Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Published: October 13, 2020 doi: 10.3791/61799
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

Summary

פרוטוקול זה מכסה ניתוח מפורט של הרכב פפטידוגליקן באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מיצוי תכונות מתקדם ותוכנת ניתוח ביואינפורמטיקה.

Abstract

פפטידוגליקן הוא מרכיב חשוב בדפנות תאי החיידקים ומטרה תאית נפוצה לאנטי-מיקרוביאליים. למרות שהיבטים של מבנה פפטידוגליקן נשמרים למדי בכל החיידקים, קיימת גם שונות ניכרת בין גראם-חיוביים/שליליים ובין מינים. בנוסף, ידועים מספר רב של וריאציות, שינויים או התאמות לפפטידוגליקן שיכולים להתרחש בתוך מין חיידקים בתגובה לשלב הגדילה ו / או גירויים סביבתיים. וריאציות אלה מייצרות מבנה דינמי מאוד הידוע כמשתתף בתפקודים תאיים רבים, כולל גדילה/חלוקה, עמידות לאנטיביוטיקה והימנעות מהגנת המאכסן. כדי להבין את השונות בתוך הפפטידוגליקן, יש לפרק את המבנה הכולל לחלקים המרכיבים אותו (המכונים מורופפטידים) ולהעריך את ההרכב התאי הכולל. Peptidoglycomics משתמשת בספקטרומטריית מסות מתקדמת בשילוב עם ניתוח נתונים ביואינפורמטי רב עוצמה כדי לבחון את הרכב הפפטידוגליקן בפירוט רב. הפרוטוקול הבא מתאר את טיהור הפפטידוגליקן מתרביות חיידקים, רכישת נתוני עוצמת מורופפטיד באמצעות כרומטוגרף נוזלי – ספקטרומטר מסות, וניתוח דיפרנציאלי של הרכב הפפטידוגליקן באמצעות ביואינפורמטיקה.

Introduction

פפטידוגליקן (PG) הוא מאפיין מגדיר של חיידקים המשמש לשמירה על המורפולוגיה של התא, תוך מתן תמיכה מבנית לחלבונים ולרכיבים תאיים אחרים 1,2. עמוד השדרה של PG מורכב מחומצה מורמית N-אצטיל מקושרת β-1,4 לסירוגין (MurNAc) ו-N-אצטיל גלוקוזאמין (GlcNAc)1,2. לכל MurNAc יש פפטיד קצר הקשור בשאריות ᴅ-lactyl שניתן להצליב לפפטידים סמוכים המקושרים לדו-סוכר (איור 1A,B). ההצלבה הזו מייצרת מבנה דמוי רשת שמקיף את כל התא, ולעתים קרובות מתייחסים אליו כאל עצם העצה (איור 1C). במהלך סינתזת PG, קודמנים נוצרים בציטופלסמה, ומועברים על פני הממברנה הציטופלזמית על ידי פליפסות. מבשרי משולבים לאחר מכן לתוך PG בוגר על ידי אנזימים transglycosylase ו transpeptidase, אשר מייצרים את הקשרים glycosidic ו peptide, בהתאמה3. עם זאת, לאחר הרכבתם, ישנם אנזימים רבים המיוצרים על ידי החיידקים שמשנים ו/או מפרקים את PG כדי לבצע מספר תהליכים תאיים, כולל גדילה וחלוקה. נוסף על כך, הודגם כי שינויים שונים של PG מעניקים התאמות ספציפיות למתח, לתנאי גדילה וללחץ סביבתי, אשר היו מעורבים באיתות תאי, עמידות אנטי-מיקרוביאלית והתחמקות ממערכת החיסון של המארח4. לדוגמה, שינוי נפוץ הוא הוספת קבוצת אצטיל C6 על MurNAc המקנה עמידות על ידי הגבלת הגישה לקישורי גליקן β-1,4 לאנזימי ליזוזים המיוצרים על ידי המאכסן אשר מפרקים PG 4,5,6. באנטרוקוקסי, החלפה של הטרמינל ᴅ-Ala של שרשרת הצד הפפטידית ב-ᴅ-Lac מעניקה עמידות גדולה יותר לאנטי-מיקרוביאלית, ונקומיצין 7,8.

הנוהל הכללי לבידוד וטיהור PG נותר כמעט ללא שינוי מאז תואר בשנות השישים9. קרומי חיידקים מומסים באמצעות טיפול בחום עם SDS, ולאחר מכן הסרה אנזימטית של חלבונים קשורים, גליקוליפידים ושאריות DNA. לאחר מכן ניתן לעכל את העצה השלמה המטוהרת לרכיבים בודדים על ידי הידרוליזה של קישור β-1,4 בין GlcNAc ו- MurNAc. העיכול הזה מייצר מפרקים של GlcNAc-MurNAc עם כל שינוי מבני ו/או קישורים צולבים שלמים, והם נקראים מורופפטידים (איור 1B).

ניתוח הרכב של PG בוצע בתחילה באמצעות הפרדה כרומטוגרפית נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) כדי לטהר כל מורופפטיד ואחריו זיהוי ידני של מורופפטידים10,11. זה הוחלף מאז על ידי כרומטוגרפיה נוזלית טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-MS), אשר מגביר את רגישות הגילוי ומקטין את עומס העבודה הידנית של טיהור כל muropeptide בודד. עם זאת, האופי הגוזל זמן ומורכב של זיהוי ידני של muropeptides נשאר גורם מגביל, הפחתת מספר המחקרים שנערכו. בשנים האחרונות עם הופעתן של טכנולוגיות "אומיות", מיצוי תכונות LC-MS אוטומטי הפך לכלי רב עוצמה, המאפשר זיהוי וזיהוי מהיר של תרכובות בודדות בדגימות מורכבות ממערכי נתונים גדולים מאוד. לאחר זיהוי התכונות, תוכנה ביואינפורמטית משווה סטטיסטית את השונות בין הדגימות באמצעות ניתוח דיפרנציאלי המבודד אפילו הבדלים מינימליים בין מערך הנתונים המורכב ומציג אותם באופן גרפי למשתמש. היישום של תוכנת חילוץ תכונות לניתוח הרכב PG רק החל להיחקר 12,13,14 ומשולב לניתוח ביואינפורמטי 12. בניגוד לאנליזה פרוטאומית הנהנה ממאגרי החלבונים הזמינים המנבאים פיצול פפטידים המאפשר זיהוי אוטומטי לחלוטין, לא קיימת כיום ספריית פיצול עבור פפטידוגליקומיקס. עם זאת, מיצוי תכונות יכול להיות משולב עם מסדי נתונים מבניים ידועים וחזויים כדי לחזות זיהוי muropeptide12. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשימוש במיצוי תכונות מבוסס LC-MS בשילוב עם ספריית מורופפטיד לזיהוי אוטומטי וניתוח דיפרנציאלי ביואינפורמטי של הרכב PG (איור 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מדגם Peptidoglycan

  1. גידול תרביות חיידקים
    הערה: גדילת תרביות החיידקים תשתנה בהתאם לזן החיידקים ולתנאי הגידול הנבדקים. הפרמטרים הניסיוניים שייבדקו יגדירו את תנאי הגידול.
    1. גידול תרביות חיידקים בתנאי גידול הנדרשים לזן החיידק ולתכנון הניסוי. לגדל חיידקים כתרביות משולשות (העתקים ביולוגיים), כלומר שלוש מושבות נפרדות לכל זן או תנאי גידול.
      הערה: תנאי הגידול ושלב הצמיחה ידועים כבעלי השפעות משמעותיות על הרכב PG 1,2,10. יש להקפיד מאוד לשמור על עקביות בין תרבויות ושכפולים כדי להבטיח ששינויי ההרכב נובעים מהפרמטרים הניסיוניים ולא מטעויות ניסוי.
    2. קרר במהירות את התרבית ל -4 ° C, לאסוף על ידי צנטריפוגה (11,000 x גרם, 10 דקות, 4 ° C) ולהקפיא את גלולת התא ב -20 ° C. יש לשטוף את גלולת התא עם 4°C מקורר מראש, 20 mM נתרן פוספט pH 6.5 לפני ההקפאה. ייצור גלולת התא הקפוא צריך להיעשות במהירות ובעקביות ככל האפשר בין הדגימות כדי להגביל את פעילותם של אנזימים שעלולים לשנות ו/או לפרק את PG במהלך תהליך האיסוף. ניתן לעבד דגימות ישירות בתהליך המיצוי (סעיף 1.2) ללא הקפאה; עם זאת, ודא שכל הדגימות מעובדות באופן דומה.
      הערה: כדי להבטיח מוצר מספיק לשלבים מאוחרים יותר, נעשה שימוש בכדורית תא רטוב בגודל משמעותי. זה מייצר גלולת סקולי גדולה מספיק, אשר ניתן לדמיין ולשמור בקלות במהלך שלבי הכביסה החוזרים ונשנים (סעיף 1.2.5 ו 1.2.14) ללא אובדן משמעותי של המוצר. בהתאם לחיידק ולתנאי הגידול, יבול זה צפוי להשתנות. עבור חיידק גראם-שלילי Pseudomonas aeruginosa, PAO1, 4 ליטר של תרבית 0.5 OD600 ייצר גלולת תא 3-4 גרם והיה מספיק כדי לייצר ~ 10 מ"ג של סקולי מטוהר (סעיף 1.2.17)12. זהו עודף גדול של sacculi מאשר נדרש עבור LC-MS (סעיף 2); עם זאת, הוא יסייע בדיוק המדידה (סעיף 1.2.17) ובנורמליזציה (סעיף 1.3).
  2. מיצוי של peptidoglycan sacculi
    הערה: הפרוטוקול לחילוץ PG מותאם מ- ref.9,11,15. פרוטוקול זה יחלץ את PG מתאי חיידקים בודדים כסקולי שלם, ללא רכיבים תאיים אחרים. ניתן להשתמש בפרוטוקול עם חיידקים גראם-שליליים או גראם-חיוביים. עם זאת, עבור תאים גראם-חיוביים, ייתכן שיהיה צורך בהתאמות כדי לבודד את מבנה PG העבה יותר ולהסיר פולימרים הקשורים לדופן התא; כגון, חומצות teichoic.
    1. יש להשהות מחדש כדורי תאים קפואים ביחס של 1:10 בקירוב לנפח התרבית המקורי של 20 mM נתרן פוספט pH 6.5. בצע שלב זה ב 4 ° C (יכול להיות 1-8 מ"ג משקל גלולה תא רטוב לכל מ"ל של חיץ11,12).
      הערה: כדי לשמור על מצב אצטילציה של PG, pH של 6.5 או פחות נדרש15,16.
    2. יש להוסיף את תרחיף התאים לנתרן רותח 8% נתרן דודציל סולפט (SDS) 20 מילימול נתרן פוספט pH 6.5 לקבלת נפח סופי של 1:1 (כלומר, הריכוז הסופי הוא 4% SDS), תוך ערבוב עדין בבקבוק תחתון עגול המצויד במעבה מקורר מים. (איור 2, שלב 2)
    3. שמרו על רתיחה עדינה למשך 30 דקות עד 3 שעות עם ערבוב כדי להבטיח ניתוק מלא של הממברנה. ודא שהתערובת המתקבלת ברורה לחלוטין ללא גושי תאים או צמיגות שנותרו. הרתחה ארוכה יותר עדיפה כדי להבטיח ניתוק מוחלט.
    4. תנו לו להתקרר לטמפרטורת החדר. ניתן להשאיר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
      הערה: כאשר קיים SDS, שמור דגימות בטמפרטורת החדר כדי לשמור SDS בתמיסה.
    5. לאסוף sacculi כמו גלולה דרך ultracentrifugation ב 70,000 x גרם במשך 40 דקות (או את הזמן הדרוש לחלוטין משקעים sacculi) ב 25 ° C.
    6. יש לשטוף סקולי באופן חוזר ונשנה על ידי אולטרה-צנטריפוגה עוקבת (סעיף 1.2.5) ותרחיף ב~50 מ"ל בטמפרטורת החדר 20 מ"מ נתרן פוספט pH 6.5 עד שמאגר השטיפה מגיע לריכוז SDS ~0.001%. בדרך כלל, 5 עד 7 שטיפות מספיקות.
      הערה: כדי לבדוק את ריכוז ה-SDS הנותר במאגר הכביסה, השתמש בצבע הקולורימטרי, Stains-all17.
    7. להשהות סקולי ב 5-10 מ"ל של טמפרטורת החדר 20 mM נתרן פוספט pH 6.5.
    8. סוניק את הדגימה לזמן קצר (~ 40%, 50 W, 20 קילוהרץ, 20 שניות) בטמפרטורת החדר כדי לפזר גושים.
      הערה: סוניקציה מורחבת תגרום באופן מכני לגזירה של מבנה PG18.
    9. יש להשלים את הדגימה עם 50 מיקרוגרם/מ"ל כל עמילאז, DNase ו-RNase, מגנזיום סולפט במינון 10 מ"מ, ולעכל בטמפרטורה של 37°C במשך שעה אחת עם תסיסה או אגוז.
      הערה: עיכול עמילאז מסיר את שאריות הגליקוגן הכלוא בתוך הסקולי11.
    10. יש להוסיף 100 מק"ג/מ"ל פרונאז ולעכל ב-37°C למשך הלילה עם תסיסה או אגוז ו~0.02% נתרן אזיד.
      הערה: עיכול פרונאז מסיר את האנזימים שנוספו (מסעיף 1.2.9) ומסיר ליפופרוטאינים הקשורים באופן קוולנטי ל-PG.
      זהירות: נתרן אזיד רעיל מאוד ודורש שיטות שימוש/סילוק נאותות.
    11. אולטרה-צנטריפוגה ב 70,000 x גרם במשך 40 דקות (או הזמן הדרוש לחלוטין משקעים sacculi) ב 25 ° C כדי להסיר נתרן azide.
    12. להשעות מחדש את הגלולה ב 25 מ"ל של 2% SDS 20 mM נתרן פוספט pH 6.5.
    13. מרתיחים במשך שעה אחת בסיר אידוי או בבקבוק התחתון העגול עם מעבה מקורר מים (סעיף 1.2.2).
      הערה: שלב הרתיחה השני של SDS מסיר את כל החלבונים והמזהמים הנותרים מהסקולי.
    14. חזור על שטיפת הסקולי (סעיף 1.2.6) עם ~ 50 מ"ל מים מזוקקים כפולים בטמפרטורת החדר (ddH2O) עד שריכוז SDS הוא ~ 0.001%.
    15. להשהות את הגלולה בכמות מספקת של ddH2O כדי להשעות sacculi, כמו גם לשטוף את המיכל (למשל, 25 מ"ל) ולהקפיא לילה ב -80 ° C. נפח יכול להשתנות כמו הדגימה יהיה lyophilized בשלב הבא, אם כי, נפחים קטנים דורשים פחות זמן lyophilize.
    16. למחרת, lyophilize את המתלה ולאחסן בטמפרטורת החדר.
    17. למדוד את כמות sacculi lyophilized המתקבל על איזון אנליטי.
    18. לדלל sacculi ב ddH2O עד 10 מ"ג / מ"ל ו sonicate קצר כדי לפרק גושים לפני ניתוח נוסף.
  3. כימות פפטידוגליקן מטוהר
    1. כמת את כמות הסקולי המטוהר מסעיף 1.2.18 כדי להבטיח השוואת נתוני מפרט המסה במהלך ניתוח דיפרנציאלי (סעיף 3.2). עקוב אחר המתודולוגיה המפורטת המתוארת בהפניה15.
      הערה: סקרקולי מטוהרים (סעיף 1.2.18) מפורקים לרכיבי סוכר וחומצות אמינו בודדים על ידי הידרוליזה חומצית. רכיבים בודדים מופרדים ומכומתים על ידי כרומטוגרפיה של חילופי אניונים באמצעות זיהוי פועם-אמפרומטרי. בהינתן המבנה של PG (איור 1), מורופפטידים בודדים מורכבים משאריות MurNAc יחיד ושאריות GlcNAc יחידות. לכן, כימות הריכוז של כל שארית מייצג את כמות המורופפטידים ביחס של 1:1 בתוך המדגם. MurNAc מועדף בשל הפרדת השיא הנקייה מרכיבי PG אחרים במהלך כרומטוגרפיה16.

2. רכישת נתונים בספקטרומטריית מסות

  1. הכנת מורופפטידים לספקטרומטריית מסות
    1. תוסף 800 מיקרוגרם של סקולי מטוהר עם מוטנוליסין 100 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מ"מ אמוניום אצטט pH 5.5 ומגנזיום כלורי 50 מ"מ בתגובה של 100 מיקרוליטר.
    2. יש לעכל בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
    3. הוסף נפח 1: 1 0.5 M borate buffer pH 9.0 ולהשלים עם ~ 10 מ"ג / מ"ל נתרן בורוהידריד (NaBH4).
      הערה: מוטרוטציה של סוכרים מחזוריים בין α לצורות אנומריות β תגרום להיווצרויות שיא מרובות במהלך הפרדת הכרומטוגרפיה הנוזלית של המורופפטידים. הטיפול עם NaBH4 מבטל את ההמרה ההדדית בין שתי הצורות על ידי הפחתת MurNAc למורמיטול11. הטיפול אינו מפחית 1,6-אנהידרו MurNAc או 1,4-שאריות סוכר מקושרות.
      זהירות: התגובה של NaBH4 מייצרת כמויות קטנות של גז מימן. תגובת NaBH4 תיצור בועות ושפופרות מיקרופוגה צריכות להישאר פתוחות כדי לאפשר לגז לברוח.
    4. יש לדגור על הדגימה בטמפרטורת החדר למשך ~20-30 דקות.
    5. צנטריפוגה לזמן קצר כדי ליישב את הדגימה בצינור המיקרופוגה ולהסיר בועות.
    6. יש לכוונן את רמת החומציות ל-<4.0 באמצעות חומצה זרחתית ביחס של 1:5, בתוספת במרווחים של 5 μL. בדיקת pH באמצעות רצועות בדיקת pH לקמוס.
    7. צנטריפוגה ב~ 17,000 x גרם למשך דקה אחת כדי לשקוע בכל חומר בלתי מסיס שנותר.
    8. סנן באמצעות מסנני מיקרוצנטריפוגות 0.2 מיקרומטר.
    9. הדגימות עוברות צנטריפוגה למשך 10 דקות במהירות של 30,000 x גרם לפני הזרקתן ל-LC-MS כדי להבטיח שהחלקיקים לא יוזרקו לטרשת נפוצה.
  2. התקנה של LC-MS
    1. חבר עמודת חלקיקים נקבוביים שטחי C18 (100 מ"מ x 2.1 מ"מ, גודל נקבוביות <3 מיקרומטר) לספקטרומטר מסות Quadrupole-Time of Flight (QTOF) עם דיוק זיהוי מינימלי של ארבע נקודות עשרוניות m/z .
    2. ביצוע הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית של מורופפטידים
      הערה: כל טריפליקט ביולוגי (סעיף 1.1.1) צריך להיות מופעל דרך LC-MS (סעיף 2.2.2 עד 2.2.3) שלוש פעמים (משולש טכני). לכן, לכל תנאי נבדק יהיו בסך הכל תשעה קבצי נתונים LC-MS. איסוף הנתונים בוצע באמצעות תוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים). עם זאת, יש לבחור תוכנת רכישה על בסיס מכונות MS. להלן מייצג מדריך להגדרת MS עם פרמטרים ספציפיים להפעלת פרוטוקול זה. לקבלת תיאור מפורט, עיין במדריך היצרן.
      1. להפרדה כרומטוגרפית, הכינו את הממסים הבאים 0.1% חומצה פורמית (A) ואצטוניטריל עם 0.1% חומצה פורמית (B).
      2. הגדר שיטה להפרדה כרומטוגרפית באמצעות הפרמטרים הבאים.
      3. הגדר את קצב הזרימה ל- 0.4 מ"ל/דקה.
      4. התנה את העמודה למשך 10 דקות ב- 2% B (~ 24 אמצעי אחסון של עמודות).
      5. באמצעות דוגם אוטומטי, הזריקו 10 μL של דגימה מסעיף 2.1.9.
        הערה: הפעל דגימה ראשונית אחת באמצעות פרוטוקול LC-MS לפני תחילת איסוף הנתונים. ריצה זו אינה משמשת לנתונים, אלא להגדלת יכולת השחזור של זמן השמירה עבור כל הריצות הבאות. יכולת השחזור של זמן השמירה נדרשת במהלך עיבוד ספקטרלי (סעיף 3.1) לצורך זיהוי וקיבוץ מדויקים של פסגות יחס מסה למטען (m/z).
      6. הפרידו את המורופפטידים באמצעות 2% B למשך 5 דקות (~12 נפחי עמודות), לאחר מכן הגדילו אותו ל-15% B במשך 13 דקות (~30 כרכי עמודות), הגדילו אותו ל-50% B במשך 10 דקות (~24 כרכי עמודות), ולבסוף הגדילו אותו ל-98% B במשך 2 דקות (~5 כרכי עמודות).
        הערה: יש להשליך (לשלוח לבזבוז) את 2 הדקות הראשונות ואת 5 הדקות האחרונות של מעבר הצבע.
      7. סיים עם שטיפת עמודות ב- 98% B למשך 6 דקות (~14 אמצעי אחסון של עמודות) ו- 20 דקות (~47 אמצעי אחסון של עמודות).
    3. ביצוע זיהוי ספקטרומטריית מסה של מורופפטידים
      1. כייל את ציר המסה במצב חיובי באמצעות תערובת כוונון באצטוניטריל המכיל תקני מסת ייחוס LC-MS בהתאם להוראות יצרן הטרשת הנפוצה.
        הערה: הטרשת הנפוצה מכוונת לפני תחילת הריצות הכרומטוגרפיות (סעיף 2.2.2.1).
      2. הגדר שיטה לרכישת נתוני MS באמצעות הפרמטרים הבאים.
        הערה: נתוני MS ו- MS/MS נאספים (סעיפים 2.2.3.2 עד 2.2.3.6) במקביל להפרדה הכרומטוגרפית של המורופפטידים (סעיפים 2.2.2.4 ו- 2.2.2.5). הן פרמטרים כרומטוגרפיים והן פרמטרים של MS (סעיפים 2.2.2.2 ו- 2.2.3.2) הם שיטה אחת המתווספת במהלך הגדרת רשימת עבודה להפעלת דגימות מרובות ברצף.
      3. הגדר את מתח הנימים של התרסיס החשמלי על 4.0 kV ואת טמפרטורת גז הייבוש על 350° C עם קצב זרימה של 13 L/min.
        הערה: חנקן (טוהר >99%) צריך לשמש כגז ערפיליזציה, ייבוש והתנגשות במהלך כל איסוף נתוני ספקטרומטריית המסות.
      4. הגדר את לחץ נבולייזר ל 40 psi והגדר את המקטע ל 150 V.
      5. הגדר את מתחי RF של הזרבובית, הרחפן והמתומן ל- 1000 V, 65 V ו- 750 V, בהתאמה.
      6. הגדר את טווח הסריקה ל- 300-2,000 m/z במצב יונים חיוביים של 4 GHz (טווח דינמי מורחב).
      7. הגדר איסוף נתונים באמצעות רכישת MS/MS תלוית נתונים עם קצב סריקה של MS ו- MS/MS של ספקטרה/שנייה אחת. בחר חמש מסות מקדימות בכל מחזור, בסדר של טעון יחיד, כפול ומשולש.
      8. הגדר את אנרגיות ההתנגשות של פיצול MS/MS ל- 15, 20 ו- 30 eV.

3. ניתוח דיפרנציאלי של שפע muropeptide

  1. עיבוד ספקטרלי של כרומטוגרמה LC-MS
    הערה: חילוץ תכונות רקורסיבי בוצע באמצעות תוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים). ניתן להשתמש בתוכנת חילוץ תכונות אחרת. עם זאת, תוכנות אחרות עשויות לדרוש עיבוד נתונים ידני נוסף כדי להשיג את החילוץ הרקורסיבי החזק ביותר. תוכנות שונות משתמשות בתכונת המינוח, הישות והתרכובת כמעט לסירוגין. עבור ניתוח PG, כולם מתייחסים לזיהוי של כרומטוגרמה יון LC-MS המייצגת של מורופפטיד בודד (לדוגמה, איור 3). במהלך עיבוד ספקטרלי (סעיף 3.1), תכונה מייצגת את פסגות m/z המרובות המקיפות את מיני היונים האפשריים המרובים של מורופפטיד יחיד המקובצים יחד תחת תווית מורכבת אחת.
    1. תחת קובץ, התחל פרוייקט חדש.
    2. הוסף את קבצי הנתונים LC-MS QTOF והקצה קבצי נתונים בודדים לתנאי / קבוצה ניסיוניים, למשל, שני תנאי גידול שונים.
    3. הפעל את אשף עיבוד הנתונים מיצוי תכונות רקורסיבי אצווה (מולקולות קטנות/פפטידים) והגדר את מסנני עיבוד הנתונים כך שיתאימו לפרמטרים של התנאים והמכשור של LC-MS כדי לזהות, לקבץ ולאמת במדויק פסגות m/z המייצגות מורופפטידים בודדים. מתוך הכרומטוגרמה, בדוק את סחף זמן השמירה ואת השונות של m/z של פסגות דומות ידועות כדי להגדיר פרמטרים ראשוניים של סינון.
      הערה: חילוץ תכונות רקורסיבי משתמש באלגוריתם חילוץ תכונות מולקולרי ראשוני לא ממוקד כדי לזהות וליישר תכונות כרומטוגרמה (פסגות m/z ) בכל קבצי הנתונים. לאחר יצירתן, תכונות אלה משמשות להערכה מחדש של קבצי הנתונים המקוריים (רקורסיביים) באמצעות אלגוריתם חילוץ תכונות מולקולרי ממוקד כדי לשפר את המהימנות והדיוק של התכונות שזוהו. עדיף להגדיר את החילוץ הראשוני הבלתי ממוקד עם חלון זיהוי צר ולהשתמש בפרמטרי זיהוי רחבים יותר עבור החילוץ הרקורסיבי כדי לזהות שיאים בכל קבצי הנתונים שעשויים להיות חסרים בחילוץ הראשוני. הפעלת חילוץ התכונות הרקורסיבי עשויה להימשך שעות בהתאם למספר הדגימות, מורכבות הנתונים וחומרת המחשב הקיימת
    4. סקור את תוצאות חילוץ התכונות. אם מספר משמעותי של תכונות לא הצליח להתיישר בקבוצה, התאם את פרמטרי הסינון הרקורסיבי כדי להרחיב/להגביל את חלון הזיהוי כנדרש. כדי להשיג זאת, בדוק את הכרומטוגרמה ואת הפרופיל האיזוטופי של כל תכונה שחולצה כדי לוודא שזיהוי התכונות בוצע באופן דומה בכל קבצי הנתונים. כמו כן, עבור כל תכונה מזוהה בתוך קובץ נתונים, בדוק את הניקוד, אזהרות כלשהן והאם התכונה עברה את פרמטרי הסינון שנבחרו.
      הערה: יש להקפיד לשמור על חלונות זיהוי צרים מספיק כדי שתכונות נפרדות לא יקובצו יחד בטעות. זה מצוין לעתים קרובות על ידי פרופילים איזוטופיים שונים בין קבצי נתונים, או שינויים משמעותיים m/z / זמן שמירה. לעומת זאת, אם יש מספר תכונות עם m/z וזמני שמירה דומים, ייתכן שהפרמטרים של המסנן היו מחמירים מדי וכתוצאה מכך שיא MS אחד פוצל לשתי תכונות. לכן, הפעל שוב חילוץ תכונות (סעיף 3.1.3) עם פרמטרים מותאמים של מסנן זמן שמירה כדי לאפשר קיבוץ טוב יותר של תכונות אלה. הדמיה של פסגות השפע הנמוכות ביותר תציין אם המסננים שבהם נעשה שימוש (סעיף 3.1.3) זיהו במדויק פסגות מעל רעשי רקע. אם פסגות השפע הנמוכות ביותר נראות דומות לרקע, הפעל מחדש את חילוץ התכונות עם פרמטרים חדשים של מסנן רקע.
    5. יצא נתונים כקובץ חילופי מורכב ( .cef) (תבנית התואמת לתוכנה הסטטיסטית), או כקובץ המופרד בין עמודות (.csv) המכיל את המסה, זמן השמירה והשפע של כל תכונה עבור כל דגימה.
  2. ניתוח דיפרנציאלי של תכונות ספקטרליות
    הערה: ניתוח דיפרנציאלי בוצע באמצעות תוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים). ניתן להשתמש בתוכנות ביואינפורמטיות אחרות.
    1. פתח את התוכנית וכאשר תתבקש להתחיל פרוייקט חדש.
    2. בצע את ההוראות לייבוא נתונים וניתוח נתונים. במהלך ייבוא הנתונים, העלה את הקבצים שחולצו מהתכונה (סעיף 3.1). במהלך ניתוח הנתונים, בחר מובהקות ושינוי קיפול לניתוח דיפרנציאלי ובחר לסמן נתונים בסיסיים לעוצמה החציונית בכל קבצי הנתונים. אל תגדיר מסנני נתונים כלשהם (אם הדבר נעשה בשלב עיבוד הספקטרום הקודם (סעיף 3.1)) מכיוון שהחלת מסננים שוב תשלול את חילוץ התכונות הרקורסיבי החזק. עם זאת, בדומה לחילוץ תכונות, ניתוח דיפרנציאלי חייב להיות מיושר בהתבסס על מסה (m/z) וזמן שמירה עקב סחף באיסוף הנתונים LC-MS. השתמש בפרמטרים שנקבעו בחילוץ תכונות (סעיף 3.1).
      הערה: נרמל בין קבצי נתונים באמצעות כימות muropeptide (סעיף 1.3) כדי להבטיח שהשינויים נובעים מפרמטרים ניסיוניים ולא משינויים בטיהור sacculi (סעיף 1.2). השתמש באפשרות הסקלר החיצוני כדי להתאים כל קובץ נתונים להבדלים בריכוז MurNAc בדגימה.
    3. לאחר השלמת הניתוח, בחנו את הניתוחים הגרפיים והסטטיסטיים המתקבלים כדי לזהות מורופפטידים המדגימים שינוי משמעותי בשפע בין תנאי הניסוי שנבדקו.
    4. תחת נווט הפרויקט, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הניתוחים השונים ובחר אפשרות ייצוא לשמירת פרטי תכונה כקובץ נתונים המופרד בעמודות (.csv) המכיל את m/z, זמן שמירה, ערכי עוצמה גולמיים ומנורמלים, ערך p, FDR ושינויי קיפול עבור כל תכונה. יש לשמור ניתוחים מרובים כדי לקבל את כל הנתונים הרלוונטיים.
    5. יצא קובץ .csv שני המכיל רק את המורופפטידים שעלו על הניתוחים הסטטיסטיים, כולל ערך p <0.05 ושינוי קיפול >2.
  3. ביאור זהות מורופפטיד לתכונות ספקטרליות
    הערה: לכל תכונה מזוהה יש להקצות מבנה מורופפטיד חזוי בהתבסס על m/z וביאור זה אושר על ידי בחינת פיצול MS/MS. לאחר אישור הביאורים, ייתכן שיהיה צורך לבצע ולחדד את הניתוח הדיפרנציאלי (סעיף 3.2).
    1. בתוך תוכנת ניתוח דיפרנציאלי, תחת פירוש תוצאות, בחר דפדפן מזהה. הוסף ספרייה של מבני muropeptide צפוי ובחר פרמטרים דומים כפי שהיה בשימוש בעבר (סעיף 3.1.3). פעולה זו תפיק ביאור מורופפטיד חזוי עבור כל תכונה מזוהה. ניתן לייצר ספרייה של מבני מורופפטיד באמצעות m/z עבור מבני מורופפטיד חזויים ותוכנת מסד נתונים של טרשת נפוצה (ראה טבלת חומרים). עם זאת, ספרייה של m/z של >6,000 muropeptides אפשריים ניתן למצוא בהפניה12.
    2. בחר את ביאור המורופפטיד החזוי בהתבסס על ציון ההתאמה והרלוונטיות הביולוגית של המורופפטיד החזוי, כלומר, בחר את המורופפטיד הסביר ביותר להימצא בדגימה הביולוגית.
    3. אשרו ידנית את ביאור המורופפטיד החזוי על-ידי השוואת פסגות m/z של כרומטוגרמה MS/MS ל-m/z החזוי של כל הפיצולים האפשריים של מבנה מורופפטיד ידוע (לדוגמה, איור 4).
      1. הצג את נתוני MS ו- MS/MS באמצעות תוכנית צפייה בכרומטוגרמה (ראה טבלת חומרים, איור 4).
      2. ציירו את מבנה המורופפטיד החזוי באמצעות עורך מולקולרי (תוכנית שרטוט מבנה כימי) (ראו טבלת חומרים, איור 4, כניסה אפורה). השתמש בכלי פיצול המסה כדי להציג את m/z של מקטעי MS כאשר כל קשר נשבר בנפרד או בשילוב.
        הערה: בהתאם לאנרגיית הפיצול המשמשת עבור MS/MS, פיצול יכול להתרחש בכל קשר במבנה המורופפטידים. עם זאת, קשרים מסוימים מתפצלים בקלות רבה יותר / לעתים קרובות יותר ברמות אנרגיה נמוכות יותר. לדוגמה, פיצול בשרשרת הצד הפפטידית מתרחש לרוב בקשר אמיד בין חומצות אמינו. בעת הערכת הפיצול, חשוב לציין כי שאריות GlcNAc מתפצלות בקלות רבה מהמורופפטיד. לכן, פיצול של מבנה muropeptide ידוע צריך להיות מוערך עם ובלי GlcNAc. בשל פיצול המקור של GlcNAc, מספר תכונות שחולצו בעיבוד ספקטרלי (סעיף 3.1) עשויות לייצג מבנה מורופפטיד יחיד. אם נמצאו, יש למזג תכונות אלה ולהעריך מחדש את הניתוח הדיפרנציאלי.
      3. השווה את כל הפיצולים האפשריים של מבנה המורופפטיד שנקבע (סעיף 3.3.3.2) לכרומטוגרמה MS/MS (סעיף 3.3.3.1). כדי לאשר את ביאור המורופפטידים, יש למצוא את פסגות m /z של מקטעים מרובים בכרומטוגרמה של MS/MS עם חלון יישור m/z מינימלי מאוד (איור 4).
      4. על מנת להבהיר את זהות המורופפטיד במקרה של פיצול MS/MS מעורפל, חזור על סעיפים 2.2.2 עד 2.2.3 עם דגימות (סעיף 2.1.9) לרכישת נתונים נוספים של MS/MS תוך שילוב רשימה מקדימה מועדפת של m/z וזמן שמירה עם אנרגיות התנגשות נוספות של פיצול MS/MS.
    4. עבור ישויות קו-אלוטינג שסומנו כאותו מורופפטיד, הפעל שוב את הניתוח הדיפרנציאלי (סעיף 3.2.2) ומיזג את התכונות שחולצו.
  4. הערכת שינויים גלובליים בשינויים muropeptide
    1. ערוך את קובץ .csv (סעיף 3.2.4) של המורופפטידים בעלי המובהקות הסטטיסטית של שינוי קיפול גבוה כדי לכלול עמודה אחת עבור כל שינוי muropeptide. אכלס עמודה זו עם ציון עבור כל muropeptide מבואר (סעיף 3.3) (למשל, acetylated לעומת de-N-acetylated GlcNAc או MurNAc).
    2. העלה את קובץ .csv שהשתנה לתוך Perseus22,23. יבא את ערכי העוצמה המנורמלים לתיבה ייבוא ראשי וייבא את ייעוד השינוי לתיבה ייבוא קטגורי.
    3. תחת הוסף הערות לשורות, לחץ על הוסף הערות קטגוריות , והוסף קובצי נתונים לכל פרמטר ניסיוני.
    4. תחת בדיקה, לחץ על שתי בדיקות לדוגמה כדי לבצע מבחן t של תלמיד (ערך p < 0.05, FDR < 0.05, s0 = 1).
    5. לחץ על 1D כדי לבצע ביאור 1D22,23. ביאור 1D FDR < 0.05 מצביע על שינוי משמעותי בשפע עבור שינוי muropeptide בין הפרמטרים הניסיוניים שנבדקו. הגדרת ערך הסף (s0) = 1 תציג את ציוני FDR הביאור 1D עבור כל המורופפטידים.
    6. בתוך תוכנת גרפים (ראו טבלת חומרים), הפיקו מפת חום של שינוי קיפול השפע עבור כל שינוי מורופפטיד והראו את ציון הביאור ה-1D כדי להדגים מובהקות (איור 5B). ניתן לייצר את שינוי הקיפול של כל שינוי muropeptide ב- Microsoft Excel באמצעות העוצמות הגולמיות של כל muropeptides בודדים המכילים את השינוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רגישות זיהוי מוגברת של מכונות טרשת נפוצה בשילוב עם תוכנת זיהוי שיא רבת עוצמה שיפרו את היכולת לבודד, לנטר ולנתח הרכבי חומרים של דגימות מורכבות בפירוט דק מאוד. באמצעות התקדמות טכנולוגית זו, מחקרים אחרונים על הרכב פפטידוגליקן החלו להשתמש בטכניקות מיצוי תכונות LC-MS אוטומטיות 12,13,14,24 על פני מתודולוגיה ישנה יותר מבוססת HPLC 11,25,26,27,28,29,30,31 . אף על פי שקיימות חבילות תוכנה רבות למיצוי תכונות גנריות, תוכנה מסחרית המשתמשת בחילוץ תכונות רקורסיבי היא מהירה וחזקה מאוד על-ידי זיהוי ושילוב אוטומטי של כל המטענים, האיזוטופים וגרסאות האדוקט של כל מורופפטיד שנמצא בתוך מערך הנתונים LC-MS (איור 3). בנוסף, זמני שמירה ראשוניים, m/z ודפוסים איזוטופיים של תכונות שחולצו משמשים להערכה מחדש (רקורסיבית) של מערך הנתונים כדי להבטיח זיהוי מדויק של כל תכונה בכל קבצי הנתונים. לכן, האלגוריתם הרקורסיבי מסייע באימות והגברת הביטחון בזיהוי שיא. רוב תוכניות חילוץ התכונות הגנריות אינן מקבצות מטענים/איזוטופים וכו'. וידרוש זאת כצעד ידני נוסף. בנוסף, תוכנות גנריות יהיו פחות חזקות מכיוון שהתכונות מחולצות בנפרד בתוך כל קובץ נתונים ולא כמערך נתונים שלם, שהוא חלק מהאלגוריתם הרקורסיבי.

הפרוטוקול הפפטידוגליקומי המוצג כאן שימש לאחרונה לבחינת השינויים בהרכב PG בין שני תנאי גדילה פיזיולוגיים, כלומר, ביופילם קהילתי בשחייה חופשית וביופילם קהילתי נייח12. באמצעות QTOF MS רגיש מאוד יחד עם מיצוי תכונה רקורסיבית, 160 muropeptides שונים זוהו ומעקב. זה ייצג פי שמונה ממספר המורופפטידים שזוהו באורגניזם זה קודם לכן 29,32, ויותר מכפול ממספר המורופפטידים שזוהו באמצעות מתודולוגיות אחרות באורגניזמים אחרים10,14,24.

שיוך כל שיא m/z המופק מנתוני הטרשת הנפוצה למורופפטיד מסוים מתאפשר על ידי הצלבה עם מסד נתונים של מבני מורופפטיד ידועים וחזויים. כרומטוגרמה MS/MS מפוצלת (איור 4) עבור כל תכונה שחולצה מושווית לפרופיל הפיצול (איור 4, כניסה אפורה) של המורופפטיד המוצע באמצעות מסד הנתונים.

ניתן לצפות בנתונים פפטידוגליקומיים במספר דרכים שונות בהתאם למערך הניסוי ולשאלות הנשאלות. ניתוח גרפי כזה יכול לכלול ניתוח רכיבים עיקריים (PCA), חלקות פיזור, חלקות הרי געש, מפות חום וניתוח אשכולות היררכיים. לדוגמה, חלקות הרי געש מדגישות מורופפטידים המדגימים שינוי מובהק סטטיסטית בעוצמה גבוהה של שפע בין התנאים שנבדקו (איור 5A). מורופפטידים נבחרים אלה, המייצגים שינויי שפע משמעותיים בין התנאים שנבדקו יכולים להיבדק עוד יותר עבור שינויים muropeptide. שינויים אלה יכולים לכלול נוכחות של תחליפי חומצות אמינו, שינויים אצטילציה, או נוכחות של פעילות amidase. כאשר בוחנים אותם יחד, ניתן לבחון מספר מורופפטידים בעלי אותו שינוי עבור מגמה לעבר תנאי ניסוי אחד (איור 5A – נקודות מודגשות בירוק) ולהעריך את הקבוצה כולה כמובהקות (איור 5B). מעקב אחר שינוי muropeptide בדרך זו, יכול להצביע על פעילות אנזימטית מסוימת המושפעת על ידי הפרמטר הניסוי. נוסף על כך, חריגות ממגמה זו עשויות להצביע על פעילות אנזימטית בעלת סגוליות מסוימת או תפקוד ביולוגי מסוים (איור 5A – נקודות מודגשות בכתום).

Figure 1
איור 1: דוגמה למבנה פפטידוגליקן גראם-שלילי טיפוסי. (A) בחיידקים גראם-שליליים, פפטידוגליקן ממוקם בפריפלסמה שבין הקרומים הפנימיים והחיצוניים. (B) מורופפטיד יחיד מורכב מ-N-אצטיל גלוקוזאמין מקושר β-1,4 (GlcNAc) (כחול) ומחומצה מורמית N-אצטיל (MurNAc) (סגול) עם שרשרת צדדית של פפטיד מצורף (כתום). ניתן להצליב את שרשרת הצד של הפפטיד לשרשרת הצדדית של המורופפטיד הסמוך ולייצר את הפפטידוגליקן דמוי הרשת הבוגר (A). טיהור כרוך בבידוד של הפפטידוגליקן מהתא כולו כעצה שבה כל חומר תאי אחר הופשט. (C) מיקרוגרף אלקטרונים תמסורת של סקולי פפטידוגליקן. לשם השוואה, PG גראם-חיובי יכול להיות מורכב ממגוון גדול יותר של וריאציות במבנה והוא חלק מסיווג טקסונומי גראם-חיובי33. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זרימת עבודה של Peptidoglycomics. הכנת מדגם. שלב 1, לגדל ו pellet תאי חיידקים (סעיף 1.1). שלב 2, לטהר פפטידוגליקן sacculi על ידי 4% SDS להרתיח (סעיף 1.2). איסוף נתונים. שלב 3, עיכול אנזימטי של סקולי לייצור מורופפטידים על ידי שבירה של הקשר β-1,4 בין N-אצטילגלוקוזאמין (GlcNAc) וחומצה N-אצטילמורמית (MurNAc) של עמוד השדרה הפפטידוגליקני (סעיף 2.1). שלב 4, ניתוח עוצמת המורופפטיד באמצעות LC-MS/MS (סעיף 2.2). ניתוח נתונים. שלב 5, מיצוי תכונות רקורסיבי מזהה ואוסף את כל המטענים, האדוקטים והאיזוטופים הקשורים למורופפטיד יחיד (סעיף 3.1). שלב 6, זיהוי מורופפטידים על ידי השוואת פיצול חזוי עם כרומטוגרמות MS/MS (סעיף 3.3). שלב 7, ניתוח דיפרנציאלי ביואינפורמטי (סעיף 3.2) המשווה שינויים בהרכב הפפטידוגליקן בין פרמטרים ניסיוניים שונים. שלב 8, לבחון את השינוי הגלובלי בשינויים במורופפטידים בתוך הפרמטרים הניסיוניים השונים באמצעות ביאור 1D (סעיף 3.4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דוגמה לחילוץ תכונות רקורסיבי. עבור מורופפטיד המייצג שרשרת צדדית פפטידית של אלנין (A), איזו-ᴅ-גלוטמט (E), חומצה מזו-דיאמינופימלית (m), אלנין (A) מוצלב ל-AE m A של שרשרת הצד הסמוכה של המורופפטיד (1864.8 m/z). התכונה המחולצת עבור 1864.8 m/z כוללת מטענים (+1, +2 ו- +3), אדדוקטים (למשל, נתרן ואשלגן), אובדן GlcNAc (1 או 2 GlcNAc), ופסגות איזוטופיות מרובות עבור כל וריאציה (למשל, כניסה מוגדלת). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פיצול וזיהוי מורופפטידים. לצורך ביאור, כל שיא m/z (תכונה) המופק מכרומטוגרמה של טרשת נפוצה מקבל מבנה מורופפטיד מוצע המבוסס על דמיון לספריית מורופפטידים. כדי לאשר מבנה מוצע זה, מקטעי MS/MS חזויים נוצרים באמצעות תוכנית ציור כימית (כניסה אפורה). פיצול חזוי זה מושווה לכרומטוגרמה של MS/MS. כאשר מקטעים חזויים (כניסה אפורה) תואמים את הכרומטוגרמה של MS/MS, מבנה המורופפטיד המוצע מאושר. הנתון שונה מהפניה12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח דיפרנציאלי של הרכב פפטידוגליקן. (A) תרשים הר הגעש של שינוי הקיפול ומובהקות סטטיסטית של שינויים בעוצמת המורופפטיד בין פפטידוגליקן מטוהר מ-P. aeruginosa שגדל כתרבית פלנקטונית או ביופילם נייחת בשחייה חופשית. כל המורופפטידים שיש להם שינוי שייצג שינוי בסידור חומצות האמינו הטיפוסי בתוך שרשרת הצד הפפטידית מודגשים. מורופפטידים תחליפי חומצות אמינו שהראו מגמה של ירידה בשפע בפפטידוגליקן שמקורו בביופילם מודגשים בירוק. חומצות אמינו החליפו מורופפטידים שהיו חריגים למגמה זו והראו שכיחות מוגברת בפפטידוגליקן שמקורו בביופילם מודגשים בכתום. (B) מפת חום של הקפל העולמי שינוי בשפע של כל חומצות האמינו שהחליפו את המורופפטידים בשפע מוגבר (כתום) וירידה בשפע (ירוק) בביופילמים. מורופפטידים אלה קובצו מחדש והוערכו אם החלפת חומצות אמינו התרחשה על מונומרים, דימרים מוצלבים, או אם הרביעית (AE m+), חמישית (AEmA+) או שתי חומצות האמינו (AEm++) הוחלפו. המובהקות של כל קבוצת מורופפטידים הוערכה על ידי ביאור 1D עם FDR < 0.05 עבור מובהקות וציון 1D המשויך מוצג. ביאור 1D יכול להתבצע רק על יותר מ -2 muropeptides (למשל, החלפת AEm++ נמצאה רק על שני muropeptides). לכן, במקרה זה, יש לבחון משמעות עבור המורופפטידים הבודדים ולא עבור הקבוצה. הנתון שונה מהפניה12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיהור פפטידוגליקן מתרביות חיידקים, תהליך לזיהוי LC-MS וניתוח הרכב באמצעות טכניקות ביואינפורמטיקה. כאן, אנו מתמקדים בחיידקים גראם-שליליים ויידרש שינוי קל כדי לאפשר ניתוח של חיידקים גראם-חיוביים.

הכנת muropeptides נשאר כמעט זהה מאז שהוא הופק לראשונה בשנת 1960 9,11,15. לאחר טיהור, sacculi (סעיף 1.2.18) מתעכלים לתוך muropeptides בודדים באמצעות האנזים muramidase mutanolysin מ Streptomyces globisporus. Mutanolysin מעכל את מבנה PG על-ידי שבירת הקישור β-1,4-glycosidic, שחרור muropeptides בודדים המורכבים מ-GlcNAc-MurNAc disaccharide עם שרשרת צדדית פפטידית מצורפת, וכולל כל שינוי או קישור צולב (איור 1).

מגבלה של מתודולוגיה קודמת ששימשה לחקר הרכב PG הייתה הזיהוי הידני הגוזל זמן רב של מורופפטידים. בשל המורכבות והקושי, אדוקטים, מטענים ו / או איזוטופים עשויים להיכלל או לא להיכלל בניתוח. בנוסף, רוב המחקרים הגבילו את האנליזה לנפוצים ביותר, ולכן הקלה ביותר לטיהור, muropeptides. לכן, בגלל האופי המסובך של המתודולוגיה, בוצעו יחסית מעט ניתוחי הרכב PG מפורטים ברמה גבוהה. הניתוחים מסוג "omic" השתמשו בשיפורים טכנולוגיים אחרונים לייצור וניתוח סטטיסטי של מערכי נתונים LC-MS גדולים ומורכבים יחסית לסקירה ברמה גבוהה של מערכות ביולוגיות. היישום של peptidoglycomics יאפשר ניתוח של הרכב PG בפירוט דק מאוד.

בתוך peptidoglycomics, חילוץ תכונות רקורסיבי מפחית עומס עבודה ידני ומגביר את הדיוק על ידי בדיקת כל קבצי הנתונים בבת אחת. אלגוריתם חילוץ תכונות רקורסיבי משמש לזיהוי, יישור וקיבוץ תכונות ספקטרליות ייחודיות (פסגות m/z) על פני קבצי נתונים כרומטוגרפיים מרובים LC-MS, מה שהופך את זיהוי פסגות m/z muropeptide לאוטומטי. אלגוריתם זה משתמש בהתאמת תבניות איזוטופיות אשר לוקחת את האיזוטופים הפוטנציאליים הרבים, צינורות היונים ומצבי המטען ומעבה את פסגות m/z המרובות לתרכובת (או תכונה) יחידה מייצגת שלה, אשר במקרה זה תייצג מורופפטיד יחיד (איור 3). אימות של קבוצת התכונות הספקטרליות מתבצע על ידי השוואת זמן שמירה, m/z והתאמת תבניות איזוטופיות בתוך כל קובץ נתונים כרומטוגרפי כדי להבטיח חילוץ חזק של התכונה בכל מערך הנתונים. אלגוריתמים כלליים למציאת תכונות עשויים שלא לכלול התאמת איזוטופים או ליישור, לקבץ או לאמת פסגות m/z על פני דגימות מרובות וידרשו עיבוד נתונים ידני נוסף כדי לבצע חילוץ תכונות זה.

לאחר זיהוי התכונות, אלגוריתמי ניתוח דיפרנציאלי ביואינפורמטי מטפלים במערך הנתונים הגדול מאוד בכללותו, ובכך מאפשרים השוואות ופרשנויות שימושיות מהנתונים המורכבים. שימוש בניתוחים גרפיים ביואינפורמטיים אלה הוא דרך רבת עוצמה לדמיין ולפרש מערכי נתונים גדולים כדי לבחון מגמות שעשויות להצביע על תהליכים ביולוגיים. רק לאחרונה נעשה שימוש בניתוחים גרפיים רבי עוצמה אלה כדי לבחון פפטידוגליקן בפירוט דק מאוד12. ניתוח דיפרנציאלי (סעיף 3.2) מעריך את השינויים בשפע של מורופפטידים בודדים בין תנאי ניסוי שונים. עם זאת, בהקשר של תאי חיידקים שלמים, הפעילות של אנזימים משנים PG יכולה לגרום למספר מבנים מורופפטידים נפרדים בהתאם לספציפיות של הפעילות הקטליטית (כלומר, תוספת של קבוצת אצטיל על הדיסכריד יכולה להיות עם או בלי שינוי של שרשרת הצד הפפטידית). לכן, הערכת שינויי השפע הגלובליים של שינוי מסוים בכל המורופפטידים המבוארים הבודדים תיתן תובנה על הפעילות האנזימטית הפועלת על PG (איור 5) לכן, ניתוח דיפרנציאלי משמש לחקר שינויי השפע של מורופפטידים בודדים; והואיל וביאור 1D בוחן שינויי שפע של שינוי PG מסוים. ניתוח דיפרנציאלי צימוד עם ביאור 1D מאפשר להעריך את הרכב PG הן ברמת מורופפטיד בודד והן כאינדיקטור לפעילות האנזימטית הכוללת של PG.

במהלך אנליזה דיפרנציאלית, חשוב לציין כי PG מורכב מכמה מורופפטידים נפוצים מאוד ומורופפטידים רבים בשפע נמוך12. לכן, הבסיס חשוב מאוד על מנת להסיר כל הטיה מן muropeptides שפע גבוה במהלך השלבים המאוחרים של הניתוח. כמו כן, בשל בדיקות t מרובות שבוצעו, יש ליישם תיקון סטטיסטי כדי להפחית את התוצאות החיוביות הכוזבות. ברירת המחדל היא לעתים קרובות שיעור גילוי השווא של בנימיני-הוכברג (FDR)19. תיקונים אחרים כגון שיעור שגיאות המשפחה השמרני יותר של בונפרוני (FWER)20,21 אפשריים.

בתוך התוכנה הביואינפורמטיקה, שיא m/z שזוהה בחילוץ תכונות מוקצה גם הוא מבנה חזוי. ניתוחים אחרים מסוג "omic" (למשל, פרוטאומיים) נהנים מהזמינות של מסדי נתונים מורכבים גדולים, המאפשרים זיהוי תרכובות באמצעות התאמת ספקטרום פיצול חזוי. נכון לעכשיו, לא קיימת ספריית פיצול חזויה של מורופפטיד ואישור זיהוי המורופפטיד נותר שלב ידני. עם זאת, ככל שמסדי נתונים של פיצול peptidoglycomic יתפתחו ויהפכו לזמינים לציבור, שלב זיהוי ידני זה יהפוך לאוטומטי ונגיש יותר על ידי ביטול או צמצום משמעותי של סעיפים 3.3.3 ו- 3.3.4.

ב Escherichia coli, PG מורכב ~ 3.5 x 106 muropeptides לכל תא34. במסגרת מגבלות הזיהוי של QTOF MS, אפילו המורופפטידים בעלי השכיחות הנמוכה ביותר עדיין יכולים לייצג מאות עותקים של מורופפטיד יחיד בתוך תא12. לכן, הבנת השינויים אפילו במורופפטידים בעלי השכיחות הנמוכה ביותר עשויה לספק תובנות שימושיות לגבי הפעילות הביולוגית של אנזימים ממוקדי PG בתוך התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לד"ר ג'ניפר גדס-מקאליסטר ולד"ר אנתוני קלארק על תרומתם בשכלול פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי תפעול מ- CIHR שהוענקו ל- C.M.K (PJT 156111) ו- NSERC אלכסנדר גרהם בל CGS D שהוענק ל- E.M.A. הנתונים נוצרו ב- BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) Agilent LC-MS data acquisition
Heating mantle controller, Optichem Fisher 50-401-788 for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL Hemispherical Fisher CG1000008 for 4% SDS boil
Incubator, 37°C for sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40, Fisher CG121805 for 4% SDS boil
Lyophilizer Labconco for lyophilization of sacculi
Magentic stirrer Fisher 90-691-18 for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 Aglient LC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm Fisher 50-197-9573 cleanup of sample before MS injection
Retort stand Fisher 12-000-102 for 4% SDS boil
Retort clamp Fisher S02629 for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrex Fisher 07-250-084 for 4% SDS boil
Sonicator model 120 Fisher FB120 for sacculi purification
Sonicator - micro tip Fisher FB4422 for sacculi purification
Ultracentrifuge Beckman sacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45 Fisher NC9691797 sacculi wash steps
Water supply City for water cooled condenser
Software
Chemdraw Cambridgesoft molecular editor for muropeptide fragmentation prediction
Excel Microsoft viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter Acquisition Aglient running QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professional Aglient bioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager Aglient muropeptide m/z MS database
MassHunter Profinder Aglient recursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysis Aglient viewing MS and MS/MS chromatograms
Prism Graphpad Graphing software
Perseus Max Plank Institute of Biochemistry 1D annotation
Material
Acetonitrile Fisher A998-4
Ammonium acetate Fisher A637
Amylase Sigma-Aldrich A6380
Boric acid Fisher BP168-1
DNase Fisher EN0521
Formic acid Sigma-Aldrich 27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321 Agilent G1969-85000
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 Sigma-Aldrich M9901
Nitrogen gas (>99% purity) Praxair NI 5.0UH-T
Phosphoric acid Fisher A242
Pronase E from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
RNase Fisher EN0531
Sodium azide Fisher S0489
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166
Sodium hydroxide Fisher S318
Sodium Phosphate (dibasic) Fisher S373
Sodium Phosphate (monobasic) Fisher S369
Stains-all Sigma-Aldrich E9379

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
  4. Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
  6. Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
  7. Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
  8. Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
  9. Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
  10. Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
  11. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
  12. Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
  13. van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
  14. Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
  15. Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
  16. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  17. Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
  18. Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
  19. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  20. Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
  21. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
  22. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  23. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
  24. Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
  25. Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
  26. Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
  27. Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
  28. Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
  29. Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
  30. Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
  31. De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
  32. Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
  33. Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
  34. Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).

Tags

Retraction גיליון 164 פפטידוגליקן מורופפטידים ספקטרומטריית מסות מיצוי תכונות אנליזה דיפרנציאלית ביואינפורמטיקה פפטידוגליקומיקס
ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, E. M., Greenwood, N. A.,… More

Anderson, E. M., Greenwood, N. A., Brewer, D., Khursigara, C. M. Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics. J. Vis. Exp. (164), e61799, doi:10.3791/61799 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter