Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Published: October 13, 2020 doi: 10.3791/61799
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

Summary

Dit protocol omvat een gedetailleerde analyse van de peptidoglycaansamenstelling met behulp van vloeistofchromatografie massaspectrometrie in combinatie met geavanceerde functie-extractie en bio-informatica-analysesoftware.

Abstract

Peptidoglycan is een belangrijk onderdeel van bacteriële celwanden en een gemeenschappelijk cellulair doelwit voor antimicrobiële stoffen. Hoewel aspecten van de peptidoglycaanstructuur redelijk bewaard zijn gebleven in alle bacteriën, is er ook een aanzienlijke variatie tussen Gram-positieven / negatieven en tussen soorten. Daarnaast zijn er tal van variaties, modificaties of aanpassingen aan de peptidoglycaan bekend die binnen een bacteriesoort kunnen optreden als reactie op groeifase en/of omgevingsprikkels. Deze variaties produceren een zeer dynamische structuur waarvan bekend is dat deze deelneemt aan vele cellulaire functies, waaronder groei / deling, antibioticaresistentie en het vermijden van gastheerverdediging. Om de variatie binnen peptidoglycaan te begrijpen, moet de algehele structuur worden opgesplitst in zijn constitutieve delen (bekend als muropeptiden) en worden beoordeeld op algemene cellulaire samenstelling. Peptidoglycomics maakt gebruik van geavanceerde massaspectrometrie in combinatie met krachtige bioinformatische data-analyse om de peptidoglycaansamenstelling in detail te onderzoeken. Het volgende protocol beschrijft de zuivering van peptidoglycaan uit bacterieculturen, de verwerving van muropeptide-intensiteitsgegevens via een vloeistofchromatograaf-massaspectrometer en de differentiële analyse van peptidoglycaansamenstelling met behulp van bio-informatica.

Introduction

Peptidoglycan (PG) is een bepalend kenmerk van bacteriën dat dient om de celmorfologie te behouden, terwijl het structurele ondersteuning biedt voor eiwitten en andere cellulaire componenten 1,2. De ruggengraat van PG bestaat uit afwisselend β-1,4-gebonden N-acetyl muramic acid (MurNAc) en N-acetyl glucosamine (GlcNAc)1,2. Elke MurNAc bezit een kort peptide gebonden aan het ᴅ-lactylresidu dat kan worden gekruist met aangrenzende disacharide-gekoppelde peptiden (figuur 1A,B). Deze crosslinking produceert een mesh-achtige structuur die de hele cel omvat en vaak een sacculus wordt genoemd (figuur 1C). Tijdens PG-synthese worden voorlopers gegenereerd in het cytoplasma en door flippasen over het cytoplasmamembraan getransporteerd. Voorlopers worden vervolgens opgenomen in de volwassen PG door transglycosylase en transpeptidase-enzymen, die respectievelijk de glycosidische en peptidebindingen produceren3. Eenmaal geassembleerd, zijn er echter tal van enzymen geproduceerd door de bacteriën die de PG wijzigen en / of afbreken om een aantal cellulaire processen uit te voeren, waaronder groei en deling. Bovendien is aangetoond dat verschillende modificaties van de PG aanpassingen geven die specifiek zijn voor de stam, groeiomstandigheden en omgevingsstress, die betrokken zijn bij celsignalering, antimicrobiële resistentie en immuunontwijking van de gastheer4. Een veel voorkomende modificatie is bijvoorbeeld de toevoeging van een C6-acetylgroep op de MurNAc die resistentie verleent door de toegang tot de glycaan-β-1,4-bindingen te beperken tot door de gastheer geproduceerde lysozymenzymen die PG 4,5,6 afbreken. Bij Enterokokken verleent substitutie van de terminale ᴅ-Ala van de peptide-sidechain door ᴅ-Lac een grotere resistentie tegen de antimicrobiële vancomycine 7,8.

De algemene procedure voor PG-isolatie en -zuivering is relatief ongewijzigd gebleven sinds deze in de jaren 1960 werd beschreven9. Bacteriële membranen worden opgelost door warmtebehandeling met SDS, gevolgd door enzymatische verwijdering van gebonden eiwitten, glycolipiden en overblijvend DNA. De gezuiverde intacte sacculus kan vervolgens worden verteerd tot de afzonderlijke componenten door hydrolyse van de β-1,4 koppeling tussen GlcNAc en MurNAc. Deze vertering produceert GlcNAc-MurNAc-disachariden met intacte structurele wijzigingen en/of crosslinks en worden muropeptiden genoemd (figuur 1B).

Compositieanalyse van PG werd aanvankelijk uitgevoerd door middel van hogedrukvloeistofchromatografische scheiding (HPLC) om elk muropeptide te zuiveren, gevolgd door handmatige identificatie van muropeptiden10,11. Dit is sindsdien vervangen door vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS), die de detectiegevoeligheid verhoogt en de handmatige werklast van het zuiveren van elk individueel muropeptide vermindert. De tijdrovende en complexe aard van de handmatige identificatie van muropeptiden is echter een beperkende factor gebleven, waardoor het aantal uitgevoerde studies is afgenomen. In de afgelopen jaren met de opkomst van "omic" -technologieën, is geautomatiseerde LC-MS-functie-extractie een krachtig hulpmiddel geworden, waardoor snelle detectie en identificatie van individuele verbindingen in complexe monsters uit zeer grote datasets mogelijk is. Zodra de kenmerken zijn geïdentificeerd, vergelijkt bioinformatische software statistisch de variatie tussen monsters met behulp van differentiële analyse, waarbij zelfs minimale verschillen tussen de complexe dataset worden geïsoleerd en grafisch aan de gebruiker worden weergegeven. De toepassing van feature extraction software voor de analyse van PG samenstelling is nog maar net begonnen te worden onderzocht 12,13,14 en gekoppeld aan bioinformatica analyse 12. In tegenstelling tot proteomische analyse, die profiteert van de direct beschikbare eiwitdatabases die peptidefragmentatie voorspellen, waardoor volledig geautomatiseerde identificatie mogelijk is, bestaat er momenteel geen fragmentatiebibliotheek voor peptidoglycomics. Functie-extractie kan echter worden gekoppeld aan bekende en voorspelde structurele databases om muropeptide-identificatie te voorspellen12. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van LC-MS-gebaseerde functie-extractie in combinatie met een muropeptidebibliotheek voor geautomatiseerde identificatie en bioinformatische differentiële analyse van PG-samenstelling (figuur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Peptidoglycaan monstervoorbereiding

  1. Groei van bacterieculturen
    OPMERKING: De groei van de bacterieculturen zal variëren afhankelijk van de bacteriesoort en de groeiomstandigheden die worden onderzocht. De te testen experimentele parameters zullen de groeiomstandigheden bepalen.
    1. Kweek bacterieculturen onder groeiomstandigheden die nodig zijn voor de bacteriestam en het experimentele ontwerp. Kweek bacteriën als drievoudige culturen (biologische replicaties), d.w.z. drie afzonderlijke kolonies per stam of groeiconditie.
      OPMERKING: Van groeiomstandigheden en groeifase is bekend dat ze significante effecten hebben op PG-samenstelling 1,2,10. Er moet grote zorg worden besteed aan het handhaven van de consistentie tussen culturen en replicaties om ervoor te zorgen dat veranderingen in de samenstelling te wijten zijn aan de experimentele parameters en niet aan experimentele fouten.
    2. Koel de cultuur snel af tot 4 °C, verzamel door centrifugeren (11.000 x g, 10 min, 4 °C) en vries de celpellet in bij -20 °C. Was de celpellet met voorgekoeld 4 °C, 20 mM natriumfosfaat pH 6,5 voor het invriezen. De productie van de bevroren celpellet moet zo snel en zo consistent mogelijk tussen de monsters gebeuren om de activiteit van enzymen te beperken die de PG tijdens het verzamelproces kunnen wijzigen en/of afbreken. Monsters kunnen rechtstreeks door het extractieproces (punt 1.2) worden verwerkt zonder in te vriezen; Zorg er echter voor dat alle monsters op dezelfde manier worden verwerkt.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat er voldoende product is voor latere stappen, wordt een natte celpellet van aanzienlijke grootte gebruikt. Dit produceert een voldoende grote sacculi-pellet, die gemakkelijk kan worden gevisualiseerd en onderhouden tijdens de repetitieve wasstappen (secties 1.2.5 en 1.2.14) zonder significant verlies van product. Afhankelijk van de bacterie en de groeiomstandigheden zal deze opbrengst waarschijnlijk variëren. Voor de Gram-negatieve bacterie Pseudomonas aeruginosa, PAO1, produceerde 4 L van een 0,5 OD600 cultuur een 3-4 g celpellet en was voldoende om ~10 mg gezuiverde sacculi te produceren (sectie 1.2.17)12. Dit is een grote overmaat aan sacculi dan nodig is voor de LC-MS (rubriek 2); het zal echter helpen bij de meetnauwkeurigheid (paragraaf 1.2.17) en normalisatie (paragraaf 1.3).
  2. Extractie van peptidoglycan sacculi
    OPMERKING: Het protocol voor de extractie van PG is aangepast van ref.9,11,15. Dit protocol zal de PG extraheren uit individuele bacteriële cellen als een geheel sacculi, vrij van andere cellulaire componenten. Het protocol kan worden gebruikt met gramnegatieve of grampositieve bacteriën. Voor Gram-positieve cellen kunnen echter aanpassingen nodig zijn om de dikkere PG-structuur te isoleren en celwandgeassocieerde polymeren te verwijderen; zoals teichoïnezuren.
    1. Resuspendeerde bevroren celpellets bij ongeveer 1:10 van het oorspronkelijke kweekvolume van 20 mM natriumfosfaat pH 6,5. Voer deze stap uit bij 4 °C (kan 1-8 mg nattecelpelletgewicht per ml buffer11,12 zijn).
      OPMERKING: Om de acetyleringstoestand van de PG te behouden, is een pH van 6,5 of lager vereist15,16.
    2. Voeg druppelsgewijs celsuspensie toe aan het koken van 8% natriumdodecylsulfaat (SDS) 20 mM natriumfosfaat pH 6,5 voor een laatste volume van 1:1 (d.w.z. de eindconcentratie is 4% SDS), voorzichtig roerend in een ronde bodemkolf uitgerust met een watergekoelde condensor. (Figuur 2, stap 2)
    3. Houd een zachte kook gedurende 30 minuten tot 3 uur met roeren om volledige membraandissociatie te garanderen. Zorg ervoor dat het resulterende mengsel volledig helder is zonder resterende celklonters of viscositeit. Langer koken heeft de voorkeur om volledige dissociatie te garanderen.
    4. Laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Het monster kan een nacht bij kamertemperatuur worden bewaard.
      OPMERKING: Wanneer SDS aanwezig is, bewaar de monsters dan op kamertemperatuur om SDS in de oplossing te houden.
    5. Verzamel sacculi als pellet door ultracentrifugatie bij 70.000 x g gedurende 40 minuten (of de tijd die nodig is om sacculi volledig te bezinken) bij 25 °C.
    6. Was sacculi herhaaldelijk door opeenvolgende ultracentrifugatie (sectie 1.2.5) en suspensie in ~50 ml kamertemperatuur 20 mM natriumfosfaat pH 6,5 totdat de wasbuffer een SDS-concentratie van ~0,001% heeft. Meestal zijn 5 tot 7 wasbeurten voldoende.
      OPMERKING: Om de concentratie van het resterende SDS in de wasbuffer te testen, gebruikt u de colorimetrische kleurstof Stains-all17.
    7. Resuspendie sacculi in 5-10 ml kamertemperatuur 20 mM natriumfosfaat pH 6,5.
    8. Soniceer het monster kort (~ 40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) bij kamertemperatuur om klonten te dispergeren.
      OPMERKING: Uitgebreide ultrasoonapparaat veroorzaakt mechanisch afschuiving van de PG-structuur18.
    9. Vul het monster aan met 50 μg/ml amylase, DNase en RNase, 10 mM magnesiumsulfaat en verteer het gedurende 1 uur bij 37 °C met roeren of nutatie.
      OPMERKING: Amylasevertering verwijdert alle resterende glycogeen gevangen in de sacculi11.
    10. Voeg 100 μg/ml pronase toe en verteer bij 37 °C gedurende een nacht met roeren of nutatie en ~0,02% natriumazide.
      OPMERKING: Pronasevertering verwijdert de toegevoegde enzymen (uit rubriek 1.2.9) en verwijdert lipoproteïnen die covalent aan de PG zijn gekoppeld.
      LET OP: Natriumazide is zeer giftig en vereist de juiste gebruiks- / verwijderingsmethoden.
    11. Ultracentrifugeer bij 70.000 x g gedurende 40 minuten (of de tijd die nodig is om sediment sacculi volledig te bezinken) bij 25 °C om natriumazide te verwijderen.
    12. Resuspensie van de pellet in 25 ml 2% SDS 20 mM natriumfosfaat pH 6,5.
    13. Kook gedurende 1 uur in een stomer of in de kolf met ronde bodem met watergekoelde condensor (punt 1.2.2).
      OPMERKING: De tweede SDS-kookstap verwijdert alle resterende eiwitten en verontreinigingen uit de sacculi.
    14. Herhaal de sacculi-was (sectie 1.2.6) met ~50 ml dubbel gedestilleerd water op kamertemperatuur (ddH2O) totdat de SDS-concentratie ~0,001% is.
    15. Resuspendeerde de pellet in een voldoende hoeveelheid ddH2O om sacculi te suspenseren, was de container (bijv. 25 ml) en vries 's nachts in bij -80 °C. Het volume kan variëren omdat het monster in de volgende stap gelyofiliseerd zal worden, hoewel kleinere volumes minder tijd nodig hebben om te lyofileren.
    16. De volgende dag, lyofileer de suspensie en bewaar bij kamertemperatuur.
    17. Meet de hoeveelheid gelyofiliseerde sacculi verkregen op een analytische balans.
    18. Verdun sacculi in ddH2O tot 10 mg / ml en soniceer kort om klonten te breken voorafgaand aan verdere analyse.
  3. Kwantificering van gezuiverde peptidoglycaan
    1. Kwantificeer de hoeveelheid gezuiverde sacculi uit punt 1.2.18 om ervoor te zorgen dat de massaspecificatiegegevens tijdens de differentiële analyse gelijk worden getrokken (punt 3.2). Volg de gedetailleerde methodologie die wordt beschreven in referentie15.
      OPMERKING: Gezuiverde sacculi (punt 1.2.18) worden door zure hydrolyse afgebroken tot afzonderlijke suiker- en aminozuurcomponenten. Individuele componenten worden gescheiden en gekwantificeerd door anionenwisselingschromatografie met behulp van gepulseerde amperometrische detectie. Gezien de structuur van PG (figuur 1) zijn individuele muropeptiden samengesteld uit een enkel MurNAc en een enkel GlcNAc-residu. Daarom vertegenwoordigt het kwantificeren van de concentratie van beide residuen de hoeveelheid muropeptiden 1:1 in het monster. MurNAc heeft de voorkeur vanwege de schone piekscheiding van andere PG-componenten tijdens chromatografie16.

2. Massaspectrometrie data-acquisitie

  1. Bereiding van muropeptiden voor massaspectrometrie
    1. Vul 800 μg gezuiverde sacculi aan met 100 μg/ml mutanolysine, 100 mM ammoniumacetaat pH 5,5 en 50 mM magnesiumchloride in een reactie van 100 μL.
    2. Verteer 's nachts bij 37 °C.
    3. Voeg 1:1 volume 0,5 M boraatbuffer pH 9,0 toe en vul aan met ~10 mg/ml natriumboorhydride (NaBH4).
      OPMERKING: Mutarotatie van cyclische suikers tussen α en β anomere vormen zal meerdere piekformaties veroorzaken tijdens de vloeistofchromatografiescheiding van de muropeptiden. De behandeling met NaBH4 elimineert interconversie tussen de twee vormen door MurNAc te verminderen in muramitol11. De behandeling vermindert geen 1,6-anhydro MurNAc of 1,4-gebonden suikerresiduen.
      LET OP: De reactie van NaBH4 produceert kleine hoeveelheden waterstofgas. De NaBH4-reactie zal bellen creëren en microfugebuizen moeten open worden gehouden om gas te laten ontsnappen.
    4. Incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende ~20-30 min.
    5. Centrifugeer kort om het monster in de microfugebuis te laten bezinken en belletjes te verwijderen.
    6. Stel de pH in op <4,0 met behulp van 1:5 fosforzuur, toegevoegd in stappen van 5 μL. Test de pH met lakmoesproefstrips.
    7. Centrifugeer op ~ 17.000 x g gedurende 1 minuut om het resterende onoplosbare materiaal te bezinken.
    8. Filter met microcentrifugefilters van 0,2 μm.
    9. Monsters worden gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 30.000 x g voorafgaand aan injectie in LC-MS om ervoor te zorgen dat eventuele deeltjes niet in MS worden geïnjecteerd.
  2. Installatie van LC-MS
    1. Bevestig een C18 oppervlakkig poreuze deeltjeskolom (100 mm x 2,1 mm, poriegrootte <3 μm) aan een Quadrupole-Time of Flight (QTOF) massaspectrometer met een minimale detectienauwkeurigheid van vier decimalen m/z .
    2. Voer vloeistofchromatografiescheiding van muropeptiden uit
      OPMERKING: Elke biologische triplicate (paragraaf 1.1.1) moet driemaal door de LC-MS (punten 2.2.2 tot en met 2.2.3) worden geleid (technische triplicate). Daarom heeft elke geteste aandoening in totaal negen LC-MS-gegevensbestanden. De gegevensverzameling werd uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare software (zie materiaaltabel). Acquisitiesoftware moet echter worden gekozen op basis van de MS-machines. Het volgende is een handleiding voor het instellen van de MS met parameters die specifiek zijn voor het uitvoeren van dit protocol. Raadpleeg voor een gedetailleerde beschrijving de handleiding van de fabrikant.
      1. Bereid voor chromatografische scheiding de volgende oplosmiddelen 0,1% mierenzuur (A) en acetonitril met 0,1% mierenzuur (B).
      2. Stel een methode in voor chromatografische scheiding met behulp van de volgende parameters.
      3. Stel het debiet in op 0,4 ml/min.
      4. Conditioneer de kolom gedurende 10 minuten op 2% B (~24 kolomvolumes).
      5. Injecteer met behulp van een autosampler 10 μl monster uit rubriek 2.1.9.
        OPMERKING: Voer één eerste voorbeeld uit via het LC-MS-protocol voordat u begint met het verzamelen van gegevens. Deze run wordt niet gebruikt voor gegevens, maar om de reproduceerbaarheid van de retentietijd voor alle volgende runs te vergroten. De reproduceerbaarheid van de retentietijd is vereist tijdens spectrale verwerking (punt 3.1) voor de nauwkeurige identificatie en groepering van pieken in de massa-ladingsverhouding (m/z).
      6. Scheid muropeptiden met behulp van 2% B gedurende 5 minuten (~ 12 kolomvolumes), verhoog het vervolgens tot 15% B gedurende 13 minuten (~ 30 kolomvolumes), verhoog het verder tot 50% B gedurende 10 minuten (~ 24 kolomvolumes) en verhoog het uiteindelijk tot 98% B gedurende 2 minuten (~ 5 kolomvolumes).
        OPMERKING: Gooi de eerste 2 minuten en de laatste 5 minuten van de helling weg (naar afval verzenden).
      7. Werk af met een kolomwas op 98% B gedurende 6 minuten (~ 14 kolomvolumes) en 20 minuten (~ 47 kolomvolumes) opnieuw in evenwicht.
    3. Voer massaspectrometriedetectie van muropeptiden uit
      1. Kalibreer de massa-as in de positieve modus met behulp van een afstemmengsel in acetonitril dat LC-MS-referentiemassanormen bevat volgens de instructies van de fabrikant van de MS.
        OPMERKING: De MS wordt afgestemd vóór het begin van de chromatografische runs (paragraaf 2.2.2.1).
      2. Stel een methode in voor MS-gegevensverzameling met behulp van de volgende parameters.
        OPMERKING: LS- en MS/MS-gegevens worden gelijktijdig met de chromatografische scheiding van de muropeptiden (rubrieken 2.2.2.4 en 2.2.2.5) verzameld (punten 2.2.3.2 tot en met 2.2.3.6). Zowel chromatografische als MS-parameters (secties 2.2.2.2 en 2.2.3.2) zijn een enkele methode die wordt toegevoegd tijdens het instellen van een werklijst voor het uitvoeren van meerdere monsters achter elkaar.
      3. Stel de elektrospray capillaire spanning in op 4,0 kV en de drooggastemperatuur op 350° C met een debiet van 13 L/min.
        OPMERKING: Stikstof (zuiverheid >99%) moet worden gebruikt als vernevelings-, droog- en botsingsgas tijdens het verzamelen van alle massaspectrometriegegevens.
      4. Stel de vernevelaardruk in op 40 psi en stel de fragmentor in op 150 V.
      5. Stel de RF-spanningen van het mondstuk, de skimmer en de octapool in op respectievelijk 1000 V, 65 V en 750 V.
      6. Stel het scanbereik in op 300-2.000 m/z in de positieve ionenmodus van 4 GHz (uitgebreid dynamisch bereik).
      7. Stel gegevensverzameling in met behulp van gegevensafhankelijke MS/MS-acquisitie met een MS- en MS/MS-scansnelheid van 1 spectra/seconde. Selecteer vijf voorlopermassa per cyclus, in de volgorde van afzonderlijk, dubbel en drievoudig geladen.
      8. Stel MS/MS fragmentatie botsingsenergieën in op 15, 20 en 30 eV.

3. Differentiële analyse van muropeptide abundantie

  1. LC-MS chromatogram spectrale verwerking
    OPMERKING: Recursieve functie-extractie werd uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare software (zie Materiaaltabel). Andere software voor het extraheren van functies kan worden gebruikt. Andere software kan echter extra handmatige gegevensverwerking vereisen om de zeer robuuste recursieve extractie te bereiken. Verschillende software gebruikt de terminologiefunctie, entiteit en samenstelling bijna door elkaar. Voor PG-analyse verwijzen ze allemaal naar de identificatie van het LC-MS-ionchromatogram dat representatief is voor een individueel muropeptide (bijv. Figuur 3). Tijdens spectrale verwerking (paragraaf 3.1) vertegenwoordigt een kenmerk de meerdere m/z-pieken die de meerdere mogelijke ionensoorten van een enkel muropeptide omvatten die zijn gegroepeerd onder een enkel samengesteld label.
    1. Start onder Bestand een nieuw project.
    2. Voeg de LC-MS QTOF-gegevensbestanden toe en wijs individuele gegevensbestanden toe aan een experimentele toestand / groep, bijvoorbeeld twee verschillende groeiomstandigheden.
    3. Voer de gegevensverwerkingswizard Batch recursieve functie-extractie (kleine moleculen / peptiden) uit en stel de gegevensverwerkingsfilters in op de parameters van de LC-MS-omstandigheden en instrumentatie om m / z-pieken die individuele muropeptiden vertegenwoordigen nauwkeurig te identificeren, groeperen en verifiëren. Onderzoek vanuit het chromatogram de retentietijddrift en variatie van m/z van bekende vergelijkbare pieken om initiële filterparameters in te stellen.
      OPMERKING: Recursieve functie-extractie maakt gebruik van een initieel ongericht moleculair objectextractiealgoritme om chromatogramkenmerken (m/z-pieken ) in alle gegevensbestanden te identificeren en uit te lijnen. Eenmaal gemaakt, worden deze functies gebruikt om de oorspronkelijke gegevensbestanden (recursief) opnieuw te beoordelen met een gericht algoritme voor moleculaire functie-extractie om de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van de geïdentificeerde kenmerken te verbeteren. Het is het beste om de initiële ongerichte extractie in te stellen met een smal detectievenster en bredere detectieparameters te gebruiken voor de recursieve extractie om pieken in alle gegevensbestanden te identificeren die mogelijk ontbreken in de initiële extractie. Het uitvoeren van de recursieve functie-extractie kan uren duren, afhankelijk van het aantal monsters, de complexiteit van de gegevens en de aanwezige computerhardware
    4. Bekijk de resultaten van de functie-extractie. Als een aanzienlijk aantal functies niet kan worden uitgelijnd in een groep, past u de recursieve filterparameters aan om het detectievenster naar wens te verbreden/beperken. Om dit te bereiken, inspecteert u het chromatogram en isotopenprofiel van elke geëxtraheerde functie om ervoor te zorgen dat de functiedetectie op dezelfde manier werd uitgevoerd in alle gegevensbestanden. Onderzoek voor elk geïdentificeerd object in een gegevensbestand ook de score, eventuele waarschuwingen en of de functie de gekozen filterparameters heeft doorstaan.
      OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat detectievensters smal genoeg blijven zodat verschillende functies niet per ongeluk worden gegroepeerd. Dit wordt vaak opgemerkt door ongelijksoortige isotopische profielen tussen gegevensbestanden, of significante m / z / retentietijdvariaties. Omgekeerd, als er meerdere functies zijn met vergelijkbare m / z en retentietijden, is het mogelijk dat de filterparameters te streng waren, waardoor één MS-piek in twee functies werd opgesplitst. Voer daarom functie-extractie (paragraaf 3.1.3) opnieuw uit met aangepaste filterparameters voor de retentietijd om een betere groepering van deze functies mogelijk te maken. Het visualiseren van de laagste abundantiepieken geeft aan of de gebruikte filters (paragraaf 3.1.3) nauwkeurig pieken boven achtergrondgeluid hebben geïdentificeerd. Als de laagste abundantiepieken lijken op de achtergrond, voert u de functie-extractie opnieuw uit met nieuwe achtergrondfilterparameters.
    5. Exporteer gegevens als een samengesteld uitwisselingsbestand (.cef) (een indeling die compatibel is met het statistische softwareprogramma) of een kolomgescheiden bestand (.csv) dat de massa, retentietijd en abundantie van elk kenmerk voor elk monster bevat.
  2. Differentiële analyse van spectrale kenmerken
    OPMERKING: Differentiële analyse werd uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare software (zie Tabel met materialen). Andere bioinformatica software kan worden gebruikt.
    1. Open het programma en start na instructie een nieuw project.
    2. Volg de instructies voor het importeren en analyseren van gegevens. Upload tijdens het importeren van gegevens de uitgepakte bestanden van de functie (sectie 3.1). Kies tijdens de gegevensanalyse significantie- en vouwverandering voor differentiële analyse en selecteer om gegevens te baseren op de mediane intensiteit voor alle gegevensbestanden. Stel geen gegevensfilters in (als dit in de vorige spectraverwerkingsstap (paragraaf 3.1) is gedaan), omdat het opnieuw toepassen van filters de robuuste recursieve functie-extractie teniet zou doen. Net als bij functie-extractie moet differentiële analyse echter worden uitgelijnd op basis van massa (m / z) en retentietijd als gevolg van drift in de LC-MS-gegevensverzameling. Gebruik de parameters die zijn bepaald bij het extraheren van functies (punt 3.1).
      OPMERKING: Normaliseer tussen gegevensbestanden met behulp van de muropeptidekwantificering (sectie 1.3) om ervoor te zorgen dat variaties te wijten zijn aan experimentele parameters en niet aan variaties in sacculi-zuivering (sectie 1.2). Gebruik de optie externe scaler om elk gegevensbestand aan te passen op verschillen in de MurNAc-concentratie van het monster.
    3. Zodra de analyse is voltooid, onderzoekt u de resulterende grafische en statistische analyses om muropeptiden te identificeren die een significante abundantieverandering tussen de geteste experimentele omstandigheden aantonen.
    4. Klik onder de projectnavigator met de rechtermuisknop op de verschillende analyses en kies een exportoptie om objectdetails op te slaan als een kolomgescheiden (.csv) gegevensbestand dat de m / z, retentietijd, onbewerkte en genormaliseerde intensiteitswaarden, p-waarde, FDR en vouwwijzigingen voor elke functie bevat. Meerdere analyses moeten worden opgeslagen om alle relevante gegevens te verkrijgen.
    5. Exporteer een tweede .csv bestand met alleen de muropeptiden die de statistische analyses hebben overtroffen, waaronder p-waarde <0,05 en vouwverandering >2.
  3. Het annoteren van muropeptide-identiteit aan spectrale kenmerken
    OPMERKING: Aan elk geïdentificeerd kenmerk moet een voorspelde muropeptidestructuur worden toegewezen op basis van de m/z en deze annotatie wordt bevestigd door de MS/MS-fragmentatie te onderzoeken. Na bevestiging van de annotaties kan het nodig zijn de differentiële analyse uit te voeren en te verfijnen (rubriek 3.2).
    1. Selecteer in de differentiële analysesoftware onder resultaatinterpretatie de optie ID-browser. Voeg een bibliotheek met verwachte muropeptidestructuren toe en selecteer vergelijkbare parameters als eerder gebruikt (paragraaf 3.1.3). Dit zal een voorspelde muropeptide-annotatie produceren voor elk geïdentificeerd kenmerk. Een bibliotheek van muropeptidestructuren kan worden geproduceerd met behulp van de m / z voor voorspelde muropeptidestructuren en MS-databasesoftware (zie Tabel met materialen). Een bibliotheek van de m/z van >6.000 mogelijke muropeptiden is echter te vinden in Referentie12.
    2. Selecteer de voorspelde muropeptide-annotatie op basis van de overeenkomende score en de biologische relevantie van het voorspelde muropeptide, d.w.z. kies het meest waarschijnlijke muropeptide dat aanwezig is in het biologische monster.
    3. Bevestig handmatig de voorspelde muropeptide-annotatie door de m/z-pieken van het MS/MS-chromatogram te vergelijken met de voorspelde m/z van alle mogelijke fragmentaties van een bekende muropeptidestructuur (bijv. Figuur 4).
      1. Bekijk de MS- en MS/MS-gegevens met behulp van een chromatogramweergaveprogramma (zie materiaaltabel, figuur 4).
      2. Teken de voorspelde muropeptidestructuur met behulp van een moleculaire editor (chemisch structuurtekenprogramma) (zie Materiaaltabel, Figuur 4, grijze inzet). Gebruik het gereedschap massafragmentatie om de m/z van MS-fragmenten weer te geven wanneer elke binding afzonderlijk of in combinatie wordt verbroken.
        OPMERKING: Afhankelijk van de fragmentatie-energie die wordt gebruikt voor MS / MS, kan fragmentatie optreden bij elke binding in de muropeptidestructuur. Sommige bindingen zijn echter gemakkelijker/vaak gefragmenteerd bij lagere energieniveaus. Fragmentatie in de peptide sidechain komt bijvoorbeeld het vaakst voor bij de amidebinding tussen aminozuren. Bij het beoordelen van de fragmentatie is het belangrijk op te merken dat GlcNAc-residuen zeer gemakkelijk worden gefragmenteerd uit het muropeptide. Daarom moet fragmentatie van de bekende muropeptidestructuur worden beoordeeld met en zonder GlcNAc. Vanwege de in-source fragmentatie van de GlcNAc kunnen verschillende kenmerken geëxtraheerd in spectrale verwerking (paragraaf 3.1) een enkele muropeptidestructuur vertegenwoordigen. Indien gevonden, moeten deze kenmerken worden samengevoegd en moet de differentiële analyse opnieuw worden beoordeeld.
      3. Vergelijk alle mogelijke fragmentaties van de bepaalde muropeptidestructuur (rubriek 3.3.3.2) met het MS/MS-chromatogram (rubriek 3.3.3.1). Om de muropeptide-annotatie te bevestigen, moeten de m/z-pieken van meerdere fragmenten worden gevonden in het MS/MS-chromatogram met een zeer minimaal m/z-uitlijningsvenster (figuur 4).
      4. Om de muropeptide-identiteit in het geval van dubbelzinnige MS/MS-fragmentatie op te helderen, herhaalt u de rubrieken 2.2.2 tot en met 2.2.3 met monsters (rubriek 2.1.9) voor aanvullende MS/MS-gegevensverzameling met een voorkeursvoorloperlijst van m/z en retentietijd met aanvullende MS/MS-fragmentatiebotsingsenergieën.
    4. Voor co-eluterende entiteiten die zijn geannoteerd als hetzelfde muropeptide, voert u de differentiële analyse (paragraaf 3.2.2) opnieuw uit en voegt u de geëxtraheerde kenmerken samen.
  4. Beoordeling van wereldwijde veranderingen in muropeptidemodificaties
    1. Bewerk het .csv bestand (sectie 3.2.4) van de statistisch significante hoogvouwverandering muropeptiden om een enkele kolom op te nemen voor elke muropeptidemodificatie. Vul deze kolom met een aanduiding voor elk geannoteerd muropeptide (sectie 3.3) (bijv. geacetyleerd versus gede-N-geacetyleerd GlcNAc of MurNAc).
    2. Upload het gewijzigde .csv bestand naar Perseus22,23. Importeer de genormaliseerde intensiteitswaarden in het vak Hoofdimport en importeer de wijzigingsaanduiding in het vak Categorische import.
    3. Klik onder Rijen annoteren op Rijen categorisch annoteren en voeg gegevensbestanden toe aan elke experimentele parameter.
    4. Klik onder test op twee voorbeeldtoetsen om de t-toets van een leerling uit te voeren (p-waarde < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
    5. Klik op 1D om 1D annotatie22,23 uit te voeren. Een 1D-annotatie FDR < 0,05 duidt op een significante abundantieverandering voor de muropeptidemodificatie tussen de geteste experimentele parameters. Als u de drempelwaarde (s0) = 1 instelt, worden de 1D-annotatie FDR-scores voor alle muropeptiden weergegeven.
    6. Maak in een grafische software (zie Materiaaltabel) een heatmap van de abundantievouwverandering voor elke muropeptidemodificatie en toon de 1D-annotatiescore om significantie aan te tonen (figuur 5B). De vouwverandering van elke muropeptidemodificatie kan in Microsoft Excel worden geproduceerd met behulp van de onbewerkte intensiteiten van alle individuele muropeptiden die de wijziging bevatten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De verhoogde detectiegevoeligheid van MS-machines in combinatie met krachtige piekherkenningssoftware heeft de mogelijkheid verbeterd om stofsamenstellingen van complexe monsters tot in de kleinste details te isoleren, te bewaken en te analyseren. Met behulp van deze technologische vooruitgang zijn recente studies over de samenstelling van peptidoglycaan begonnen met het gebruik van geautomatiseerde LC-MS-functie-extractietechnieken 12,13,14,24 ten opzichte van oudere HPLC-gebaseerde methodologie 11,25,26,27,28,29,30,31 . Hoewel er tal van generieke softwarepakketten voor functie-extractie beschikbaar zijn, is commerciële software met recursieve functie-extractie snel en zeer robuust door automatisch alle ladingen, isotopen en adductversies van elk muropeptide in de LC-MS-dataset te identificeren en te combineren (figuur 3). Bovendien worden initiële retentietijden, m/z en isotopische patronen van geëxtraheerde kenmerken gebruikt om de dataset opnieuw te beoordelen (recursief) om een nauwkeurige identificatie van elk kenmerk in alle gegevensbestanden te garanderen. Daarom helpt het recursieve algoritme bij het valideren en vergroten van het vertrouwen in piekidentificatie. De meeste generieke functie-extractieprogramma's groeperen geen ladingen / isotopen, enz. en zal dit nodig hebben als een extra handmatige stap. Bovendien zullen generieke programma's minder robuust zijn omdat functies afzonderlijk worden geëxtraheerd binnen elk gegevensbestand en niet als een volledige dataset, die deel uitmaakt van het recursieve algoritme.

Het hier gepresenteerde peptidoglycomische protocol werd onlangs gebruikt om de samenstellingsveranderingen van PG tussen twee fysiologische groeiomstandigheden te onderzoeken, namelijk vrijzwemmende planktonische en stationaire gemeenschappelijke biofilm12. Met behulp van een zeer gevoelige QTOF MS in combinatie met de recursieve functie-extractie werden 160 verschillende muropeptiden herkend en gevolgd. Dit vertegenwoordigde acht keer het aantal muropeptiden dat eerder in dit organisme werd geïdentificeerd 29,32, en meer dan het dubbele van de muropeptiden geïdentificeerd met behulp van andere methodologieën in andere organismen10,14,24.

Het associëren van elke m/z-piek geëxtraheerd uit de MS-gegevens met een bepaald muropeptide wordt vergemakkelijkt door kruisverwijzingen met een database van bekende en voorspelde muropeptidestructuren. Het fragmentatie MS/MS chromatogram (figuur 4) voor elk geëxtraheerd kenmerk wordt vergeleken met het fragmentatieprofiel (figuur 4, grijze inzet) van het muropeptide voorgesteld met behulp van de database.

Peptidoglycomische gegevens kunnen op een aantal verschillende manieren worden bekeken, afhankelijk van de experimentele opstelling en de vragen die worden gesteld. Een dergelijke grafische analyse kan principal components analysis (PCA), scatterplots, vulkaanplots, heatmaps en hiërarchische clusteringanalyse omvatten. Vulkaanplots benadrukken bijvoorbeeld muropeptiden die een statistisch significante grote omvang van abundantieverandering tussen de geteste omstandigheden aantonen (figuur 5A). Deze geselecteerde muropeptiden, die significante abundantieveranderingen tussen de geteste omstandigheden vertegenwoordigen, kunnen verder worden onderzocht op muropeptidemodificaties. Deze wijzigingen kunnen de aanwezigheid van aminozuursubstituties, acetyleringsveranderingen of de aanwezigheid van amidase-activiteit omvatten. Wanneer ze samen worden onderzocht, kunnen meerdere muropeptiden met dezelfde modificatie worden onderzocht op een trend naar één experimentele aandoening (figuur 5A - gemarkeerde punten groen) en de hele groep beoordeeld op significantie (figuur 5B). Het volgen van een muropeptidemodificatie op deze manier, kan wijzen op een bepaalde enzymatische activiteit die wordt beïnvloed door de experimentele parameter. Bovendien kunnen uitschieters van deze trend wijzen op enzymatische activiteit met een bepaalde specificiteit of biologische functie (figuur 5A - gemarkeerd punten oranje).

Figure 1
Figuur 1: Voorbeeld van een typische Gram-negatieve peptidoglycaan structuur. (A) Bij gramnegatieve bacteriën bevindt peptidoglycaan zich in het periplasma tussen de binnenste en buitenste membranen. (B) Een enkel muropeptide bestaat uit een β-1,4-gebonden N-acetylglucosamine (GlcNAc) (blauw) en een N-acetyl muramic acid (MurNAc) (paars) met een toegevoegde peptide sidechain (oranje). De peptide-sidechain kan worden verknoopt met de sidechain van aangrenzend muropeptide dat de volwassen mesh-achtige peptidoglycan (A) produceert. Zuivering omvat de isolatie van de peptidoglycaan uit de hele cel als een sacculus waar al het andere cellulaire materiaal is verwijderd. (C) Transmissie-elektronenmicrografie van een peptidoglycaan sacculi. Ter vergelijking: Gram-positieve PG kan bestaan uit een grotere reeks variaties in structuur en maakt deel uit van Gram-positieve taxonomische classificatie33. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Peptidoglycomics workflow. Monstervoorbereiding. Stap 1, kweek en pellet bacteriële cellen (rubriek 1.1). Stap 2, zuiver peptidoglycan sacculi met 4% SDS kook (rubriek 1.2). Data-acquisitie. Stap 3, enzymatische vertering van sacculi om muropeptiden te produceren door breuk van de β-1,4-koppeling tussen de N-acetylglucosamine (GlcNAc) en N-acetylmuramic acid (MurNAc) van de peptidoglycaan ruggengraat (rubriek 2.1). Stap 4, analyse van de intensiteit van muropeptide via LC-MS/MS (rubriek 2.2). Data-analyse. Stap 5, recursieve functie-extractie identificeert en verzamelt alle ladingen, adducten en isotopen geassocieerd met een enkel muropeptide (rubriek 3.1). Stap 6, identificatie van muropeptiden door vergelijking van voorspelde fragmentatie met MS/MS chromatogrammen (rubriek 3.3). Stap 7, bioinformatische differentiële analyse (rubriek 3.2) waarbij peptidoglycaansamenstellingsveranderingen tussen verschillende experimentele parameters worden vergeleken. Stap 8, onderzoek de globale verandering in muropeptidemodificaties binnen de verschillende experimentele parameters met behulp van 1D-annotatie (paragraaf 3.4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Voorbeeld van een recursieve functie-extractie. Voor een muropeptide dat een peptide-sidechain van alanine (A), iso-ᴅ-glutamaat (E), meso-diaminopimelic acid (m), alanine (A) gekruist met de AE m A van de aangrenzende muropeptide sidechain (1864,8 m/z). Inbegrepen in de geëxtraheerde functie voor 1864,8 m/z zijn ladingen (+1, +2 en +3), adducten (bijv. natrium en kalium), verlies van GlcNAc (1 of 2 GlcNAc) en meerdere isotopische pieken voor elke variatie (bijv. ingezoomde inzet). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Muropeptide fragmentatie en identificatie. Voor annotatie krijgt elke m/z-piek (kenmerk) geëxtraheerd uit het MS-chromatogram een voorgestelde muropeptidestructuur op basis van gelijkenis met een muropeptidebibliotheek. Om deze voorgestelde structuur te bevestigen, worden voorspelde MS/MS-fragmenten gegenereerd met behulp van een chemisch tekenprogramma (grijze inzet). Deze voorspelde fragmentatie wordt vergeleken met het MS/MS chromatogram. Wanneer voorspelde fragmenten (grijze inzet) overeenkomen met het MS/MS-chromatogram, wordt de voorgestelde muropeptidestructuur bevestigd. Het cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Differentiële analyse van de peptidoglycaansamenstelling. (A) Vulkaanplot van de vouwverandering en statistische significantie van veranderingen in muropeptide-intensiteit tussen peptidoglycaan gezuiverd uit P. aeruginosa gekweekt als vrijzwemmende planktonische of stationaire biofilmcultuur. Alle muropeptiden die een modificatie hebben die een verandering in de typische aminozuurrangschikking binnen de peptide-zijketen vertegenwoordigde, worden gemarkeerd. Aminozuurgesubstitueerde muropeptiden die een trend vertoonden naar verminderde abundantie in biofilm-afgeleide peptidoglycan zijn groen gemarkeerd. Aminozuurvervangende muropeptiden die uitschieters waren naar deze trend en een verhoogde overvloed vertoonden in biofilm-afgeleide peptidoglycan, worden oranje gemarkeerd. (B) Heatmap van de globale vouwverandering in abundantie van alle aminozuurgesubstitueerde muropeptiden met verhoogde abundantie (oranje) en verminderde abundantie (groen) in biofilms. Deze muropeptiden werden gehergroepeerd en beoordeeld op de vraag of aminozuursubstitutie plaatsvond op monomeren, verknoopte dimeren, of dat de vierde (AE m +), vijfde (AE mA +) of beide aminozuren (AEm ++) werden gesubstitueerd. De significantie van elke groep muropeptiden werd beoordeeld door 1D-annotatie met FDR-< 0,05 voor significantie en de bijbehorende 1D-score wordt weergegeven. 1D-annotatie kan alleen worden uitgevoerd op meer dan 2 muropeptiden (bijv. AEm ++ substitutie werd alleen gevonden op twee muropeptiden). Daarom moet in dit geval de significantie worden onderzocht voor de individuele muropeptiden en niet voor de groep. Het cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een methode om peptidoglycaan uit bacterieculturen te zuiveren, te verwerken voor LC-MS-detectie en de samenstelling te analyseren met behulp van bio-informaticatechnieken. Hier richten we ons op Gram-negatieve bacteriën en zal een kleine aanpassing nodig zijn om analyse van Gram-positieve bacteriën mogelijk te maken.

De bereiding van muropeptiden is vrijwel hetzelfde gebleven sinds het voor het eerst werd geproduceerd in de jaren 1960 9,11,15. Eenmaal gezuiverd, worden sacculi (rubriek 1.2.18) verteerd tot individuele muropeptiden met behulp van het muramidase-enzym mutanolysine van Streptomyces globisporus. Mutanolysine verteert de PG-structuur door de β-1,4-glycosidische koppeling te verbreken waarbij individuele muropeptiden vrijkomen die bestaan uit een GlcNAc-MurNAc-disacharide met toegevoegde peptide-sidechain en omvat eventuele modificaties of crosslinkages (figuur 1).

Een beperking van eerdere methodologie die werd gebruikt om PG-samenstelling te bestuderen, was de tijdrovende handmatige identificatie van muropeptiden. Vanwege de complexiteit en moeilijkheidsgraad kunnen adducten, ladingen en/of isotopen al dan niet in de analyse zijn opgenomen. Bovendien beperkten de meeste studies de analyse tot de meest voorkomende, dus het gemakkelijkst te zuiveren, muropeptiden. Vanwege de gecompliceerde aard van de methodologie zijn er daarom relatief weinig gedetailleerde PG-compositieanalyses op hoog niveau uitgevoerd. De "omic"-type analyses hebben recente technologische verbeteringen gebruikt voor de productie en statistische analyse van relatief grote en complexe LC-MS datasets voor het high-level overzicht van biologische systemen. De toepassing van peptidoglycomics zal de analyse van PG-samenstelling in zeer detail mogelijk maken.

Binnen peptidoglycomics vermindert recursieve functie-extractie de handmatige werklast en verhoogt het de nauwkeurigheid door alle gegevensbestanden tegelijk te onderzoeken. Een recursief functie-extractiealgoritme wordt gebruikt om unieke spectrale kenmerken (m/z-pieken) over meerdere LC-MS-chromatografische gegevensbestanden te identificeren, uit te lijnen en te groeperen, waardoor de identificatie van muropeptide m/z-pieken geautomatiseerd wordt. Dit algoritme maakt gebruik van isotopische patroonmatching die de talrijke potentiële isotopen, ionadducten en ladingstoestanden neemt en condenseert de meerdere m / z-pieken in zijn representatieve enkele verbinding (of kenmerk), die in dit geval een enkele muropeptide zou vertegenwoordigen (figuur 3). Verificatie van de spectrale kenmerkgroep wordt bereikt door retentietijd, m/z en isotopische patroonmatching binnen elk chromatografisch gegevensbestand te vergelijken om een robuuste extractie van het kenmerk in de gehele dataset te garanderen. Algemene algoritmen voor het vinden van functies bevatten mogelijk geen isotopenmatching of uitlijnen, groeperen of verifiëren m/z-pieken in meerdere monsters en vereisen aanvullende handmatige gegevensverwerking om deze functie-extractie te bereiken.

Zodra kenmerken zijn geïdentificeerd, behandelen bioinformatische differentiële analyse-algoritmen de zeer grote dataset als geheel, waardoor nuttige vergelijkingen en interpretaties van de complexe gegevens mogelijk zijn. Het gebruik van deze bioinformatische grafische analyses is een krachtige manier om grote datasets te visualiseren en te interpreteren om trends te onderzoeken die kunnen wijzen op biologische processen. Het was pas onlangs dat deze krachtige grafische analyses werden gebruikt om peptidoglycan in zeer fijn detail te onderzoeken12. Differentiële analyse (rubriek 3.2) beoordeelt de veranderingen in abundantie van individuele muropeptiden tussen verschillende experimentele omstandigheden. Binnen de context van hele bacteriële cellen kan de activiteit van PG-modificerende enzymen echter resulteren in meerdere verschillende muropeptidestructuren, afhankelijk van de specificiteit van de katalytische activiteit (d.w.z. de toevoeging van een acetylgroep aan de disacharide kan met of zonder een wijziging van de peptide-zijketen zijn). Daarom zal het beoordelen van de globale abundantieveranderingen van een bepaalde modificatie over alle individuele geannoteerde muropeptiden inzicht geven in de enzymatische activiteit die inwerkt op de PG (Figuur 5) Daarom wordt differentiële analyse gebruikt om de abundantieveranderingen van individuele muropeptiden te onderzoeken; terwijl 1D-annotatie abundantieveranderingen van een bepaalde PG-modificatie onderzoekt. Door differentiële analyse te koppelen aan 1D-annotatie kan de PG-samenstelling worden beoordeeld, zowel op individueel muropeptideniveau als als een indicator van de totale PG-enzymatische activiteit.

Tijdens differentiële analyse is het belangrijk op te merken dat PG is samengesteld uit een paar zeer overvloedige muropeptiden en talrijke muropeptiden met een lage abundantie12. Daarom is baselining erg belangrijk om eventuele bias van de muropeptiden met een hoge abundantie tijdens de latere stappen van de analyse te verwijderen. Vanwege de meerdere uitgevoerde t-tests moet ook een statistische correctie worden toegepast om valse positieven te verminderen. De standaardwaarde is vaak de Benjamini-Hochberg false-discovery rate (FDR)19. Andere correcties zoals het meer conservatieve Bonferroni familywise error rate (FWER)20,21 zijn mogelijk.

Binnen de bioinformaticasoftware krijgt de m/z-piek die wordt geïdentificeerd in functie-extractie ook een voorspelde structuur toegewezen. Andere "omic"-type (bijv. Proteomische) analyses profiteren van de beschikbaarheid van grote samengestelde databases, die identificatie van verbindingen mogelijk maken door middel van voorspellende fragmentatiespectra matching. Momenteel bestaat er geen door muropeptide voorspelde fragmentatiebibliotheek en de bevestiging van muropeptide-identificatie blijft een handmatige stap. Naarmate peptidoglycommische fragmentatiedatabases zich ontwikkelen en openbaar beschikbaar worden, zal deze handmatige identificatiestap echter meer geautomatiseerd en toegankelijk worden door de paragrafen 3.3.3 en 3.3.4 te elimineren of sterk te verminderen.

In Escherichia coli bestaat PG uit ~3,5 x 106 muropeptiden per cel34. Binnen de detectiegrenzen van de QTOF MS kunnen zelfs de laagst voorkomende muropeptiden nog steeds honderden kopieën van een enkel muropeptide in een celvertegenwoordigen 12. Daarom kan het begrijpen van de veranderingen in zelfs de laagste abundante muropeptiden nuttige inzichten bieden in de biologische activiteit van PG-gerichte enzymen in de cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Acknowledgments

De auteurs willen Dr. Jennifer Geddes-McAlister en Dr. Anthony Clarke bedanken voor hun bijdragen aan het verfijnen van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies van CIHR toegekend aan C.M.K (PJT 156111) en een NSERC Alexander Graham Bell CGS D toegekend aan E.M.A. Cijfers werden gemaakt op BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) Agilent LC-MS data acquisition
Heating mantle controller, Optichem Fisher 50-401-788 for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL Hemispherical Fisher CG1000008 for 4% SDS boil
Incubator, 37°C for sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40, Fisher CG121805 for 4% SDS boil
Lyophilizer Labconco for lyophilization of sacculi
Magentic stirrer Fisher 90-691-18 for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 Aglient LC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm Fisher 50-197-9573 cleanup of sample before MS injection
Retort stand Fisher 12-000-102 for 4% SDS boil
Retort clamp Fisher S02629 for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrex Fisher 07-250-084 for 4% SDS boil
Sonicator model 120 Fisher FB120 for sacculi purification
Sonicator - micro tip Fisher FB4422 for sacculi purification
Ultracentrifuge Beckman sacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45 Fisher NC9691797 sacculi wash steps
Water supply City for water cooled condenser
Software
Chemdraw Cambridgesoft molecular editor for muropeptide fragmentation prediction
Excel Microsoft viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter Acquisition Aglient running QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professional Aglient bioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager Aglient muropeptide m/z MS database
MassHunter Profinder Aglient recursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysis Aglient viewing MS and MS/MS chromatograms
Prism Graphpad Graphing software
Perseus Max Plank Institute of Biochemistry 1D annotation
Material
Acetonitrile Fisher A998-4
Ammonium acetate Fisher A637
Amylase Sigma-Aldrich A6380
Boric acid Fisher BP168-1
DNase Fisher EN0521
Formic acid Sigma-Aldrich 27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321 Agilent G1969-85000
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 Sigma-Aldrich M9901
Nitrogen gas (>99% purity) Praxair NI 5.0UH-T
Phosphoric acid Fisher A242
Pronase E from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
RNase Fisher EN0531
Sodium azide Fisher S0489
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166
Sodium hydroxide Fisher S318
Sodium Phosphate (dibasic) Fisher S373
Sodium Phosphate (monobasic) Fisher S369
Stains-all Sigma-Aldrich E9379

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
  4. Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
  6. Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
  7. Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
  8. Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
  9. Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
  10. Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
  11. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
  12. Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
  13. van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
  14. Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
  15. Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
  16. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  17. Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
  18. Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
  19. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  20. Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
  21. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
  22. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  23. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
  24. Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
  25. Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
  26. Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
  27. Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
  28. Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
  29. Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
  30. Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
  31. De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
  32. Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
  33. Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
  34. Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).

Tags

Retractie peptidoglycan muropeptiden massaspectrometrie functie-extractie differentiële analyse bio-informatica peptidoglycomics
Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, E. M., Greenwood, N. A.,… More

Anderson, E. M., Greenwood, N. A., Brewer, D., Khursigara, C. M. Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics. J. Vis. Exp. (164), e61799, doi:10.3791/61799 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter