekleştirmek için ek el ile veri işleme gerektirir.

Özellikler tanımlandıktan sonra, biyoinformatik diferansiyel analiz algoritmaları çok büyük veri kümesini bir bütün olarak ele alır ve böylece karmaşık verilerden yararlı karşılaştırmalar ve yorumlar sağlar. Bu biyoinformatik grafik analizleri kullanmak, biyolojik süreçleri gösterebilecek eğilimleri incelemek için büyük veri kümelerini görselleştirmek ve yorumlamak için güçlü bir yoldur. Ancak son zamanlarda, bu yüksek güçlü grafik analizlerin peptidoglikanı çok ince ayrıntılarla incelemek için kullanıldığı görülmüştür12. Diferansiyel analiz (bölüm 3.2), farklı deneysel koşullar arasındaki bireysel muropeptitlerin bolluğundaki değişiklikleri değerlendirir. Bununla birlikte, tüm bakteri hücreleri bağlamında, PG modifiye edici enzimlerin aktivitesi, katalitik aktivitenin özgüllüğüne bağlı olarak çok sayıda farklı muropeptit yapısına neden olabilir (yani, disakkarit üzerine bir asetil grubunun eklenmesi, peptid yan zincirinin modifikasyonu ile veya modifikasyonu olmadan olabilir). Bu nedenle, tüm bireysel açıklamalı muropeptitler arasında belirli bir modifikasyonun küresel bolluk değişikliklerini değerlendirmek, PG üzerinde etkili olan enzimatik aktivite hakkında fikir verecektir (Şekil 5) Bu nedenle, diferansiyel analiz, bireysel muropeptitlerin bolluk değişikliklerini araştırmak için kullanılır; oysa 1B ek açıklama, belirli bir PG modifikasyonunun bolluk değişikliklerini inceler. 1D ek açıklama ile bağlantı diferansiyel analizi, PG bileşiminin hem bireysel bir muropeptid seviyesinde hem de genel PG enzimatik aktivitesinin bir göstergesi olarak değerlendirilmesini sağlar.

Diferansiyel analiz sırasında, PG'nin birkaç yüksek miktarda muropeptit ve çok sayıda düşük bollukta muropeptitten oluştuğunu not etmek önemlidir12. Bu nedenle, analizin sonraki aşamalarında yüksek bolluktaki muropeptitlerden herhangi bir önyargıyı ortadan kaldırmak için taban çizgisi çok önemlidir. Ayrıca, yapılan çoklu t-testleri nedeniyle, yanlış pozitifleri azaltmak için istatistiksel bir düzeltme uygulanmalıdır. Varsayılan değer genellikle Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranıdır (FDR)19. Daha muhafazakar Bonferroni aile hata oranı (FWER)20,21 gibi diğer düzeltmeler de mümkündür.

Biyoinformatik yazılım içinde, özellik çıkarmada tanımlanan m / z zirvesine de öngörülen bir yapı atanır. Diğer "omik" tip (örneğin, proteomik) analizler, öngörücü parçalanma spektrumları eşleştirmesi yoluyla bileşik tanımlamaya izin veren büyük bileşik veritabanlarının mevcudiyetinden yararlanır. Şu anda, hiçbir muropeptid öngörülen parçalanma kütüphanesi mevcut değildir ve muropeptid tanımlamasının doğrulanması manuel bir adım olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, peptidoglikomik parçalanma veritabanları geliştikçe ve kamuya açık hale geldikçe, bu manuel tanımlama adımı, bölüm 3.3.3 ve 3.3.4'ü ortadan kaldırarak veya yüksek oranda azaltarak daha otomatik ve erişilebilir hale gelecektir.

Escherichia coli'de PG, 34 hücre başına ~ 3.5 x 106 muropeptitten oluşur. QTOF MS'in tespit sınırları içinde, en düşük miktarda muropeptitler bile, bir hücre12 içindeki tek bir muropeptidin yüzlerce kopyasını temsil edebilir. Bu nedenle, en düşük miktarda muropeptitlerdeki değişiklikleri bile anlamak, hücre içindeki PG hedefli enzimlerin biyolojik aktivitesi hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar, bu protokolün rafine edilmesindeki katkılarından dolayı Dr. Jennifer Geddes-McAlister ve Dr. Anthony Clarke'a teşekkür eder. Bu çalışma, CIHR'den C.M.K'ya (PJT 156111) verilen işletme hibeleri ile desteklendi ve E.M.A. Rakamları'na verilen NSERC Alexander Graham Bell CGS D, BioRender.com'da oluşturuldu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) Agilent LC-MS data acquisition
Heating mantle controller, Optichem Fisher 50-401-788 for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL Hemispherical Fisher CG1000008 for 4% SDS boil
Incubator, 37°C for sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40, Fisher CG121805 for 4% SDS boil
Lyophilizer Labconco for lyophilization of sacculi
Magentic stirrer Fisher 90-691-18 for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 Aglient LC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm Fisher 50-197-9573 cleanup of sample before MS injection
Retort stand Fisher 12-000-102 for 4% SDS boil
Retort clamp Fisher S02629 for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrex Fisher 07-250-084 for 4% SDS boil
Sonicator model 120 Fisher FB120 for sacculi purification
Sonicator - micro tip Fisher FB4422 for sacculi purification
Ultracentrifuge Beckman sacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45 Fisher NC9691797 sacculi wash steps
Water supply City for water cooled condenser
Software
Chemdraw Cambridgesoft molecular editor for muropeptide fragmentation prediction
Excel Microsoft viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter Acquisition Aglient running QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professional Aglient bioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager Aglient muropeptide m/z MS database
MassHunter Profinder Aglient recursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysis Aglient viewing MS and MS/MS chromatograms
Prism Graphpad Graphing software
Perseus Max Plank Institute of Biochemistry 1D annotation
Material
Acetonitrile Fisher A998-4
Ammonium acetate Fisher A637
Amylase Sigma-Aldrich A6380
Boric acid Fisher BP168-1
DNase Fisher EN0521
Formic acid Sigma-Aldrich 27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321 Agilent G1969-85000
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 Sigma-Aldrich M9901
Nitrogen gas (>99% purity) Praxair NI 5.0UH-T
Phosphoric acid Fisher A242
Pronase E from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
RNase Fisher EN0531
Sodium azide Fisher S0489
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166
Sodium hydroxide Fisher S318
Sodium Phosphate (dibasic) Fisher S373
Sodium Phosphate (monobasic) Fisher S369
Stains-all Sigma-Aldrich E9379

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
  4. Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
  6. Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
  7. Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
  8. Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
  9. Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
  10. Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
  11. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
  12. Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
  13. van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
  14. Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
  15. Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
  16. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  17. Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
  18. Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
  19. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  20. Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
  21. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
  22. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  23. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
  24. Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
  25. Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
  26. Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
  27. Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
  28. Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
  29. Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
  30. Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
  31. De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
  32. Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
  33. Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
  34. Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).

Tags

Retraksiyon Sayı 164 peptidoglikan muropeptitler kütle spektrometrisi özellik ekstraksiyonu diferansiyel analiz biyoinformatik peptidoglycomics
Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, E. M., Greenwood, N. A.,… More

Anderson, E. M., Greenwood, N. A., Brewer, D., Khursigara, C. M. Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics. J. Vis. Exp. (164), e61799, doi:10.3791/61799 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter