Summary
该协议涵盖了使用液相色谱质谱结合高级特征提取和生物信息学分析软件对肽聚糖组成的详细分析。
Abstract
肽聚糖是细菌细胞壁的重要组成部分，也是抗菌剂的常见细胞靶标。尽管肽聚糖结构的各个方面在所有细菌中都相当保守，但革兰氏阳性/阴性之间以及物种之间也存在相当大的差异。此外，肽聚糖有许多已知的变异、修饰或适应，这些变异、修改或适应可能发生在细菌物种内，以响应生长阶段和/或环境刺激。这些变异产生一种高度动态的结构，已知该结构参与许多细胞功能，包括生长/分裂、抗生素耐药性和宿主防御避免。为了了解肽聚糖内的变化，必须将整体结构分解为其组成部分（称为多肽）并评估整体细胞组成。肽糖组学使用先进的质谱法结合高功率生物信息学数据分析来详细检查肽聚糖组成。以下协议描述了从细菌培养物中纯化肽聚糖，通过液相色谱仪 - 质谱仪获取多肽强度数据，以及使用生物信息学对肽聚糖组成进行差异分析。
Introduction
肽聚糖（PG）是细菌的一个决定性特征，用于维持细胞形态，同时为蛋白质和其他细胞成分提供结构支持1，2。PG的骨架由交替的β-1，4-连接的N-乙酰胞壁酸（MurNAc）和N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）1，2组成。每个MurNAc都具有一个结合在ᴅ-乳酰残基上的短肽，该肽可以与相邻的二糖连接的肽交联（图1A，B）。这种交联产生一种网状结构，包括整个细胞，通常被称为囊（图1C）。在PG合成过程中，前体在细胞质中产生，并通过翻转酶穿过细胞质膜。前体随后通过转糖基化酶和转肽酶掺入成熟的PG中，分别产生糖苷键和肽键3。然而，一旦组装，细菌产生的许多酶会修饰和/或降解PG以执行许多细胞过程，包括生长和分裂。此外，PG的各种修饰已被证明具有特异性的应变，生长条件和环境应激的适应性，这与细胞信号传导，抗菌素耐药性和宿主免疫逃避有关4。例如，一种常见的修饰是在MurNAc上添加C6乙酰基，通过限制聚糖β-1，4键与宿主产生的溶菌酶的访问来赋予抗性，从而降解PG4，5，6。在肠球菌中，用ᴅ-Lac取代肽侧链的末端ᴅ-Ala赋予抗菌剂万古霉素7，8更大的抗性。
PG分离和纯化的一般程序自1960年代9中描述以来一直保持相对不变。通过SDS热处理溶解细菌膜，然后酶促去除结合的蛋白质，糖脂和剩余的DNA。纯化的完整囊随后可以通过水解GlcNAc和MurNAc之间的β-1，4键消化成单个组分。这种消化产生具有任何结构修饰和/或交联完整的GlcNAc-MurNAc二糖，称为多肽（图1B）。
PG的成分分析最初通过高压液相色谱分离（HPLC）进行，以纯化每种多肽，然后手动鉴定多肽10，11。此后，液相色谱串联质谱（LC-MS）取代了液相色谱串联质谱（LC-MS），提高了检测灵敏度并减少了纯化每种多肽的手动工作量。然而，手动鉴定多肽的耗时性和复杂性仍然是一个限制因素，减少了进行的研究数量。近年来，随着“组学”技术的出现，自动化LC-MS特征提取已成为一种强大的工具，可以从非常大的数据集中快速检测和鉴定复杂样品中的单个化合物。一旦确定了特征，生物信息学软件就会使用差异分析统计比较样本之间的差异，从而隔离复杂数据集之间的最小差异，并以图形方式向用户显示。特征提取软件在PG组成分析中的应用才刚刚开始探索12，13，14，并与生物信息学分析相结合12。蛋白质组学分析得益于现成的蛋白质数据库，可预测肽片段化，可实现全自动鉴定，而蛋白质组学则不同，目前没有用于肽糖组学的片段化库。然而，特征提取可以与已知和预测的结构数据库相结合，以预测多肽鉴定12。在这里，我们提出了一个详细的方案，用于使用基于LC-MS的特征提取与多肽库相结合，对PG组成进行自动鉴定和生物信息差异分析（图2）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 肽聚糖样品制备
- 细菌培养物的生长
注意：细菌培养物的生长将根据细菌种类和所检查的生长条件而有所不同。要测试的实验参数将定义生长条件。- 在细菌菌株和实验设计所需的生长条件下培养细菌培养物。以一式三份培养物（生物重复）的形式培养细菌，即每个菌株或生长条件三个单独的菌落。
注意：已知生长条件和生长阶段对PG组成1，2，10有显着影响。必须非常小心地保持培养物和重复之间的一致性，以确保成分变化是由于实验参数而不是实验误差引起的。 - 快速冷却培养物至4°C，通过离心（11，000× g，10分钟，4°C）收集，并将细胞沉淀冷冻在-20°C。 冷冻前用预冷的4°C，20mM磷酸钠pH 6.5洗涤细胞沉淀。冷冻细胞沉淀的生产应在样品之间尽可能快速且一致地进行，以限制在收集过程中可能改变和/或降解PG的酶的活性。样品可以直接通过提取过程（第1.2节）进行处理，无需冷冻;但是，请确保以类似的方式处理所有样品。
注意：为了确保有足够的产品用于后续步骤，使用大尺寸的湿细胞沉淀。这会产生足够大的囊状颗粒，在重复洗涤步骤（第1.2.5和1.2.14节）中易于可视化和维持，而不会造成明显的产品损失。根据细菌和生长条件，该产量可能会有所不同。对于革兰氏阴性细菌 铜绿假单胞菌，PAO1，4 L 的 0.5 OD600 培养物产生 3-4 g 细胞沉淀，足以产生 ~10 mg 纯化的囊（第 1.2.17 节）12。这是比LC-MS所需的囊肿的大量过量（第2节）;但是，它将有助于测量精度（第 1.2.17 节）和归一化（第 1.3 节）。
- 在细菌菌株和实验设计所需的生长条件下培养细菌培养物。以一式三份培养物（生物重复）的形式培养细菌，即每个菌株或生长条件三个单独的菌落。
- 肽聚糖囊的提取
注意：提取PG的方案改编自参考文献。9,11,15.该协议将从单个细菌细胞中提取PG作为整个囊，不含其他细胞成分。该方案可用于革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。然而，对于革兰氏阳性细胞，可能需要进行调整以分离较厚的PG结构并去除细胞壁相关聚合物;如泰胆酸。- 将冷冻细胞沉淀重悬于20mM磷酸钠pH 6.5的原始培养体积的约1：10。在4°C下执行此步骤（可以是每mL缓冲液11，12的1-8mg湿细胞沉淀重量）。
注意：为了保持PG的乙酰化状态，需要pH值为6.5或更低15，16。 - 将细胞悬液滴加至沸腾的8%十二烷基硫酸钠（SDS）20mM磷酸钠pH 6.5中，以获得最终1：1体积（即，最终浓度为4% SDS），在配备水冷冷凝器的圆底烧瓶中轻轻搅拌。（图 2，步骤 2）
- 在搅拌下保持温和沸腾30分钟至3小时，以确保膜完全解离。确保所得混合物完全透明，没有残留的细胞团块或粘度。最好煮沸时间更长，以保证完全解离。
- 让它冷却到室温。样品可以在室温下放置过夜。
注意：当存在SDS时，将样品保持在室温下以将SDS保持在溶液中。 - 通过在25°C下以70，000× g 超速离心40分钟（或完全沉淀囊泡所需的时间）收集囊作为沉淀。
- 通过连续超速离心（第1.2.5节）重复洗涤囊，并悬浮在~50mL室温20mM磷酸钠pH 6.5中，直到洗涤缓冲液具有SDS浓度~0.001%。通常，5 到 7 次洗涤就足够了。
注意：要测试洗涤缓冲液中剩余SDS的浓度，请使用比色染料Stains-all 17。 - 将囊重悬于5–10 mL室温20 mM磷酸钠pH 6.5中。
- 在室温下对样品进行短暂超声处理（~40%，50 W，20 kHz，20 s）以分散团块。
注意：延长超声处理将机械地引起PG结构18的剪切。 - 用50μg/ mL每种淀粉酶，DNA酶和RNase，10mM硫酸镁补充样品，并在37°C下搅拌或章动消化1小时。
注意：淀粉酶消化去除囊内捕获的任何剩余糖原11。 - 加入100μg/ mL蛋白酶，并在37°C下搅拌或章动和~0.02%叠氮化钠消化过夜。
注意：Pronase消化去除添加的酶（来自第1.2.9节）并去除与PG共价连接的脂蛋白。
注意：叠氮化钠具有剧毒，需要正确的使用/处置方法。 - 在25°C下以70，000× g 超速离心40分钟（或完全沉淀囊所需的时间）以除去叠氮化钠。
- 将沉淀重悬于25mL的2%SDS 20 mM磷酸钠pH 6.5中。
- 在蒸锅或带有水冷冷凝器的圆底烧瓶中煮沸1小时（第1.2.2节）。
注意：第二个SDS煮沸步骤从囊中去除所有剩余的蛋白质和污染物。 - 用~50mL室温双蒸水（ddH 2 O）重复囊洗液（第1.2.6节），直到SDS浓度为~0.001%。
- 将沉淀重悬于足够量的ddH2O中以悬浮囊状物，以及洗涤容器（例如，25mL）并在-80°C下冷冻过夜。 体积可能会有所不同，因为样品将在下一步中冻干，尽管较小的体积需要更少的冻干时间。
- 第二天，冻干悬浮液并在室温下储存。
- 测量在分析天平上获得的冻干囊的量。
- 在ddH2O至10 mg/mL中稀释囊，并在进一步分析之前短暂超声处理以分解团块。
- 将冷冻细胞沉淀重悬于20mM磷酸钠pH 6.5的原始培养体积的约1：10。在4°C下执行此步骤（可以是每mL缓冲液11，12的1-8mg湿细胞沉淀重量）。
- 纯化的肽聚糖的定量
- 定量第1.2.18节中纯化的囊状物的量，以确保在差异分析期间平衡质谱数据（第3.2节）。遵循参考文献 15 中概述的详细方法。
注意：纯化的囊（第1.2.18节）通过酸水解分解成单独的糖和氨基酸成分。使用脉冲安培检测法通过阴离子交换色谱法分离和定量单个组分。给定PG的结构（图1），单个多肽由单个MurNAc和单个GlcNAc残基组成。因此，定量任一残留物的浓度表示样品中多肽的1：1量。MurNAc是优选的，因为在色谱16期间与其他PG组分的峰分离干净。
- 定量第1.2.18节中纯化的囊状物的量，以确保在差异分析期间平衡质谱数据（第3.2节）。遵循参考文献 15 中概述的详细方法。
2. 质谱数据采集
- 质谱用多肽的制备
- 在 100 μL 反应中用 100 μg/mL 变变溶素、100 mM 乙酸铵 pH 5.5 和 50 mM 氯化镁补充 800 μg 纯化的囊。
- 在37°C下消化过夜。
- 加入 1：1 体积 0.5 M 硼酸盐缓冲液 pH 9.0，并补充 ~10 mg/mL 硼氢化钠 （NaBH4）。
注意：在α和β异常形式之间环糖的诱变将在多肽的液相色谱分离过程中引起多个峰形成。用NaBH4 处理通过将MurNAc还原为muramitol11来消除两种形式之间的相互转化。该处理不会减少1，6-脱水MurNAc或1，4-连接的糖残基。
注意：NaBH4 的反应产生少量氢气。NaBH4 反应会产生气泡，微量离心管应保持打开以允许气体逸出。 - 将样品在室温下孵育~20-30分钟。
- 短暂离心，将样品沉淀在微量离心管中并去除气泡。
- 使用 1：5 磷酸将 pH 值调节至 <4.0，增量为 5 μL。使用石蕊pH试纸测试pH值。
- 以~17，000 x g 离心1分钟以沉淀任何剩余的不溶性物质。
- 使用0.2μm微量离心机过滤器过滤。
- 在将样品注入LC-MS之前，将样品以30，000 x g 离心10分钟，以确保不会将任何颗粒注入MS。
- 液晶质联用仪的设置
- 将 C18 表面多孔颗粒柱（100 mm x 2.1 mm，孔径 <3 μm）连接到四极杆飞行时间 （QTOF） 质谱仪上，检测精度最小为 4 个小数点 m/z 。
- 进行多肽的液相色谱分离
注意：每个生物一式三份（第1.1.1节）应通过LC-MS（第2.2.2至2.2.3节）运行三次（技术一式三份）。因此，每个测试条件总共有九个LC-MS数据文件。数据采集是使用市售软件进行的（见 材料表）。但是，应根据MS机器选择采集软件。以下是使用特定于运行此协议的参数设置 MS 的指南。有关详细说明，请参阅制造商手册。- 对于色谱分离，制备以下溶剂0.1%甲酸（A）和乙腈与0.1%甲酸（B）。
- 使用以下参数设置色谱分离方法。
- 将流速设置为 0.4 毫升/分钟。
- 将色谱柱在2%B（~24柱体积）下调节10分钟。
- 使用自动进样器，从第 2.1.9 节中进样 10 μL。
注意：在开始数据收集之前，通过LC-MS协议运行一个初始样品。此运行不用于数据，但用于提高所有后续运行的保留时间重现性。在光谱处理过程中（第3.1节），需要保留时间的重现性，以便准确鉴定和分组质荷比（m/z） 峰。 - 使用2%B分离多肽5分钟（~12柱体积），然后在13分钟内将其增加到15%B（~30柱体积），在10分钟内进一步增加到50%B（~24柱体积），最后在2分钟内将其增加到98%B（~5柱体积）。
注意：丢弃（发送到废物）梯度的前 2 分钟和最后 5 分钟。 - 最后以98%B洗涤柱6分钟（~14柱体积）和20分钟（~47柱体积）重新平衡。
- 对多肽进行质谱检测
- 按照MS制造商的说明，使用含有LC-MS参比质量标准品的乙腈调谐混合物在正模式下校准质量轴。
注意：MS在色谱运行开始之前调谐（第2.2.2.1节）。 - 使用以下参数设置MS数据采集方法。
注意：MS和MS / MS数据与多肽的色谱分离（第2.2.2.4和2.2.2.5节）同时收集（第2.2.3.2至2.2.3.6节）。色谱和MS参数（第2.2.2.2和2.2.3.2节）都是在设置工作清单期间添加的单一方法，用于按顺序运行多个样品。 - 将电喷雾毛细管电压设置为 4.0 kV，干燥气体温度设置为 350°C，流速为 13 L/min。
注意：在所有质谱数据收集期间，氮气（纯度>99%）应用作雾化，干燥和碰撞气体。 - 将雾化器压力设置为 40 psi，并将碎片器设置为 150 V。
- 将喷嘴、撇渣器和八极射频电压分别设置为 1000 V、65 V 和 750 V。
- 在 4 GHz（扩展动态范围）正离子模式下将扫描范围设置为 300–2，000 m/z 。
- 使用数据相关的 MS/MS 采集设置数据收集，MS 和 MS/MS 扫描速率为 1 个光谱/秒。每个循环选择五个母离子质量数，顺序为单电荷、双电荷和三电荷。
- 将 MS/MS 碎片碰撞能量设置为 15、20 和 30 eV。
- 按照MS制造商的说明，使用含有LC-MS参比质量标准品的乙腈调谐混合物在正模式下校准质量轴。
3. 多肽丰度的差异分析
- LC-MS色谱图谱处理
注意：递归特征提取是使用市售软件执行的（参见 材料表）。可以使用其他特征提取软件。但是，其他软件可能需要额外的手动数据处理才能完成高度稳健的递归提取。各种软件几乎可以互换使用术语功能、实体和化合物。对于PG分析，所有方法均指鉴定代表单个多肽的LC-MS离子色谱图（例如图 3）。在光谱处理过程中（第3.1节），特征表示多个 m/z 峰，这些峰包含单个多肽的多种可能的离子种类，这些离子种类在单个化合物标记下分组在一起。- 在 “文件”下，启动一个新项目。
- 添加LC-MS QTOF数据文件，并将单个数据文件分配给实验条件/组，例如，两种不同的生长条件。
- 运行数据处理向导批量递归特征提取（小分子/肽），并设置数据处理过滤器以匹配LC-MS条件和仪器的参数，以准确识别、分组和验证代表单个多肽的 m/z 峰。从色谱图中，检查已知相似峰的保留时间漂移和 m/z 的变化，以设置初始过滤器参数。
注意：递归特征提取使用初始非靶向分子特征提取算法来识别和对齐所有数据文件中的色谱特征（m/z 峰）。创建后，这些特征用于使用目标分子特征提取算法重新评估原始数据文件（递归），以提高识别特征的可靠性和准确性。最好使用较窄的检测窗口设置初始非靶向提取，并使用更广泛的检测参数进行递归提取，以识别初始提取中可能缺少的所有数据文件中的峰。运行递归特征提取可能需要数小时才能完成，具体取决于样本数量、数据的复杂性和存在的计算机硬件 - 查看要素提取结果。如果组中有大量要素无法对齐，请根据需要调整递归过滤参数以扩大/限制检测窗口。为此，请检查每个提取特征的色谱图和同位素谱，以确保在所有数据文件中以类似的方式完成特征检测。此外，对于数据文件中的每个已识别要素，请检查分数、任何警告以及要素是否通过了所选的过滤器参数。
注意：必须注意保持检测窗口足够窄，以免将不同的特征错误地组合在一起。这通常通过数据文件之间的不同同位素谱或显著的 m / z / 保留时间变化来表示。相反，如果有多个特征具有 相似的m/z 和保留时间，则可能是滤波器参数过于严格，导致一个MS峰被分成两个特征。因此，使用调整的保留时间过滤器参数再次运行特征提取（第 3.1.3 节），以便更好地对这些功能进行分组。可视化最低丰度峰将表明所使用的过滤器（第3.1.3节）是否准确识别了高于背景噪声的峰。如果最低丰度峰与背景相似，请使用新的背景过滤器参数重新运行特征提取。 - 将数据导出为化合物交换文件 （.cef）（一种与统计软件程序兼容的格式）或列分隔文件 （.csv），其中包含每个样品的每个特征的质量数、保留时间和丰度。
- 光谱特征的差分分析
注意：差异分析是使用市售软件进行的（见 材料表）。可以使用其他生物信息学软件。- 打开程序，并在指示下启动一个新项目。
- 按照说明进行数据导入和数据分析。在数据导入过程中，上传要素提取的文件（第 3.1 节）。在数据分析期间，选择显著性和倍数变化进行差异分析，并选择将数据基线化为所有数据文件中的中位数强度。不要设置任何数据过滤器（如果在前面的光谱处理步骤（第 3.1 节）中完成），因为再次应用过滤器会否定鲁棒递归特征提取。然而，与特征提取类似，由于LC-MS数据收集中的漂移，差异分析必须根据质量数（m/z）和保留时间进行对齐。使用特征提取中确定的参数（第 3.1 节）。
注意：使用多肽定量（第1.3节）在数据文件之间进行归一化，以确保变化是由于实验参数而不是由于囊纯化的变化（第1.2节）。使用外部缩放器选项调整每个数据文件以显示样品 MurNAc 浓度的差异。 - 分析完成后，检查生成的图形和统计分析，以鉴定在测试实验条件之间显示出显着丰度变化的多肽。
- 在工程导航器下，右键单击各种分析并选择导出选项，将要素详细信息保存为列分隔 （.csv） 数据文件，其中包含每个要素的 m/z、保留时间、原始和归一化强度值、 p 值、FDR 和倍数变化。必须保存多个分析才能获得所有相关数据。
- 导出第二个.csv文件，仅包含超过统计分析（包括 p 值 <0.05 和倍数变化 >2）的多肽。
- 将多肽身份与光谱特征进行注释
注意：必须根据 m/z 为每个识别的特征分配一个预测的多肽结构，并通过检查MS / MS片段来确认此注释。确认注释后，可能需要执行和完善差异分析（第3.2节）。- 在差异分析软件中，在结果解释下，选择 ID 浏览器。添加预期的多肽结构库，并选择与之前使用的参数类似的参数（第3.1.3节）。这将为每个已识别的特征生成预测的多肽注释。使用m/z预测多肽结构和MS数据库软件可以生成多肽结构库（参见材料表）。然而，在参考文献12中可以找到>6，000种可能的多肽的m/z库。
- 根据匹配分数和预测的多肽的生物学相关性选择预测的多肽注释，即选择生物样品中最有可能存在的多肽。
- 通过将MS/MS色谱图的m/z峰与已知多肽结构所有可能碎裂的预测m/z进行比较，手动确认预测的多肽注释（例如，图4）。
- 使用色谱图查看程序查看MS和MS/MS数据（参见 材料表， 图4）。
- 使用分子编辑器（化学结构绘图程序）绘制预测的多肽结构（参见 材料表， 图4，灰色插图）。使用质量碎裂工具显示每个键单独或组合断裂时MS片段的 m/z 。
注意：根据用于MS / MS的碎裂能量，碎裂可能发生在多肽结构中的任何键上。然而，一些键在较低的能级下更容易/经常破碎。例如，肽侧链中的碎裂最常发生在氨基酸之间的酰胺键上。在评估碎裂时，重要的是要注意GlcNAc残基很容易从多肽中片段化。因此，应在有或没有GlcNAc的情况下评估已知多肽结构的碎裂。由于GlcNAc的源内碎裂，在光谱处理中提取的几个特征（第3.1节）可能代表单个多肽结构。如果找到，应合并这些特征并重新评估差异分析。 - 将测定的多肽结构的所有可能碎裂（第3.3.3.2节）与MS/MS色谱图（第3.3.3.1节）进行比较。为了确认多肽注释，应在m/z比对窗口非常小的MS/MS色谱图中找到多个片段的m/z峰（图4）。
- 为了阐明MS/MS片段模糊情况下的多肽身份，请对样品重复第2.2.2至2.2.3节（第2.1.9节），以进行额外的MS/MS数据采集，并结合 首选的母 离子母离子列表和保留时间以及额外的MS/MS片段碰撞能量。
- 对于注释为相同多肽的共洗脱实体，请再次运行差异分析（第 3.2.2 节）并合并提取的特征。
- 评估多肽修饰的全局变化
- 编辑具有统计学意义的高倍数变化多肽的.csv文件（第3.2.4节），以包括每个多肽修饰的单个列。用注释的每个多肽的名称填充该色谱柱（第3.3节）（例如，乙酰化与去N-乙酰化的GlcNAc或MurNAc）。
- 将修改后的.csv文件上传到英仙座22，23。将归一化强度值导入到“主导入”框中，并将修改名称导入到“分类导入”框中。
- 在“注释行”下，单击“分类注释行”，然后将数据文件添加到每个实验参数。
- 在检验下，单击两个样本检验以执行学生的 t 检验（p 值 < 0.05，FDR < 0.05，s0 = 1）。
- 单击1D以执行1D注释22，23。1D注释FDR < 0.05表明，在测试的实验参数之间，多肽修饰的丰度发生了显着变化。设置阈值 （s0） = 1 将显示所有多肽的 1D 注释 FDR 分数。
- 在绘图软件中（见 材料表），生成每个多肽修饰的丰度倍数变化的热图，并显示1D注释分数以证明显着性（图5B）。每个多肽修饰的倍数变化可以在Microsoft Excel中使用包含修饰的所有单个多肽的原始强度产生。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MS机器的检测灵敏度提高，加上高性能峰识别软件，提高了分离、监测和分析复杂样品物质成分的能力。利用这些技术进步，最近对肽聚糖组成的研究已开始使用自动化LC-MS特征提取技术12，13，14，24，而不是旧的基于HPLC的方法11，25，26，27，28，29，30，31.尽管有许多通用特征提取软件包可用，但使用递归特征提取的商业软件通过自动识别和组合LC-MS数据集中发现的每种多肽的所有电荷、同位素和加合物版本，快速且高度稳健（图3）。此外，提取特征的初始保留时间、m/z 和同位素模式用于重新评估（递归）数据集，以确保准确识别所有数据文件中的每个特征。因此，递归算法有助于验证和增加峰识别的置信度。大多数通用特征提取程序不对电荷/同位素等进行分组。并且需要将其作为额外的手动步骤。此外，通用程序将不太健壮，因为特征是在每个数据文件中单独提取的，而不是作为整个数据集提取的，这是递归算法的一部分。
这里介绍的肽类化合物方案最近用于检查PG在两种生理生长条件（即自由游泳的浮游生物和静止的公共生物膜12）之间的组成变化。使用高灵敏度的QTOF MS结合递归特征提取，识别并跟踪了160种不同的多肽。这代表了以前在该生物体中鉴定的多肽数量的八倍29，32，并且是在其他生物体中使用其他方法鉴定的多肽的两倍多10，14，24。
通过与已知和预测的多肽结构数据库进行交叉引用，有助于将从MS数据中提取的每个m/z峰与特定的多肽相关联。将每个提取特征的碎裂MS/MS色谱图（图4）与使用该数据库提出的多肽的片段谱图（图4，灰色插图）进行比较。
Peptidoglycomic数据可以通过多种不同的方式查看，具体取决于实验设置和提出的问题。此类图形分析可以包括主成分分析 （PCA）、散点图、火山图、热图和层次聚类分析。例如，火山图突出显示了多肽，这些多肽在测试条件之间显示出统计学上显着的高丰度变化（图5A）。这些选定的多肽代表了测试条件之间的丰度显着变化，可以进一步检查多肽修饰。这些修饰可能包括氨基酸取代的存在、乙酰化变化或酰胺酶活性的存在。当一起检查时，可以检查具有相同修饰的多种多肽朝向一种实验条件的趋势（图5A-突出显示的绿色点），并评估整个组的显着性（图5B）。以这种方式跟踪多肽修饰，可以指示受实验参数影响的特定酶活性。此外，这种趋势的异常值可能表明具有特定特异性或生物学功能的酶活性（图5A-突出显示的橙色点）。
图 1：典型的革兰氏阴性肽聚糖结构示例。 （A）在革兰氏阴性细菌中，肽聚糖位于内膜和外膜之间的周质中。（B）单个多肽由β-1，4-连接的 N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）（蓝色）和 N-乙酰胞壁酸（MurNAc）（紫色）组成，并附有肽侧链（橙色）。肽侧链可以与相邻多肽的侧链交联，产生成熟的网状肽聚糖（A）。纯化涉及将肽聚糖作为囊从整个细胞中分离出来，其中所有其他细胞物质都被剥离。（C）肽聚糖囊的透射电子显微照片。相比之下，革兰氏阳性PG可以由更多的结构变化组成，并且是革兰氏阳性分类分类33的一部分。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：肽糖组学工作流程。 样品制备。步骤1，生长和沉淀细菌细胞（第1.1节）。步骤2，用4%SDS煮沸纯肽聚糖囊（第1.2节）。数据采集。步骤3，通过破坏肽聚糖主链的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNAc）之间的β-1，4-键，酶消化囊以产生多肽（第2.1节）。步骤4，通过LC-MS/MS分析多肽强度（第2.2节）。数据分析。步骤5，递归特征提取识别并收集与单个多肽相关的所有电荷，加合物和同位素（第3.1节）。步骤6，通过将预测的碎片与MS / MS色谱图进行比较来鉴定多肽（第3.3节）。步骤7，生物信息学差异分析（第3.2节）比较不同实验参数之间的肽聚糖组成变化。步骤8，使用1D注释检查不同实验参数内多肽修饰的全局变化（第3.4节）。请点击此处查看此图的大图。
图 3：递归特征提取示例。 对于代表丙氨酸（A），异ᴅ-谷氨酸（E），内消旋二氨基庚二酸（m），丙氨酸（A）的肽侧链的多肽与相邻多肽侧链的AE m A交联（1864.8 m / z）。提取的1864.8 m/z特征中包括电荷（+1、+2和+3）、加合物（例如钠和钾）、GlcNAc损失（1或2 GlcNAc）以及每个变化的多个同位素峰（例如，放大插图）。请点击此处查看此图的大图。
图4：Muropeptide片段化和鉴定。 为了进行注释，根据与多肽文库的相似性，给出从MS色谱图中提取的每个 m/z 峰（特征）建议的多肽结构。为了确认这一拟议结构，使用化学绘图程序（灰色插图）生成预测的MS / MS片段。将预测的碎裂率与MS/MS色谱图进行比较。当预测片段（灰色插图）与MS/MS色谱图匹配时，可以确认建议的多肽结构。该图修改自参考文献12。 请点击此处查看此图的大图。
图5：肽聚糖组成的差异分析。 （A）从铜 绿假单胞菌 中纯化的肽聚糖之间倍数变化的火山图和多肽强度变化的统计学意义，无论是自由游泳的浮游还是固定的生物膜培养物。突出显示所有具有修饰的多肽，这些修饰代表了肽侧链内典型氨基酸排列的变化。氨基酸取代的多肽在生物膜衍生的肽聚糖中显示出丰度下降的趋势，以绿色突出显示。氨基酸取代的多肽是这一趋势的异常值，并且在生物膜衍生的肽聚糖中显示出丰度增加，以橙色突出显示。（B）生物膜中所有氨基酸取代的多肽丰度随着丰度增加（橙色）和丰度降低（绿色）的全球倍数变化的热图。对这些多肽进行重组，并评估单体、交联二聚体上是否发生氨基酸取代，或者第四个（AEm + ）、第五个（AEmA+）或两个氨基酸（AEm++）是否被取代。通过FDR<0.05的1D注释评估每组多肽的显著性，并显示相关的1D评分。1D 注释只能对 2 个以上的多肽进行（例如，仅在两个多肽上发现 AEm++ 替换）。因此，在这种情况下，必须检查单个多肽的重要性，而不是对组的重要性。该图修改自参考文献12。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议描述了一种从细菌培养物中纯化肽聚糖的方法，LC-MS检测过程并使用生物信息学技术分析成分。在这里，我们专注于革兰氏阴性细菌，需要进行一些轻微的修改才能分析革兰氏阳性细菌。
自 1960 年代首次生产以来，多肽的制备几乎保持不变9，11，15.纯化后，囊（第1.2.18节）使用来自球孢链霉菌的胞壁酰胺酶诱变溶素消化成单个多肽。Mutanolysin通过破坏β-1，4-糖苷键来消化PG结构，释放由GlcNAc-MurNAc二糖和附加肽侧链组成的单个多肽，并包括任何修饰或交联（图1）。
以前用于研究PG组成的方法的一个局限性是耗时的手动鉴定多肽。由于复杂性和难度，加合物、电荷和/或同位素可能已包含在分析中，也可能不包含。此外，大多数研究将分析限制在最丰富，因此最容易纯化的多肽上。因此，由于该方法的复杂性，相对较少的高级详细PG成分分析。“组学”型分析利用最近的技术改进，对相对大而复杂的LC-MS数据集进行生产和统计分析，以对生物系统进行高级概述。肽糖组学的应用将能够非常详细地分析PG组成。
在肽糖组学中，递归特征提取通过一次检查所有数据文件来减少手动工作量并提高准确性。递归特征提取算法用于识别、对齐和分组多个LC-MS色谱数据文件中的独特光谱特征（m /z峰），从而自动鉴定多肽m /z 峰。该算法使用同位素模式匹配，采用多种潜在同位素、离子加合物和电荷态，并将多个 m/z 峰浓缩成具有代表性的单一化合物（或特征），在这种情况下，该化合物代表单个多肽（图3）。通过比较每个色谱数据文件中的保留时间、m/z和同位素模式匹配来完成光谱特征组的验证，以确保在整个数据集中可靠地提取特征。通用特征查找算法可能不包括同位素匹配或跨多个样品的对齐、分组或验证 m/z 峰，并且需要额外的手动数据处理才能完成此特征提取。
一旦识别出特征，生物信息学微分分析算法就会将非常大的数据集作为一个整体来处理，从而允许从复杂数据中进行有用的比较和解释。使用这些生物信息图形分析是可视化和解释大型数据集以检查可能指示生物过程的趋势的有效方法。直到最近，这些高功率图形分析才被用于非常详细地检查肽聚糖12。差异分析（第3.2节）评估不同实验条件之间单个多肽丰度的变化。然而，在整个细菌细胞的背景下，PG修饰酶的活性可能导致多种不同的多肽结构，这取决于催化活性的特异性（即，在二糖上添加乙酰基可以有或没有肽侧链的修饰）。因此，评估特定修饰在所有单个注释的多肽中的全局丰度变化将深入了解作用于PG的酶活性（图5）因此，差异分析用于研究单个多肽的丰度变化;而 1D 注释检查特定 PG 修饰的丰度变化。将差异分析与一维注释相结合，既可以在单个多肽水平上评估PG组成，也可以作为整体PG酶活性的指标。
在差异分析过程中，需要注意的是，PG由一些高丰度的多肽和许多低丰度的多肽组成12。因此，为了在分析的后续步骤中消除高丰度多肽的任何偏差，基线非常重要。此外，由于执行了多个 t 检验，因此必须应用统计校正以减少误报。默认值通常是Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）19。其他修正，如更保守的邦弗朗尼家庭错误率（FWER）20，21 是可能的。
在生物信息学软件中，特征提取中鉴定的 m/z 峰也被分配了一个预测结构。其他“组学”型（例如蛋白质组学）分析受益于大型化合物数据库的可用性，该数据库允许通过预测碎裂谱匹配进行化合物鉴定。目前，尚无多肽预测片段库，确认多肽鉴定仍需手动完成。然而，随着肽类漫画碎片数据库的发展和公开可用，通过消除或大幅减少第3.3.3和3.3.4节，这一手动识别步骤将变得更加自动化和可访问。
在 大肠杆菌中， PG由每细胞~3.5 x 106 个多肽组成34。在QTOF MS的检测限内，即使是丰度最低的多肽仍然可以代表细胞内单个多肽的数百个拷贝12。因此，了解即使是丰度最低的多肽的变化也可能为细胞内PG靶向酶的生物活性提供有用的见解。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢Jennifer Geddes-McAlister博士和Anthony Clarke博士在完善该协议方面的贡献。这项工作得到了CIHR授予C.M.K（PJT 156111）的运营赠款和授予E.M.A.的NSERC Alexander Graham Bell CGS D的支持 BioRender.com。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) | Agilent | LC-MS data acquisition | |
| Heating mantle controller, Optichem | Fisher | 50-401-788 | for 4% SDS boil |
| Heating Mantle, 1000mL Hemispherical | Fisher | CG1000008 | for 4% SDS boil |
| Incubator, 37°C | for sacculi purification and MS sample prep | ||
| Leibig condenser, 300MM 24/40, | Fisher | CG121805 | for 4% SDS boil |
| Lyophilizer | Labconco | for lyophilization of sacculi | |
| Magentic stirrer | Fisher | 90-691-18 | for 4% SDS boil |
| mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 | Aglient | LC-MS data acquisition | |
| microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm | Fisher | 50-197-9573 | cleanup of sample before MS injection |
| Retort stand | Fisher | 12-000-102 | for 4% SDS boil |
| Retort clamp | Fisher | S02629 | for 4% SDS boil |
| round bottom flask - 1 liter pyrex | Fisher | 07-250-084 | for 4% SDS boil |
| Sonicator model 120 | Fisher | FB120 | for sacculi purification |
| Sonicator - micro tip | Fisher | FB4422 | for sacculi purification |
| Ultracentrifuge | Beckman | sacculi wash steps | |
| Ultracentrifuge bottles, Ti45 | Fisher | NC9691797 | sacculi wash steps |
| Water supply | City | for water cooled condenser | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgesoft | molecular editor for muropeptide fragmentation prediction | |
| Excel | Microsoft | viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc. | |
| MassHunter Acquisition | Aglient | running QTOF instrument | |
| MassHunter Mass Profiler Professional | Aglient | bioinformatic differential analysis | |
| MassHunter Personal Compound Database and Library Manager | Aglient | muropeptide m/z MS database | |
| MassHunter Profinder | Aglient | recursive feature extraction | |
| MassHunter Qualitative analysis | Aglient | viewing MS and MS/MS chromatograms | |
| Prism | Graphpad | Graphing software | |
| Perseus | Max Plank Institute of Biochemistry | 1D annotation | |
| Material | |||
| Acetonitrile | Fisher | A998-4 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637 | |
| Amylase | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Boric acid | Fisher | BP168-1 | |
| DNase | Fisher | EN0521 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| LC-MS tuning mix - HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Nitrogen gas (>99% purity) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Phosphoric acid | Fisher | A242 | |
| Pronase E from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNase | Fisher | EN0531 | |
| Sodium azide | Fisher | S0489 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318 | |
| Sodium Phosphate (dibasic) | Fisher | S373 | |
| Sodium Phosphate (monobasic) | Fisher | S369 | |
| Stains-all | Sigma-Aldrich | E9379 |
References
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
- Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
- Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
- Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
- Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
- Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
- Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
- Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
- Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
- Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
- van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
- Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
- Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
- Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
- Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
- Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
- Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
- Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
- Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
- Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
- Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
- Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
- Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
- Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
- De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
- Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
- Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
- Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).
