Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Semi-kvantitativ analyse av peptidoglykan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatikk

Published: October 13, 2020 doi: 10.3791/61799
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

Summary

Denne protokollen dekker en detaljert analyse av peptidoglykansammensetning ved bruk av væskekromatografi massespektrometri kombinert med avansert funksjonsekstraksjon og bioinformatisk analyseprogramvare.

Abstract

Peptidoglykan er en viktig komponent i bakterielle cellevegger og et felles cellulært mål for antimikrobielle stoffer. Selv om aspekter av peptidoglykanstrukturen er ganske bevart på tvers av alle bakterier, er det også betydelig variasjon mellom grampositive/negative og mellom arter. I tillegg er det mange kjente variasjoner, modifikasjoner eller tilpasninger til peptidoglykan som kan forekomme innenfor en bakterieart som respons på vekstfase og / eller miljøstimuli. Disse variasjonene produserer en svært dynamisk struktur som er kjent for å delta i mange cellulære funksjoner, inkludert vekst / deling, antibiotikaresistens og vertforsvarsunngåelse. For å forstå variasjonen innen peptidoglykan må den samlede strukturen brytes ned i dens bestanddeler (kjent som muropeptider) og vurderes for total cellulær sammensetning. Peptidoglycomics bruker avansert massespektrometri kombinert med kraftig bioinformatisk dataanalyse for å undersøke peptidoglykansammensetningen i detalj. Følgende protokoll beskriver rensing av peptidoglykan fra bakteriekulturer, oppkjøp av muropeptidintensitetsdata gjennom et væskekromatograf-massespektrometer og differensialanalyse av peptidoglykansammensetning ved bruk av bioinformatikk.

Introduction

Peptidoglykan (PG) er en definerende egenskap for bakterier som tjener til å opprettholde cellemorfologi, samtidig som det gir strukturell støtte til proteiner og andre cellulære komponenter 1,2. Ryggraden i PG består av alternerende β-1,4-bundet N-acetyl muraminsyre (MurNAc) og N-acetylglukosamin (GlcNAc) 1,2. Hver MurNAc har et kort peptid bundet ved ᴅ-laktylresten som kan kryssbindes til tilstøtende disakkaridbundne peptider (figur 1A,B). Denne tverrbindingen gir en maskelignende struktur som omfatter hele cellen og blir ofte referert til som en sacculus (figur 1C). Under PG-syntese genereres forløpere i cytoplasma, og transporteres over cytoplasmatisk membran av flippaser. Forløpere blir deretter inkorporert i den modne PG av transglykosylase og transpeptidase-enzymer, som produserer henholdsvis glykosid- og peptidbindingene3. Når de er montert, er det imidlertid mange enzymer produsert av bakteriene som modifiserer og / eller nedbryter PG for å utføre en rekke cellulære prosesser, inkludert vekst og deling. I tillegg har ulike modifikasjoner av PG vist seg å gi tilpasninger som er spesifikke for belastning, vekstforhold og miljøstress, som har vært involvert i cellesignalering, antimikrobiell resistens og vertsimmununndragelse4. Som eksempler er en vanlig modifikasjon tilsetningen av en C6-acetylgruppe på MurNAc som gir motstand ved å begrense tilgangen til glykanen β-1,4-koblinger til vertsproduserte lysozymenzymer som nedbryter PG 4,5,6. I enterokokker gir substitusjon av den terminale ᴅ-Ala av peptidsidekjeden med ᴅ-Lac en større motstand mot det antimikrobielle vankomycinet 7,8.

Den generelle prosedyren for PG-isolering og rensing har vært relativt uendret siden den ble beskrevet på 1960-tallet9. Bakteriemembraner oppløses gjennom varmebehandling med SDS, etterfulgt av enzymatisk fjerning av bundne proteiner, glykolipider og gjenværende DNA. Den rensede intakte sacculus kan deretter fordøyes i de enkelte komponentene ved hydrolyse av β-1,4-koblingen mellom GlcNAc og MurNAc. Denne fordøyelsen produserer GlcNAc-MurNAc disakkarider med eventuelle strukturelle modifikasjoner og/eller tverrbindinger intakt og kalles muropeptider (figur 1B).

Komposisjonsanalyse av PG ble først utført gjennom høytrykksvæskekromatografisk separasjon (HPLC) for å rense hvert muropeptid etterfulgt av manuell identifisering av muropeptider10,11. Dette har siden blitt erstattet av væskekromatografitandemmassespektrometri (LC-MS), noe som øker deteksjonsfølsomheten og reduserer den manuelle arbeidsbelastningen for rensing av hvert enkelt muropeptid. Imidlertid har den tidkrevende og komplekse karakteren av manuell identifisering av muropeptider forblitt en begrensende faktor, noe som reduserer antall utførte studier. I de senere år med fremveksten av "omic" teknologier, har automatisert LC-MS funksjonen ekstraksjon blitt et kraftig verktøy, noe som muliggjør rask deteksjon og identifisering av individuelle forbindelser i komplekse prøver fra svært store datasett. Når funksjonene er identifisert, sammenligner bioinformatisk programvare statistisk variasjonen mellom prøver ved hjelp av differensialanalyse isolerer selv minimale forskjeller mellom det komplekse datasettet og viser dem grafisk til brukeren. Anvendelsen av funksjonsutvinningsprogramvare for analyse av PG-sammensetning har bare så vidt begynt å bli utforsket 12,13,14 og koblet til bioinformatisk analyse 12. I motsetning til proteomisk analyse som drar nytte av de lett tilgjengelige proteindatabasene som forutsier peptidfragmentering som muliggjør helautomatisk identifikasjon, eksisterer det for tiden ikke noe fragmenteringsbibliotek for peptidoglytegnika. Imidlertid kan funksjonsutvinning kombineres med kjente og predikerte strukturelle databaser for å forutsi muropeptididentifikasjon12. Her presenterer vi en detaljert protokoll for bruk av LC-MS-basert egenskapsekstraksjon kombinert med et muropeptidbibliotek for automatisert identifikasjon og bioinformatisk differensialanalyse av PG-sammensetning (figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Peptidoglykanprøvepreparering

  1. Vekst av bakteriekulturer
    MERK: Veksten av bakteriekulturer vil variere avhengig av bakteriearter og vekstforhold som undersøkes. De eksperimentelle parametrene som skal testes vil definere vekstbetingelsene.
    1. Dyrk bakteriekulturer under vekstforhold som kreves for bakteriestammen og eksperimentell design. Dyrk bakterier som triplikate kulturer (biologiske replikater), dvs. tre separate kolonier per stamme eller veksttilstand.
      MERK: Vekstforhold og vekstfase er kjent for å ha signifikante effekter på PG-sammensetningen 1,2,10. Det må utvises stor forsiktighet for å opprettholde konsistens mellom kulturer og replikater for å sikre at sammensetningsendringer skyldes eksperimentelle parametere og ikke eksperimentelle feil.
    2. Avkjøl kulturen raskt til 4 °C, samle opp ved sentrifugering (11 000 x g, 10 min, 4 °C) og frys ned cellepelleten ved -20 °C. Vask cellepelleten med forkjølt 4 °C, 20 mM natriumfosfat pH 6,5 før frysing. Produksjonen av den frosne cellepelleten bør gjøres så raskt og så konsekvent mellom prøvene som mulig for å begrense aktiviteten til enzymer som kan modifisere og/eller nedbryte PG under innsamlingsprosessen. Prøver kan behandles direkte gjennom ekstraksjonsprosessen (pkt. 1.2) uten frysing; Sørg imidlertid for at alle prøver behandles på samme måte.
      MERK: For å sikre tilstrekkelig produkt for senere trinn, brukes en våtcellepellet av betydelig størrelse. Dette gir en stor nok sakkulipellet, som lett visualiseres og vedlikeholdes under de repeterende vasketrinnene (pkt. 1.2.5 og 1.2.14) uten betydelig tap av produkt. Avhengig av bakterie og vekstforhold, vil dette utbyttet sannsynligvis variere. For den gramnegative bakterien Pseudomonas aeruginosa produserte PAO1, 4 l av en 0,5 OD 600-kultur en 3-4 g cellepellet og var tilstrekkelig til å produsere ~10 mg renset sacculi (pkt. 1.2.17) 12. Dette er et stort overskudd av sacculi enn det som kreves for LC-MS (avsnitt 2); Det vil imidlertid hjelpe til med målenøyaktighet (avsnitt 1.2.17) og normalisering (avsnitt 1.3).
  2. Ekstraksjon av peptidoglycan sacculi
    MERK: Protokollen for utvinning av PG er tilpasset fra ref.9,11,15. Denne protokollen vil trekke ut PG fra individuelle bakterieceller som en hel sacculi, fri for andre cellulære komponenter. Protokollen kan brukes med enten gramnegative eller gram-positive bakterier. For grampositive celler kan det imidlertid være nødvendig med justeringer for å isolere den tykkere PG-strukturen og for å fjerne celleveggassosierte polymerer; som teichoic syrer.
    1. Resuspendere frosne cellepellets ved ca. 1:10 av det opprinnelige dyrkningsvolumet på 20 mM natriumfosfat pH 6,5. Utfør dette trinnet ved 4 °C (kan være 1–8 mg våtcellepelletsvekt per ml buffer11,12).
      MERK: For å opprettholde acetyleringstilstanden til PG, kreves en pH på 6,5 eller lavere15,16.
    2. Tilsett cellesuspensjon dråpevis til koking av 8 % natriumdodecylsulfat (SDS) 20 mM natriumfosfat pH 6,5 for et endelig 1:1-volum (dvs. endelig konsentrasjon er 4 % SDS), under omrøring forsiktig i en rundbunnskolbe utstyrt med en vannkjølt kondensator. (Figur 2, trinn 2)
    3. Oppretthold en mild koking i 30 minutter til 3 timer under omrøring for å sikre fullstendig membrandissosiasjon. Sørg for at den resulterende blandingen er helt klar uten gjenværende celleklumper eller viskositet. Lengre koking foretrekkes for å garantere fullstendig dissosiasjon.
    4. La den avkjøles til romtemperatur. Prøven kan stå i romtemperatur over natten.
      MERK: Når SDS er til stede, oppretthold prøver ved romtemperatur for å holde SDS i løsningen.
    5. Samle sacculi som en pellet gjennom ultrasentrifugering ved 70 000 x g i 40 minutter (eller tiden det tar å sedimentere sacculi) ved 25 ° C.
    6. Vask sakkuli gjentatte ganger ved suksessiv ultrasentrifugering (pkt. 1.2.5) og suspensjon i ~50 ml romtemperatur 20 mM natriumfosfat pH 6,5 til vaskebufferen har en SDS-konsentrasjon ~0,001%. Vanligvis er 5 til 7 vasker tilstrekkelig.
      MERK: For å teste konsentrasjonen av gjenværende SDS i vaskebufferen, bruk kolorimetrisk fargestoff, Stains-all17.
    7. Resuspender sacculi i 5-10 ml romtemperatur 20 mM natriumfosfat pH 6,5.
    8. Sonikere prøven kort (~ 40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) ved romtemperatur for å spre klumper.
      MERK: Utvidet sonikering vil mekanisk forårsake skjæring av PG-strukturen18.
    9. Suppler prøven med 50 μg / ml hver amylase, DNase og RNase, 10 mM magnesiumsulfat, og fordøy ved 37 ° C i 1 time med omrøring eller muttering.
      MERK: Amylase fordøyelse fjerner gjenværende glykogen fanget i sacculi11.
    10. Tilsett 100 μg/ml pronase og fordøy ved 37 °C over natten med omrøring eller nutasjon og ~0,02 % natriumazid.
      MERK: Pronase fordøyelse fjerner tilsatte enzymer (fra seksjon 1.2.9) og fjerner lipoproteiner som er kovalent knyttet til PG.
      FORSIKTIG: Natriumazid er svært giftig og krever riktig bruk / avhendingsmetoder.
    11. Ultrasentrifuge ved 70 000 x g i 40 minutter (eller tiden det tar å sedimentere sakkuli fullstendig) ved 25 °C for å fjerne natriumazid.
    12. Resuspender pelleten i 25 ml 2% SDS 20 mM natriumfosfat pH 6,5.
    13. Kok i 1 time i en dampbåt eller den runde bunnkolben med vannkjølt kondensator (seksjon 1.2.2).
      MERK: Det andre SDS-koketrinnet fjerner alle gjenværende proteiner og forurensninger fra sacculi.
    14. Gjenta sakkulivasken (pkt. 1.2.6) med ~50 ml romtemperert dobbeltdestillert vann (ddH2O) til SDS-konsentrasjonen er ~0,001 %.
    15. Resuspender pelleten i en tilstrekkelig mengde ddH2O til å suspendere sacculi, samt vaske beholderen (f.eks. 25 ml) og fryse over natten ved -80 °C. Volumet kan variere ettersom prøven vil bli lyofilisert i neste trinn, selv om mindre volumer krever mindre tid til lyofilisere.
    16. Neste dag, lyofiliser suspensjonen og oppbevar ved romtemperatur.
    17. Mål mengden lyofiliserte sacculi oppnådd på en analytisk balanse.
    18. Fortynn sacculi i ddH2O til 10 mg / ml og kort sonikere for å bryte opp klumper før videre analyse.
  3. Kvantifisering av renset peptidoglykan
    1. Kvantifiser mengden rensede sekker fra seksjon 1.2.18 for å sikre at massespesifikasjonsdata utjevnes under differensialanalyse (avsnitt 3.2). Følg den detaljerte metodikken som er beskrevet i referanse15.
      MERK: Rensede sekkler (pkt. 1.2.18) brytes ned i individuelle sukker- og aminosyrekomponenter ved syrehydrolyse. Individuelle komponenter separeres og kvantifiseres ved anionbyttekromatografi ved hjelp av pulserende-amperometrisk deteksjon. Gitt strukturen til PG (figur 1), består individuelle muropeptider av en enkelt MurNAc og en enkelt GlcNAc-rest. Derfor representerer kvantifisering av konsentrasjonen av hver rest mengden muropeptider 1: 1 i prøven. MurNAc foretrekkes på grunn av den rene toppseparasjonen fra andre PG-komponenter under kromatografi16.

2. Massespektrometri datainnsamling

  1. Fremstilling av muropeptider for massespektrometri
    1. Tilsett 800 μg renset sekkekuli med 100 μg/ml mutanolysin, 100 mM ammoniumacetat pH 5,5 og 50 mM magnesiumklorid i en 100 μL reaksjon.
    2. Fordøyes ved 37 °C over natten.
    3. Tilsett 1: 1 volum 0,5 M boratbuffer pH 9,0 og suppler med ~ 10 mg / ml natriumborhydrid (NaBH4).
      MERK: Mutarotasjon av sykliske sukkerarter mellom α og β anomere former vil forårsake flere toppformasjoner under væskekromatografiseparasjonen av muropeptidene. Behandlingen med NaBH4 eliminerer omdannelsen mellom de to formene ved å redusere MurNAc til muramitol11. Behandlingen reduserer ikke 1,6-anhydro MurNAc eller 1,4-bundne sukkerrester.
      FORSIKTIG: Reaksjonen av NaBH4 produserer små mengder hydrogengass. NaBH4-reaksjonen vil skape bobler og mikrofugerør bør holdes åpne for å la gass slippe ut.
    4. Inkuber prøven ved romtemperatur i ~20–30 min.
    5. Sentrifuge kort for å avgjøre prøven i mikrofugerøret og fjerne bobler.
    6. Juster pH til <4,0 ved bruk av 1:5 fosforsyre, tilsatt i trinn på 5 μL. Test pH ved hjelp av lakmus pH-teststrimler.
    7. Sentrifuge ved ~ 17.000 x g i 1 min for å sedimentere gjenværende uoppløselig materiale.
    8. Filtrer ved hjelp av 0,2 μm mikrosentrifugefiltre.
    9. Prøvene sentrifugeres i 10 minutter ved 30 000 x g før injeksjon i LC-MS for å sikre at eventuelle partikler ikke injiseres i MS.
  2. Oppsett av LC-MS
    1. Fest en C18 overfladisk porøs partikkelkolonne (100 mm x 2,1 mm, porestørrelse <3 μm) til et kvadrupole-time of flight (QTOF) massespektrometer med en minimal fire desimalpunkt m / z deteksjonsnøyaktighet.
    2. Utfør væskekromatografiseparasjon av muropeptider
      MERK: Hvert biologisk triplikat (seksjon 1.1.1) skal kjøres gjennom LC-MS (pkt. 2.2.2 til 2.2.3) tre ganger (teknisk triplikat). Derfor vil hver testet tilstand ha totalt ni LC-MS-datafiler. Datainnsamlingen ble utført med kommersielt tilgjengelig programvare (se Materialfortegnelse). Imidlertid bør anskaffelsesprogramvare velges basert på MS-maskineriet. Følgende representerer en veiledning for å sette opp MS med parametere som er spesifikke for å kjøre denne protokollen. For en detaljert beskrivelse, se produsentens håndbok.
      1. For kromatografisk separasjon, fremstill følgende løsningsmidler 0, 1% maursyre (A) og acetonitril med 0, 1% maursyre (B).
      2. Definer en metode for kromatografisk separasjon ved hjelp av følgende parametere.
      3. Sett strømningshastigheten til 0,4 ml/min.
      4. Kondisjoner kolonnen i 10 minutter ved 2 % B (~24 kolonnevolumer).
      5. Bruk en automatisk prøvetaker, injiser 10 μL prøve fra pkt. 2.1.9.
        MERK: Kjør en innledende prøve gjennom LC-MS-protokollen før du begynner datainnsamlingen. Denne kjøringen brukes ikke for data, men for å øke reproduserbarheten av oppbevaringstiden for alle påfølgende kjøringer. Reproduserbarheten av retensjonstiden er nødvendig under spektral prosessering (pkt. 3.1) for nøyaktig identifisering og gruppering av topper i masse-til-ladningsforhold (m/z).
      6. Separat muropeptider ved hjelp av 2% B i 5 min (~ 12 kolonnevolumer), deretter øke den til 15% B over 13 min (~ 30 kolonnevolumer), ytterligere øke den til 50% B over 10 min (~ 24 kolonnevolumer), og til slutt øke den til 98% B over 2 min (~ 5 kolonnevolumer).
        MERK: Kast (send til avfall) de første 2 min og siste 5 min av stigningen.
      7. Avslutt med en kolonnevask ved 98% B i 6 min (~ 14 kolonnevolumer) og 20 min (~ 47 kolonnevolumer) re-likevekt.
    3. Utføre massespektrometri påvisning av muropeptider
      1. Kalibrer masseaksen i positiv modus ved hjelp av en innstillingsblanding i acetonitril som inneholder LC-MS-referansemassestandarder i henhold til MS-produsentens instruksjoner.
        MERK: MS er innstilt før begynnelsen av kromatografiske løp (seksjon 2.2.2.1).
      2. Sett opp en metode for MS-datainnhenting ved hjelp av følgende parametere.
        MERK: MS- og MS/MS-data samles inn (pkt. 2.2.3.2 til 2.2.3.6) samtidig med kromatografisk separasjon av muropeptidene (pkt. 2.2.2.4 og 2.2.2.5). Både kromatografiske og MS-parametere (seksjon 2.2.2.2 og 2.2.3.2) er en enkelt metode som legges til under oppsettet av en arbeidsliste for å kjøre flere prøver i rekkefølge.
      3. Still inn kapillærspenningen for elektrospray på 4,0 kV og tørkegasstemperaturen ved 350 °C med en strømningshastighet på 13 l/min.
        MERK: Nitrogen (renhet >99 %) skal brukes som forstøving, tørking og kollisjonsgass under all datainnsamling om massespektrometri.
      4. Sett forstøvertrykket til 40 psi og sett fragmentoren til 150 V.
      5. Sett dyse-, skimmer- og oktapol RF-spenningene til henholdsvis 1000 V, 65 V og 750 V.
      6. Sett skanneområdet til 300–2 000 m/z i positiv ion-modus på 4 GHz (utvidet dynamisk område).
      7. Angi datainnsamling ved hjelp av dataavhengig MS/MS-innsamling med en MS- og MS/MS-skannefrekvens på 1 spektra/sekund. Velg fem forløpermasse per syklus, i rekkefølgen enkeltvis, dobbelt og trippelt ladet.
      8. Sett MS/MS-fragmenteringskollisjonsenergier til 15, 20 og 30 eV.

3. Differensiell analyse av muropeptid overflod

  1. LC-MS kromatogramspektral prosessering
    MERK: Rekursiv funksjonsuttrekking ble utført ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare (se Materialfortegnelse). Andre funksjoner utvinning programvare kan brukes. Imidlertid kan annen programvare kreve ytterligere manuell databehandling for å oppnå den svært robuste rekursive ekstraksjonen. Ulike programvare bruker terminologifunksjonen, enheten og forbindelsen nesten om hverandre. For PG-analyse refererer alle til identifisering av LC-MS-ionkromatogrammet som representerer et individuelt muropeptid (f.eks. figur 3). Under spektral prosessering (seksjon 3.1) representerer en formasjon de mange m / z-toppene som omfatter flere mulige ionarter av et enkelt muropeptid som er gruppert sammen under en enkelt sammensatt etikett.
    1. Start et nytt prosjekt under Fil.
    2. Legg til LC-MS QTOF datafiler og tilordne individuelle datafiler til en eksperimentell tilstand / gruppe, for eksempel to forskjellige vekstbetingelser.
    3. Kjør databehandlingsveiviseren Batch rekursiv funksjonsekstraksjon (små molekyler / peptider) og sett databehandlingsfiltrene til å matche parametrene til LC-MS-forholdene og instrumenteringen for nøyaktig å identifisere, gruppere og verifisere m / z-topper som representerer individuelle muropeptider. Fra kromatogrammet, undersøk retensjonstidsdriften og variasjonen av m / z av kjente lignende topper for å angi innledende filterparametere.
      MERK: Rekursiv funksjonsuttrekking bruker en innledende ikke-målrettet molekylær funksjonsutvinningsalgoritme for å identifisere og justere kromatogramfunksjoner (m / z-topper ) på tvers av alle datafilene. Når de er opprettet, brukes disse funksjonene til å revurdere de opprinnelige datafilene (rekursive) med en målrettet molekylær funksjonsutvinningsalgoritme for å forbedre påliteligheten og nøyaktigheten til de identifiserte funksjonene. Det er best å angi den første ikke-målrettede uttrekkingen med et smalt gjenkjenningsvindu og bruke bredere deteksjonsparametere for den rekursive uttrekkingen for å identifisere topper i alle datafiler som kan mangle i den første uttrekkingen. Det kan ta timer å kjøre den rekursive funksjonsuttrekkingen, avhengig av antall prøver, kompleksiteten til dataene og maskinvaren som finnes
    4. Se gjennom resultatene av funksjonsuttrekkingen. Hvis et betydelig antall funksjoner ikke kunne justeres i en gruppe, justerer du de rekursive filtreringsparameterne for å utvide/begrense gjenkjenningsvinduet etter behov. For å oppnå dette, inspiser kromatogrammet og isotopprofilen for hver ekstraherte funksjon for å sikre at funksjonsdeteksjon ble utført på samme måte på tvers av alle datafiler. For hver identifiserte funksjon i en datafil må du også undersøke poengsummen, eventuelle advarsler og om funksjonen passerte de valgte filterparametrene.
      MERK: Det må utvises forsiktighet for å holde deteksjonsvinduene smale nok til at forskjellige funksjoner ikke feilaktig grupperes sammen. Dette er ofte notert ved ulike isotopprofiler mellom datafiler, eller signifikante m / z / oppbevaringstidsvariasjoner. Omvendt, hvis det er flere funksjoner med lignende m / z og oppbevaringstider, er det mulig at filterparametrene var for strenge, noe som resulterte i at en MS-topp ble delt inn i to funksjoner. Kjør derfor funksjonsuttrekking (del 3.1.3) på nytt med justerte filterparametere for oppbevaringstid for å gi bedre gruppering av disse funksjonene. Visualisering av de laveste mengdetoppene vil indikere om filtrene som brukes (seksjon 3.1.3) nøyaktig identifiserte topper over bakgrunnsstøy. Hvis de laveste overflodstoppene ligner på bakgrunnen, kjører du funksjonsuttrekkingen på nytt med nye parametere for bakgrunnsfilter.
    5. Eksporter data som en sammensatt utvekslingsfil (.cef) (et format som er kompatibelt med statistikkprogrammet), eller en kolonnedelt fil (.csv) som inneholder masse, oppbevaringstid og overflod av hver funksjon for hver prøve.
  2. Differensiell analyse av spektrale egenskaper
    MERK: Differensiell analyse ble utført ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare (se Materialfortegnelse). Annen bioinformatisk programvare kan brukes.
    1. Åpne programmet og start et nytt prosjekt når du får beskjed om det.
    2. Følg instruksjonene for dataimport og dataanalyse. Under dataimporten laster du opp funksjonen som trekkes ut filer (del 3.1). Under dataanalysen velger du signifikans og brettendring for differensialanalyse og velger å baseline data til medianintensiteten på tvers av alle datafilene. Ikke angi noen datafiltre (hvis dette ble gjort i forrige spektrabehandlingstrinn (seksjon 3.1)), da bruk av filtre igjen ville den robuste rekursive funksjonsutvinningen. I likhet med egenskapsekstraksjon må imidlertid differensialanalyse justeres basert på masse (m/z) og retensjonstid på grunn av drift i LC-MS-datainnsamlingen. Bruk parametrene som er bestemt i funksjonsuttrekk (avsnitt 3.1).
      MERK: Normaliser mellom datafiler ved hjelp av muropeptidkvantifiseringen (seksjon 1.3) for å sikre at variasjonene skyldes eksperimentelle parametere og ikke skyldes variasjoner i sakkulirensing (seksjon 1.2). Bruk alternativet ekstern skalering til å justere hver datafil for forskjeller i MurNAc-konsentrasjonsprøven.
    3. Når analysen er fullført, undersøk de resulterende grafiske og statistiske analysene for å identifisere muropeptider som viser en betydelig overflodsendring mellom de testede eksperimentelle forholdene.
    4. Under prosjektnavigatoren høyreklikker du på de ulike analysene og velger et eksportalternativ for å lagre funksjonsdetaljer som en kolonneatskilt (.csv) datafil som inneholder m/z, oppbevaringstid, rå og normaliserte intensitetsverdier, p-verdi, FDR og bretteendringer for hver funksjon. Flere analyser må lagres for å få alle relevante data.
    5. Eksporter en annen .csv-fil som bare inneholder muropeptidene som har overgått de statistiske analysene, inkludert p-verdi <0,05 og foldeendring >2.
  3. Kommenterer muropeptididentitet til spektrale trekk
    MERK: Hver identifiserte formasjon må tilordnes en predikert muropeptidstruktur basert på m/z og denne merknaden bekreftes ved å undersøke MS/MS-fragmenteringen. Etter å ha bekreftet merknadene, kan det være nødvendig å utføre og avgrense differensialanalysen (avsnitt 3.2).
    1. I differensialanalyseprogramvaren, under tolkning av resultater, velger du ID-nettleser. Legg til et bibliotek med forventede muropeptidstrukturer og velg lignende parametere som tidligere brukt (seksjon 3.1.3). Dette vil produsere en predikert muropeptidmerknad for hver identifiserte funksjon. Et bibliotek med muropeptidstrukturer kan produseres ved hjelp av m / z for predikerte muropeptidstrukturer og MS-databaseprogramvare (se materialtabell). Imidlertid finnes et bibliotek med m / z på > 6000 mulige muropeptider i referanse12.
    2. Velg den predikerte muropeptidmerknaden basert på matchingspoengsummen og den biologiske relevansen av det forutsagte muropeptidet, dvs. velg det mest sannsynlige muropeptidet som skal være tilstede i den biologiske prøven.
    3. Bekreft manuelt den predikerte muropeptidmerknaden ved å sammenligne m/z-toppene til MS/MS-kromatogrammet med den forutsagte m/z for alle mulige fragmenteringer av en kjent muropeptidstruktur (f.eks. figur 4).
      1. Se MS- og MS/MS-dataene ved hjelp av et kromatogramvisningsprogram (se Materialfortegnelse, figur 4).
      2. Tegn den forutsagte muropeptidstrukturen ved hjelp av en molekylær editor (tegneprogram for kjemisk struktur) (se materialfortegnelse, figur 4, grå innfelling). Bruk massefragmenteringsverktøyet til å vise m / z av MS-fragmenter når hver binding brytes enten individuelt eller i kombinasjon.
        MERK: Avhengig av fragmenteringsenergien som brukes til MS / MS, kan fragmentering skje ved enhver binding i muropeptidstrukturen. Noen bindinger er imidlertid lettere/ofte fragmenterte ved lavere energinivåer. For eksempel forekommer fragmentering i peptidsidekjeden oftest ved amidbindingen mellom aminosyrer. Mens du vurderer fragmenteringen, er det viktig å merke seg at GlcNAc-rester er veldig lett fragmentert fra muropeptidet. Fragmentering av den kjente muropeptidstrukturen bør derfor vurderes med og uten GlcNAc. På grunn av kildefragmenteringen av GlcNAc kan flere egenskaper ekstrahert i spektralprosessering (seksjon 3.1) representere en enkelt muropeptidstruktur. Hvis de blir funnet, bør disse funksjonene slås sammen og differensialanalysen vurderes på nytt.
      3. Sammenlign alle mulige fragmenteringer av muropeptidstrukturen som ble bestemt (pkt. 3.3.3.2) med MS/MS-kromatogrammet (pkt. 3.3.3.1). For å bekrefte muropeptidannotasjonen bør m/z-toppene av flere fragmenter finnes i MS/MS-kromatogrammet med et svært minimalt m/z-justeringsvindu (figur 4).
      4. For å belyse muropeptididentitet ved tvetydig MS/MS-fragmentering, gjenta avsnittene 2.2.2 til og med 2.2.3 med prøver (pkt. 2.1.9) for ytterligere MS/MS-datainnsamling som inneholder en foretrukket forløperliste for m/z og retensjonstid med ytterligere MS/MS-fragmenteringskollisjonsenergier.
    4. For co-eluerende enheter som ble kommentert som samme muropeptid, kjør differensialanalysen (seksjon 3.2.2) igjen og slå sammen de ekstraherte funksjonene.
  4. Vurdering av globale endringer i muropeptidmodifikasjoner
    1. Rediger .csv filen (seksjon 3.2.4) av de statistisk signifikante høyfoldede endringsmuropeptidene for å inkludere en enkelt kolonne for hver muropeptidmodifikasjon. Fyll denne kolonnen med en betegnelse for hvert muropeptid annotert (pkt. 3.3) (f.eks. acetylert versus de-N-acetylert GlcNAc eller MurNAc).
    2. Last opp den endrede .csv filen til Perseus22,23. Importer verdiene for normalisert intensitet til hovedimportboksen, og importer endringsbetegnelsen til boksen Kategorisk import.
    3. Under Annotate Rows klikker du på Kategorisk Annotate Rows og legger til datafiler til hver eksperimentelle parameter.
    4. Under test klikker du på to prøvetester for å utføre en students t-test (p-verdi < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
    5. Klikk på 1D for å utføre 1D-merknad22,23. En 1D-merknad FDR < 0,05 indikerer en signifikant overflodsendring for muropeptidmodifikasjonen mellom de testede eksperimentelle parametrene. Hvis du angir terskelverdien (s0) = 1, vises FDR-poengsummen for 1D-merknader for alle muropeptidene.
    6. Innenfor en grafisk programvare (se Materialtabell), produsere et varmekart over overflodsfoldendringen for hver muropeptidmodifikasjon og vise 1D-merknadspoengsummen for å demonstrere signifikans (figur 5B). Foldeendringen for hver muropeptidmodifikasjon kan produseres i Microsoft Excel ved å bruke råintensitetene til alle individuelle muropeptider som inneholder modifikasjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Økt deteksjonsfølsomhet for MS-maskiner kombinert med kraftig toppgjenkjenningsprogramvare har forbedret evnen til å isolere, overvåke og analysere stoffsammensetninger av komplekse prøver i svært liten detalj. Ved hjelp av disse teknologiske fremskrittene har nyere studier på peptidoglykansammensetning begynt å bruke automatiserte LC-MS-funksjonsekstraksjonsteknikker 12,13,14,24 over eldre HPLC-basert metodikk 11,25,26,27,28,29,30,31 . Selv om det finnes mange programvarepakker for utvinning av generiske funksjoner, er kommersiell programvare som bruker rekursiv funksjonsekstraksjon rask og svært robust ved automatisk å identifisere og kombinere alle ladninger, isotoper og adduktversjoner av hvert muropeptid som finnes i LC-MS-datasettet (figur 3). I tillegg brukes innledende oppbevaringstider, m / z og isotopiske mønstre av ekstraherte funksjoner til å revurdere (rekursive) datasettet for å sikre nøyaktig identifisering av hver funksjon i alle datafiler. Derfor hjelper den rekursive algoritmen med å validere og øke tilliten til toppidentifikasjon. De fleste generiske funksjonen utvinning programmer ikke gruppere kostnader / isotoper, etc. og vil kreve dette som et ekstra manuelt trinn. I tillegg vil generiske programmer være mindre robuste ettersom funksjoner trekkes ut separat i hver datafil og ikke som et helt datasett, som er en del av den rekursive algoritmen.

Peptidoglykomisk protokoll presentert her ble nylig brukt til å undersøke sammensetningsendringer av PG mellom to fysiologiske vekstbetingelser, nemlig frittsvømmende planktonisk og stasjonær felles biofilm12. Ved hjelp av en svært sensitiv QTOF MS kombinert med den rekursive egenskapsekstraksjonen, ble 160 forskjellige muropeptider gjenkjent og sporet. Dette representerte åtte ganger antall muropeptider identifisert i denne organismen tidligere 29,32, og større enn det dobbelte av muropeptidene identifisert ved hjelp av andre metoder i andre organismer10,14,24.

Å knytte hver m / z-topp ekstrahert fra MS-dataene med et bestemt muropeptid forenkles ved kryssreferanse med en database med kjente og forutsagte muropeptidstrukturer. Fragmenteringen MS/MS-kromatogrammet (figur 4) for hver ekstraherte formasjon sammenlignes med fragmenteringsprofilen (figur 4, grå innfelling) av muropeptidet som foreslås ved bruk av databasen.

Peptidoglykomiske data kan ses på en rekke forskjellige måter, avhengig av eksperimentelt oppsett og spørsmålene som stilles. Slike grafiske analyser kan omfatte analyse av hovedkomponenter (PCA), spredningsplott, vulkanplott, varmekart og hierarkisk klyngeanalyse. For eksempel fremhever vulkanplott muropeptider som viser en statistisk signifikant høy størrelse på overflodsendring mellom de testede forholdene (figur 5A). Disse utvalgte muropeptidene, som representerer betydelige overflodsendringer mellom de testede forholdene, kan undersøkes videre for muropeptidmodifikasjoner. Disse modifikasjonene kan inkludere tilstedeværelse av aminosyresubstitusjoner, acetyleringsendringer eller tilstedeværelse av amidaseaktivitet. Når de undersøkes sammen, kan flere muropeptider som har samme modifikasjon undersøkes for en trend mot en eksperimentell tilstand (figur 5A - uthevede punkter grønne) og hele gruppen vurderes for signifikans (figur 5B). Sporing av en muropeptidmodifikasjon på denne måten kan indikere en bestemt enzymatisk aktivitet som påvirkes av den eksperimentelle parameteren. I tillegg kan avvik fra denne trenden indikere enzymatisk aktivitet med en bestemt spesifisitet eller biologisk funksjon (figur 5A – uthevede oransje punkter).

Figure 1
Figur 1 Eksempel på en typisk gramnegativ peptidoglykanstruktur. (A) I gramnegative bakterier er peptidoglykan lokalisert i periplasma mellom indre og ytre membraner. (B) Et enkelt muropeptid består av et β-1,4-bundet N-acetylglukosamin (GlcNAc) (blått) og en N-acetyl muraminsyre (MurNAc) (lilla) med en vedlagt peptidsidekjede (oransje). Peptidsidekjeden kan kryssbindes til sidekjeden til tilstøtende muropeptid som produserer det modne maskelignende peptidoglykanet (A). Rensing innebærer isolering av peptidoglykan fra hele cellen som en sacculus hvor alt annet cellemateriale er strippet bort. (C) Transmisjonselektronmikrografi av en peptidoglykansekkkuli. Til sammenligning kan grampositiv PG bestå av et større utvalg av variasjoner i struktur og er en del av Gram-positiv taksonomisk klassifisering33. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Peptidoglycomics arbeidsflyt. Forberedelse av prøve. Trinn 1, vokse og pelletsbakterieceller (pkt. 1.1). Trinn 2, rens peptidoglycan sacculi med 4% SDS koker (pkt. 1.2). Datainnsamling. Trinn 3, enzymatisk fordøyelse av sekkekuli for å produsere muropeptider ved brudd på β-1,4-koblingen mellom N-acetylglukosamin (GlcNAc) og N-acetylmuramsyre (MurNAc) i peptidoglykanryggraden (pkt. 2.1). Trinn 4, analyse av muropeptidintensitet gjennom LC-MS/MS (pkt. 2.2). Dataanalyse. Trinn 5, rekursiv egenskapsekstraksjon identifiserer og samler alle ladninger, addukter og isotoper assosiert med et enkelt muropeptid (seksjon 3.1). Trinn 6, identifisering av muropeptider ved å sammenligne forventet fragmentering med MS/MS-kromatogrammer (pkt. 3.3). Trinn 7, bioinformatisk differensialanalyse (pkt. 3.2) som sammenligner peptidoglykankomposisjonelle endringer mellom ulike eksperimentelle parametere. Trinn 8, undersøke den globale endringen i muropeptidmodifikasjoner innenfor de forskjellige eksperimentelle parametrene ved hjelp av 1D-merknad (seksjon 3.4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på en rekursiv egenskapsekstraksjon. For et muropeptid som representerer en peptidsidekjede av alanin (A), iso-ᴅ-glutamat (E), meso-diaminopimelsyre (m), alanin (A) kryssbundet til AE m A i den tilstøtende muropeptidsidekjeden (1864,8 m / z). Inkludert i den ekstraherte funksjonen for 1864,8 m / z er ladninger (+1, +2 og +3), addukter (f.eks. natrium og kalium), tap av GlcNAc (1 eller 2 GlcNAc) og flere isotopiske topper for hver variant (f.eks. zoomet innfelt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Muropeptidfragmentering og identifikasjon. For merknad er hver m / z topp (funksjon) ekstrahert fra MS-kromatogrammet gitt en foreslått muropeptidstruktur basert på likhet med et muropeptidbibliotek. For å bekrefte denne foreslåtte strukturen, genereres forventede MS / MS-fragmenter ved hjelp av et kjemisk tegneprogram (grå innfelt). Denne predikerte fragmenteringen sammenlignes med MS/MS-kromatogrammet. Når forutsagte fragmenter (grå innfelt) samsvarer med MS / MS-kromatogrammet, bekreftes den foreslåtte muropeptidstrukturen. Figuren er endret fra referanse12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Differensialanalyse av peptidoglykansammensetning. (A) Vulkanplott av foldeendringen og statistisk signifikans av endringer i muropeptidintensitet mellom peptidoglykan renset fra P. aeruginosa dyrket som enten frittsvømmende planktonisk eller stasjonær biofilmkultur. Alle muropeptider som har en modifikasjon som representerte en endring i det typiske aminosyrearrangementet i peptidsidekjeden er uthevet. Aminosyresubstituerte muropeptider som viste en trend mot redusert overflod i biofilm-avledet peptidoglykan er uthevet i grønt. Aminosyresubstituerte muropeptider som var uteliggere til denne trenden og viste økt overflod i biofilmderivert peptidoglykan, er fremhevet i oransje. (B) Varmekart over den globale foldeendringen i overflod av alle aminosyresubstituerte muropeptider med økt overflod (oransje) og redusert overflod (grønn) i biofilm. Disse muropeptidene ble omgruppert og vurdert for om aminosyresubstitusjon forekom på monomerer, kryssbundne dimerer, eller om den fjerde (AE m+), femte (AEmA+) eller begge aminosyrene (AEm++) ble substituert. Signifikansen til hver gruppe muropeptider ble vurdert ved 1D-merknad med FDR < 0,05 for signifikans og tilhørende 1D-skår vises. 1D-annotasjon kan bare utføres på mer enn 2 muropeptider (f.eks. ble AEm ++ substitusjon bare funnet på to muropeptider). Derfor må det i dette tilfellet undersøkes betydning for de enkelte muropeptidene og ikke for gruppen. Figuren er endret fra referanse12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en metode for å rense peptidoglykan fra bakteriekulturer, prosess for LC-MS-deteksjon og analysere sammensetning ved hjelp av bioinformatiske teknikker. Her fokuserer vi på gramnegative bakterier, og det vil være nødvendig med noen små modifikasjoner for å muliggjøre analyse av grampositive bakterier.

Fremstillingen av muropeptider har vært tilnærmet den samme siden den først ble produsert på 1960-tallet 9,11,15. Når sakkuli (pkt. 1.2.18) er renset, fordøyes de til individuelle muropeptider ved bruk av muramidaseenzymet mutanolysin fra Streptomyces globisporus. Mutanolysin fordøyer PG-strukturen ved å bryte β-1,4-glykosidbindingen som frigjør individuelle muropeptider bestående av et GlcNAc-MurNAc disakkarid med tilhørende peptidsidekjede og inkluderer eventuelle modifikasjoner eller kryssbindinger (figur 1).

En begrensning av tidligere metodikk brukt til å studere PG-sammensetning har vært den tidkrevende manuelle identifiseringen av muropeptider. På grunn av kompleksiteten og vanskeligheten kan addukter, ladninger og/eller isotoper ha blitt inkludert i analysen. I tillegg begrenset de fleste studier analysen til de rikeste, og dermed enkleste å rense, muropeptider. På grunn av metodikkens kompliserte natur er det derfor utført relativt få detaljerte PG-komposisjonsanalyser på høyt nivå. De "omiske" -typeanalysene har brukt nyere teknologiske forbedringer for produksjon og statistisk analyse av relativt store og komplekse LC-MS-datasett for oversikt over biologiske systemer på høyt nivå. Anvendelsen av peptidoglykomikere vil muliggjøre analyse av PG-sammensetning i meget detalj.

Innen peptidoglycomics reduserer rekursiv funksjonsuttrekking manuell arbeidsbelastning og øker nøyaktigheten ved å undersøke alle datafiler samtidig. En rekursiv funksjonsutvinningsalgoritme brukes til å identifisere, justere og gruppere unike spektrale egenskaper (m / z-topper) på tvers av flere LC-MS-kromatografiske datafiler, noe som gjør identifisering av muropeptid m / z-topper automatisert. Denne algoritmen bruker isotopisk mønstermatching som tar de mange potensielle isotoper, ionaddukter og ladningstilstander og kondenserer de mange m / z-toppene til sin representative enkeltforbindelse (eller funksjon), som i dette tilfellet vil representere et enkelt muropeptid (figur 3). Verifisering av spektralfunksjonsgruppen oppnås ved å sammenligne oppbevaringstid, m/z og isotopmønstermatching innenfor hver kromatografiske datafil for å sikre robust ekstraksjon av funksjonen i hele datasettet. Algoritmer for å finne generiske funksjoner kan ikke inkludere isotopsamsvar eller justere, gruppere eller verifisere m/z-topper på tvers av flere prøver, og vil kreve ytterligere manuell databehandling for å utføre denne funksjonsuttrekkingen.

Når funksjonene er identifisert, håndterer bioinformatiske differensialanalysealgoritmer det svært store datasettet som helhet, og muliggjør dermed nyttige sammenligninger og tolkninger fra de komplekse dataene. Ved hjelp av disse bioinformatiske grafiske analysene er en kraftig måte å visualisere og tolke store datasett for å undersøke trender som kan indikere biologiske prosesser. Det var først nylig at disse kraftige grafiske analysene ble brukt til å undersøke peptidoglykan i svært detalj12. Differensialanalyse (avsnitt 3.2) vurderer endringene i overflod av individuelle muropeptider mellom forskjellige eksperimentelle forhold. Imidlertid, i sammenheng med hele bakterieceller, kan aktiviteten til PG-modifiserende enzymer resultere i flere forskjellige muropeptidstrukturer avhengig av spesifisiteten til den katalytiske aktiviteten (dvs. tilsetning av en acetylgruppe på disakkaridet kan være med eller uten modifikasjon av peptidsidekjeden). Derfor vil vurdering av de globale mengdeendringene av en bestemt modifikasjon på tvers av alle individuelle annoterte muropeptider gi innsikt i den enzymatiske aktiviteten som virker på PG (figur 5) Derfor brukes differensialanalyse for å undersøke overflodsendringer av individuelle muropeptider; mens 1D-merknad undersøker overflodsendringer av en bestemt PG-modifikasjon. Koblingsdifferensialanalyse med 1D-merknad gjør det mulig å vurdere PG-sammensetningen både på et individuelt muropeptidnivå og også som en indikator på total PG-enzymatisk aktivitet.

Under differensialanalyse er det viktig å merke seg at PG består av noen få svært rikelig muropeptider og mange muropeptider med lav overflod12. Derfor er baselining svært viktig for å fjerne eventuelle skjevheter fra muropeptidene med høy overflod under de senere trinnene i analysen. På grunn av de mange t-testene som utføres, må det også brukes en statistisk korreksjon for å redusere falske positiver. Standard er ofte Benjamini-Hochberg false-discovery rate (FDR)19. Andre korreksjoner som den mer konservative Bonferroni familievis feilrate (FWER) 20,21 er mulige.

Innenfor den bioinformatiske programvaren er m / z-toppen identifisert i funksjonsutvinning også tildelt en predikert struktur. Andre "omiske" (f.eks. proteomiske) analyser drar nytte av tilgjengeligheten av store sammensatte databaser, som muliggjør sammensatt identifikasjon gjennom prediktiv fragmenteringsspektramatching. For tiden eksisterer det ikke noe muropeptid-spådd fragmenteringsbibliotek, og bekreftelsen av muropeptididentifikasjon forblir et manuelt trinn. Etter hvert som peptidoglykomiske fragmenteringsdatabaser utvikler seg og blir offentlig tilgjengelige, vil imidlertid dette manuelle identifikasjonstrinnet bli mer automatisert og tilgjengelig ved å eliminere eller sterkt redusere seksjonene 3.3.3 og 3.3.4.

I Escherichia coli består PG av ~3,5 x 106 muropeptider per celle34. Innenfor deteksjonsgrensene for QTOF MS kan selv de laveste tallrike muropeptidene fortsatt representere hundrevis av kopier av et enkelt muropeptid i en celle12. Derfor kan forståelse av endringene i selv de laveste rikelig muropeptider gi nyttig innsikt i den biologiske aktiviteten til PG-målrettede enzymer i cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Jennifer Geddes-McAlister og Dr. Anthony Clarke for deres bidrag til å raffinere denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av driftstilskudd fra CIHR tildelt C.M.K (PJT 156111) og en NSERC Alexander Graham Bell CGS D tildelt E.M.A. Figurer ble opprettet på BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) Agilent LC-MS data acquisition
Heating mantle controller, Optichem Fisher 50-401-788 for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL Hemispherical Fisher CG1000008 for 4% SDS boil
Incubator, 37°C for sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40, Fisher CG121805 for 4% SDS boil
Lyophilizer Labconco for lyophilization of sacculi
Magentic stirrer Fisher 90-691-18 for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 Aglient LC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm Fisher 50-197-9573 cleanup of sample before MS injection
Retort stand Fisher 12-000-102 for 4% SDS boil
Retort clamp Fisher S02629 for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrex Fisher 07-250-084 for 4% SDS boil
Sonicator model 120 Fisher FB120 for sacculi purification
Sonicator - micro tip Fisher FB4422 for sacculi purification
Ultracentrifuge Beckman sacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45 Fisher NC9691797 sacculi wash steps
Water supply City for water cooled condenser
Software
Chemdraw Cambridgesoft molecular editor for muropeptide fragmentation prediction
Excel Microsoft viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter Acquisition Aglient running QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professional Aglient bioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager Aglient muropeptide m/z MS database
MassHunter Profinder Aglient recursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysis Aglient viewing MS and MS/MS chromatograms
Prism Graphpad Graphing software
Perseus Max Plank Institute of Biochemistry 1D annotation
Material
Acetonitrile Fisher A998-4
Ammonium acetate Fisher A637
Amylase Sigma-Aldrich A6380
Boric acid Fisher BP168-1
DNase Fisher EN0521
Formic acid Sigma-Aldrich 27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321 Agilent G1969-85000
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 Sigma-Aldrich M9901
Nitrogen gas (>99% purity) Praxair NI 5.0UH-T
Phosphoric acid Fisher A242
Pronase E from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
RNase Fisher EN0531
Sodium azide Fisher S0489
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166
Sodium hydroxide Fisher S318
Sodium Phosphate (dibasic) Fisher S373
Sodium Phosphate (monobasic) Fisher S369
Stains-all Sigma-Aldrich E9379

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
  4. Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
  6. Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
  7. Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
  8. Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
  9. Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
  10. Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
  11. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
  12. Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
  13. van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
  14. Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
  15. Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
  16. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  17. Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
  18. Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
  19. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  20. Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
  21. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
  22. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  23. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
  24. Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
  25. Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
  26. Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
  27. Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
  28. Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
  29. Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
  30. Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
  31. De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
  32. Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
  33. Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
  34. Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).

Tags

Retraksjon utgave 164 peptidoglykan muropeptider massespektrometri egenskapsekstraksjon differensialanalyse bioinformatikk peptidoglykomikk
Semi-kvantitativ analyse av peptidoglykan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatikk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, E. M., Greenwood, N. A.,… More

Anderson, E. M., Greenwood, N. A., Brewer, D., Khursigara, C. M. Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics. J. Vis. Exp. (164), e61799, doi:10.3791/61799 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter