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Biochemistry

Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

Published: October 13, 2020 doi: 10.3791/61799
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

Summary

Questo protocollo copre un'analisi dettagliata della composizione del peptidoglicano utilizzando la spettrometria di massa per cromatografia liquida abbinata a software avanzati di estrazione delle caratteristiche e analisi bioinformatica.

Abstract

Il peptidoglicano è un componente importante delle pareti cellulari batteriche e un bersaglio cellulare comune per gli antimicrobici. Sebbene gli aspetti della struttura del peptidoglicano siano abbastanza conservati in tutti i batteri, c'è anche una notevole variazione tra Gram-positivi / negativi e tra le specie. Inoltre, ci sono numerose varianti, modifiche o adattamenti noti al peptidoglicano che possono verificarsi all'interno di una specie batterica in risposta alla fase di crescita e / o stimoli ambientali. Queste variazioni producono una struttura altamente dinamica che è nota per partecipare a molte funzioni cellulari, tra cui la crescita / divisione, la resistenza agli antibiotici e l'evitamento della difesa dell'ospite. Per comprendere la variazione all'interno del peptidoglicano, la struttura complessiva deve essere scomposta nelle sue parti costitutive (note come muropeptidi) e valutata per la composizione cellulare complessiva. Peptidoglycomics utilizza la spettrometria di massa avanzata combinata con l'analisi dei dati bioinformatici ad alta potenza per esaminare la composizione del peptidoglicano nei minimi dettagli. Il seguente protocollo descrive la purificazione del peptidoglicano da colture batteriche, l'acquisizione di dati di intensità del muropeptide attraverso uno spettrometro di massa cromatografo liquido e l'analisi differenziale della composizione del peptidoglicano utilizzando la bioinformatica.

Introduction

Il peptidoglicano (PG) è una caratteristica distintiva dei batteri che serve a mantenere la morfologia cellulare, fornendo supporto strutturale per proteine e altri componenti cellulari 1,2. La spina dorsale del PG è composta dall'acido N-acetil muramico (MurNAc) alternato β-1,4-e dalla N-acetil glucosamina (GlcNAc)1,2. Ogni MurNAc possiede un peptide corto legato al residuo ᴅ-lattile che può essere reticolato con peptidi adiacenti legati al disaccaride (Figura 1A,B). Questa reticolazione produce una struttura a maglia che comprende l'intera cellula ed è spesso indicata come sacculus (Figura 1C). Durante la sintesi di PG, i precursori vengono generati nel citoplasma e trasportati attraverso la membrana citoplasmatica dalle flippasi. I precursori sono successivamente incorporati nel PG maturo dagli enzimi transglicosilasi e transpeptidasi, che producono rispettivamente i legami glicosidici e peptidici3. Tuttavia, una volta assemblati, ci sono numerosi enzimi prodotti dai batteri che modificano e / o degradano il PG per svolgere una serie di processi cellulari, tra cui la crescita e la divisione. Inoltre, varie modifiche del PG hanno dimostrato di conferire adattamenti specifici per la deformazione, le condizioni di crescita e lo stress ambientale, che sono stati implicati nella segnalazione cellulare, nella resistenza antimicrobica e nell'evasione immunitaria dell'ospite4. Ad esempio, una modifica comune è l'aggiunta di un gruppo acetilico C6 sul MurNAc che conferisce resistenza limitando l'accesso ai legami glicani β-1,4 agli enzimi lisozima prodotti dall'ospite che degradano PG 4,5,6. Negli enterococchi, la sostituzione del terminale ᴅ-Ala della catena laterale peptidica con ᴅ-Lac conferisce una maggiore resistenza all'antimicrobico, vancomicina 7,8.

La procedura generale per l'isolamento e la purificazione del PG è rimasta relativamente invariata da quando è stata descritta negli anni 19609. Le membrane batteriche vengono sciolte attraverso il trattamento termico con SDS, seguito dalla rimozione enzimatica delle proteine legate, dei glicolipidi e del DNA rimanente. Il sacculus intatto purificato può essere successivamente digerito nei singoli componenti mediante idrolisi del legame β-1,4 tra GlcNAc e MurNAc. Questa digestione produce disaccaridi GlcNAc-MurNAc con eventuali modifiche strutturali e/o legami incrociati intatti e sono chiamati muropeptidi (Figura 1B).

L'analisi composizionale del PG è stata inizialmente condotta attraverso la separazione cromatografica liquida ad alta pressione (HPLC) per purificare ciascun muropeptide seguita dall'identificazione manuale dei muropeptidi10,11. Da allora questo è stato sostituito dalla spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida (LC-MS), che aumenta la sensibilità di rilevamento e diminuisce il carico di lavoro manuale di purificazione di ogni singolo muropeptide. Tuttavia, la natura lunga e complessa dell'identificazione manuale dei muropeptidi è rimasta un fattore limitante, riducendo il numero di studi condotti. Negli ultimi anni con l'emergere di tecnologie "omiche", l'estrazione automatizzata delle caratteristiche LC-MS è diventata uno strumento potente, consentendo una rapida rilevazione e identificazione di singoli composti in campioni complessi da set di dati molto grandi. Una volta identificate le caratteristiche, il software bioinformatico confronta statisticamente la variazione tra i campioni utilizzando l'analisi differenziale isolando anche minime differenze tra i complessi set di dati e visualizzandoli graficamente all'utente. L'applicazione di software di estrazione di caratteristiche per l'analisi della composizione PG ha appena iniziato ad essere esplorata 12,13,14 e accoppiata all'analisi bioinformatica 12. A differenza dell'analisi proteomica che beneficia dei database proteici prontamente disponibili che prevedono la frammentazione dei peptidi consentendo un'identificazione completamente automatizzata, attualmente non esiste una libreria di frammentazione per i peptidoglycomics. Tuttavia, l'estrazione delle caratteristiche può essere accoppiata con database strutturali noti e previsti per prevedere l'identificazione del muropeptide12. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'uso dell'estrazione di caratteristiche basata su LC-MS combinata con una libreria di muropeptidi per l'identificazione automatizzata e l'analisi differenziale bioinformatica della composizione PG (Figura 2).

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Protocol

1. Preparazione del campione di peptidoglicano

  1. Crescita di colture batteriche
    NOTA: La crescita delle colture batteriche varierà a seconda delle specie batteriche e delle condizioni di crescita esaminate. I parametri sperimentali da testare definiranno le condizioni di crescita.
    1. Coltivare colture batteriche nelle condizioni di crescita richieste per il ceppo batterico e il disegno sperimentale. Coltivare i batteri come colture triplicate (repliche biologiche), cioè tre colonie separate per ceppo o condizione di crescita.
      NOTA: È noto che le condizioni di crescita e la fase di crescita hanno effetti significativi sulla composizione PG 1,2,10. Grande attenzione deve essere posta nel mantenere la coerenza tra culture e repliche per garantire che i cambiamenti compositivi siano dovuti ai parametri sperimentali e non all'errore sperimentale.
    2. Raffreddare rapidamente la coltura a 4 °C, raccogliere mediante centrifugazione (11.000 x g, 10 min, 4 °C) e congelare il pellet cellulare a -20 °C. Lavare il pellet cellulare con 4 °C preraffreddato, 20 mM di fosfato di sodio pH 6,5 prima del congelamento. La produzione del pellet cellulare congelato deve essere effettuata nel modo più rapido e coerente possibile tra i campioni per limitare l'attività degli enzimi che potrebbero modificare e/o degradare la PG durante il processo di raccolta. I campioni possono essere trattati direttamente attraverso il processo di estrazione (sezione 1.2) senza congelamento; Tuttavia, assicurarsi che tutti i campioni vengano elaborati in modo simile.
      NOTA: Per garantire un prodotto sufficiente per le fasi successive, viene utilizzato un pellet a cellule umide di dimensioni significative. Questo produce un pellet sacculi abbastanza grande, che può essere facilmente visualizzato e mantenuto durante le fasi di lavaggio ripetitivo (punti 1.2.5 e 1.2.14) senza perdite significative di prodotto. A seconda del batterio e delle condizioni di crescita, questa resa probabilmente varierà. Per il batterio Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa, PAO1, 4 L di una coltura di 0,5 OD600 hanno prodotto un pellet cellulare di 3-4 g ed è stato sufficiente per produrre ~ 10 mg di sacculi purificati (sezione 1.2.17)12. Si tratta di un eccesso di sacculi elevato rispetto a quello richiesto per la LC-MS (sezione 2); Tuttavia, aiuterà nella precisione della misurazione (sezione 1.2.17) e nella normalizzazione (sezione 1.3).
  2. Estrazione di peptidoglycan sacculi
    NOTA: Il protocollo per l'estrazione del PG è adattato dal rif.9,11,15. Questo protocollo estrarrà il PG dalle singole cellule batteriche nel loro insieme sacculi, prive di altri componenti cellulari. Il protocollo può essere utilizzato con batteri Gram-negativi o Gram-positivi. Tuttavia, per le cellule Gram-positive, possono essere necessari aggiustamenti per isolare la struttura PG più spessa e rimuovere i polimeri associati alla parete cellulare; come, acidi teicoici.
    1. Risospendere i pellet di cellule congelate a circa 1:10 del volume di coltura originale di 20 mM di fosfato di sodio pH 6,5. Eseguire questo passaggio a 4 °C (può essere 1-8 mg di peso del pellet a cellule umide per mL di tampone11,12).
      NOTA: Per mantenere lo stato di acetilazione del PG, è necessario un pH di 6,5 o inferiore15,16.
    2. Aggiungere la sospensione cellulare goccia a goccia all'ebollizione 8% 8% sodio dodecilsolfato (SDS) 20 mM fosfato di sodio pH 6,5 per un volume finale 1: 1 (cioè la concentrazione finale è 4% SDS), mescolando delicatamente in un matraccio a fondo rotondo dotato di un condensatore raffreddato ad acqua. (Figura 2, passaggio 2)
    3. Mantenere una leggera ebollizione per 30 minuti a 3 ore agitando per garantire la completa dissociazione della membrana. Assicurarsi che la miscela risultante sia completamente limpida senza grumi di cellule o viscosità residui. Si preferisce un'ebollizione più lunga per garantire la completa dissociazione.
    4. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Il campione può essere lasciato a temperatura ambiente durante la notte.
      NOTA: quando è presente SDS, mantenere i campioni a temperatura ambiente per mantenere SDS nella soluzione.
    5. Raccogliere i sacculi sotto forma di pellet mediante ultracentrifugazione a 70.000 x g per 40 minuti (o il tempo necessario per sedimentare completamente i sacculi) a 25 °C.
    6. Lavare ripetutamente i sacculi mediante successiva ultracentrifugazione (punto 1.2.5) e sospensione in ~50 mL di temperatura ambiente 20 mM di fosfato di sodio pH 6,5 fino a quando il tampone di lavaggio ha una concentrazione SDS ~0,001%. In genere, sono sufficienti da 5 a 7 lavaggi.
      NOTA: Per testare la concentrazione della SDS rimanente nel tampone di lavaggio, utilizzare il colorante colorimetrico, Stains-all17.
    7. Risospendere sacculi in 5–10 mL di temperatura ambiente 20 mM fosfato di sodio pH 6,5.
    8. Sonicare brevemente il campione (~40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) a temperatura ambiente per disperdere i grumi.
      NOTA: la sonicazione prolungata causerà meccanicamente il taglio della struttura PG18.
    9. Integrare il campione con 50 μg/ml di amilasi, DNasi e RNasi, 10 mM di solfato di magnesio e digerire a 37 °C per 1 ora agitando o nutando.
      NOTA: La digestione dell'amilasi rimuove qualsiasi glicogeno residuo intrappolato all'interno dei sacculi11.
    10. Aggiungere 100 μg/mL di pronase e digerire a 37 °C durante la notte agitazione o nutazione e ~0,02% di azoturo di sodio.
      NOTA: La digestione pronasica rimuove gli enzimi aggiunti (dalla sezione 1.2.9) e rimuove le lipoproteine che sono legate covalentemente al PG.
      ATTENZIONE: L'azoturo di sodio è altamente tossico e richiede metodi di uso / smaltimento adeguati.
    11. Ultracentrifugare a 70.000 x g per 40 minuti (o il tempo necessario per sedimentare completamente i sacculi) a 25 °C per rimuovere l'azoturo di sodio.
    12. Risospendere il pellet in 25 ml di SDS 20 mM fosfato di sodio pH 6,5.
    13. Far bollire per 1 ora in una vaporiera o nel matraccio a fondo tondo con condensatore raffreddato ad acqua (punto 1.2.2).
      NOTA: La seconda fase di ebollizione SDS rimuove tutte le proteine e i contaminanti rimanenti dai sacculi.
    14. Ripetere il lavaggio sacculi (punto 1.2.6) con ~50 mL di acqua bidistillata a temperatura ambiente (ddH2O) fino a quando la concentrazione di SDS è ~0,001%.
    15. Risospendere il pellet in una quantità sufficiente di ddH2O per sospendere i sacculi, nonché lavare il contenitore (ad esempio, 25 ml) e congelare per una notte a -80 °C. Il volume può variare in quanto il campione verrà liofilizzato nella fase successiva, anche se volumi più piccoli richiedono meno tempo per liofilizzare.
    16. Il giorno dopo, liofilizzare la sospensione e conservare a temperatura ambiente.
    17. Misurare la quantità di sacculi liofilizzati ottenuta su una bilancia analitica.
    18. Diluire sacculi in ddH2O a 10 mg/ml e sonicare brevemente per rompere i grumi prima di ulteriori analisi.
  3. Quantificazione del peptidoglicano purificato
    1. Quantificare la quantità di sacculi purificati di cui al punto 1.2.18 per garantire che i dati delle specifiche di massa siano equalizzati durante l'analisi differenziale (punto 3.2). Seguire la metodologia dettagliata delineata nel riferimento15.
      NOTA: I sacculi purificati (punto 1.2.18) sono scomposti in singoli componenti di zuccheri e amminoacidi mediante idrolisi acida. I singoli componenti vengono separati e quantificati mediante cromatografia a scambio anionico mediante rilevamento amperometrico pulsato. Data la struttura della PG (Figura 1), i singoli muropeptidi sono composti da un singolo residuo di MurNAc e da un singolo residuo di GlcNAc. Pertanto, quantificare la concentrazione di entrambi i residui rappresenta la quantità di muropeptidi 1:1 all'interno del campione. Il MurNAc è preferito a causa della netta separazione del picco dagli altri componenti PG durante la cromatografia16.

2. Acquisizione dati di spettrometria di massa

  1. Preparazione di muropeptidi per spettrometria di massa
    1. Integrare 800 μg di sacculi purificati con 100 μg/mL di mutanolysin, 100 mM di acetato di ammonio pH 5,5 e 50 mM di cloruro di magnesio in una reazione di 100 μL.
    2. Digerire a 37 °C per una notte.
    3. Aggiungere tampone borato 1:1 volume 0,5 M pH 9,0 e integrare con ~10 mg/mL di boroidruro di sodio (NaBH4).
      NOTA: La mutarotazione degli zuccheri ciclici tra α e β forme anomeriche causerà più formazioni di picco durante la separazione della cromatografia liquida dei muropeptidi. Il trattamento con NaBH4 elimina l'interconversione tra le due forme riducendo il MurNAc in muramitolo11. Il trattamento non riduce i residui zuccherini legati all'1,6-anidro MurNAc o all'1,4.
      ATTENZIONE: La reazione di NaBH4 produce piccole quantità di idrogeno gassoso. La reazione di NaBH4 creerà bolle e i tubi di microfuge dovrebbero essere tenuti aperti per consentire al gas di fuoriuscire.
    4. Incubare il campione a temperatura ambiente per ~20-30 minuti.
    5. Centrifugare brevemente per depositare il campione nel tubo di microfugo e rimuovere le bolle.
    6. Regolare il pH a <4,0 utilizzando acido fosforico 1:5, aggiunto con incrementi di 5 μL. Test del pH utilizzando strisce reattive per il pH a cartina di tornasole.
    7. Centrifugare a ~17.000 x g per 1 minuto per sedimentare qualsiasi materiale insolubile rimanente.
    8. Filtrare con filtri microcentrifuga da 0,2 μm.
    9. I campioni vengono centrifugati per 10 minuti a 30.000 x g prima dell'iniezione in LC-MS per garantire che il particolato non venga iniettato nella SM.
  2. Configurazione di LC-MS
    1. Collegare una colonna di particelle superficialmente porose C18 (100 mm x 2,1 mm, dimensione dei pori <3 μm) a uno spettrometro di massa QTOF (Quadrupole-Time of Flight) con una precisione di rilevamento minima di quattro punti decimali m/z .
    2. Eseguire la separazione cromatografica liquida dei muropeptidi
      NOTA: Ogni triplice biologico (punto 1.1.1) deve essere eseguito attraverso la LC-MS (punti da 2.2.2 a 2.2.3) tre volte (triplice tecnica). Pertanto, ogni condizione testata avrà un totale di nove file di dati LC-MS. L'acquisizione dei dati è stata eseguita utilizzando software disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali). Tuttavia, il software di acquisizione dovrebbe essere scelto in base al macchinario MS. Di seguito rappresenta una guida per l'impostazione dello SM con parametri specifici per l'esecuzione di questo protocollo. Per una descrizione dettagliata, fare riferimento al manuale del produttore.
      1. Per la separazione cromatografica, preparare i seguenti solventi 0,1% acido formico (A) e acetonitrile con acido formico 0,1% (B).
      2. Impostare un metodo per la separazione cromatografica utilizzando i seguenti parametri.
      3. Impostare la portata su 0,4 ml/min.
      4. Condizionare la colonna per 10 minuti al 2% B (~24 volumi di colonna).
      5. Utilizzando un autocampionatore, iniettare 10 μL di campione dal punto 2.1.9.
        NOTA: eseguire un campione iniziale tramite il protocollo LC-MS prima di iniziare la raccolta dei dati. Questa esecuzione non viene utilizzata per i dati, ma per aumentare la riproducibilità del tempo di conservazione per tutte le esecuzioni successive. La riproducibilità del tempo di ritenzione è richiesta durante l'elaborazione spettrale (sezione 3.1) per l'identificazione accurata e il raggruppamento dei picchi del rapporto massa-carica (m/z).
      6. Separare i muropeptidi usando il 2% B per 5 minuti (~ 12 volumi di colonna), quindi aumentandolo al 15% B su 13 minuti (~ 30 volumi di colonna), aumentandolo ulteriormente al 50% B su 10 minuti (~ 24 volumi di colonna) e infine aumentandolo al 98% B su 2 minuti (~ 5 volumi di colonna).
        NOTA: scartare (inviare ai rifiuti) i primi 2 minuti e gli ultimi 5 minuti della pendenza.
      7. Terminare con un lavaggio della colonna al 98% B per 6 minuti (~14 volumi di colonna) e 20 minuti (~47 volumi di colonna).
    3. Eseguire la rivelazione spettrometrica di massa di muropeptidi
      1. Calibrare l'asse di massa in modalità positiva utilizzando una miscela di regolazione in acetonitrile contenente gli standard di massa di riferimento LC-MS seguendo le istruzioni del produttore MS.
        NOTA: La SM viene sintonizzata prima dell'inizio delle prove cromatografiche (punto 2.2.2.1).
      2. Impostare un metodo per l'acquisizione dei dati MS utilizzando i seguenti parametri.
        NOTA: i dati relativi alla SM e alla SM/SM sono raccolti (punti da 2.2.3.2 a 2.2.3.6) contemporaneamente alla separazione cromatografica dei muropeptidi (punti 2.2.2.4 e 2.2.2.5). Sia i parametri cromatografici che quelli MS (sezioni 2.2.2.2 e 2.2.3.2) sono un singolo metodo che viene aggiunto durante l'impostazione di una lista di lavoro per l'esecuzione di più campioni in sequenza.
      3. Impostare la tensione capillare dell'elettrospray a 4,0 kV e la temperatura del gas di essiccazione a 350°C con una portata di 13 L/min.
        NOTA: L'azoto (purezza >99%) deve essere utilizzato come gas di nebulizzazione, essiccazione e collisione durante tutta la raccolta dei dati di spettrometria di massa.
      4. Impostare la pressione del nebulizzatore a 40 psi e impostare il frammentatore su 150 V.
      5. Impostare le tensioni RF dell'ugello, dello skimmer e dell'ottapolo rispettivamente su 1000 V, 65 V e 750 V.
      6. Impostare l'intervallo di scansione su 300–2.000 m/z in modalità ioni positivi a 4 GHz (gamma dinamica estesa).
      7. Imposta la raccolta dei dati utilizzando l'acquisizione MS/MS dipendente dai dati con una velocità di scansione MS e MS/MS di 1 spettri/secondo. Selezionare cinque masse precursori per ciclo, nell'ordine di carica singola, doppia e tripla.
      8. Impostare le energie di collisione a frammentazione MS/MS a 15, 20 e 30 eV.

3. Analisi differenziale dell'abbondanza di muropeptidi

  1. Elaborazione spettrale del cromatogramma LC-MS
    NOTA: l'estrazione ricorsiva delle feature è stata eseguita utilizzando software disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali). È possibile utilizzare altri software di estrazione delle funzionalità. Tuttavia, altri software potrebbero richiedere un'ulteriore elaborazione manuale dei dati per eseguire l'estrazione ricorsiva altamente robusta. Vari software utilizzano la funzione terminologica, l'entità e il composto quasi in modo intercambiabile. Per l'analisi PG, tutti si riferiscono all'identificazione del cromatogramma ionico LC-MS rappresentativo di un singolo muropeptide (ad esempio, Figura 3). Durante l'elaborazione spettrale (sezione 3.1), una caratteristica rappresenta i picchi multipli m/z che comprendono le molteplici possibili specie ioniche di un singolo muropeptide che sono raggruppate sotto un'unica etichetta composta.
    1. In File avviare un nuovo progetto.
    2. Aggiungere i file di dati LC-MS QTOF e assegnare singoli file di dati a una condizione / gruppo sperimentale, ad esempio due diverse condizioni di crescita.
    3. Eseguire l'estrazione di feature ricorsive batch (piccole molecole/peptidi) della procedura guidata di elaborazione dati e impostare i filtri di elaborazione dati in modo che corrispondano ai parametri delle condizioni e della strumentazione LC-MS per identificare, raggruppare e verificare con precisione i picchi m/z che rappresentano i singoli muropeptidi. Dal cromatogramma, esaminare la deriva del tempo di ritenzione e la variazione di m/z di picchi simili noti per impostare i parametri iniziali del filtro.
      NOTA: l'estrazione ricorsiva delle caratteristiche utilizza un algoritmo iniziale di estrazione delle caratteristiche molecolari non mirate per identificare e allineare le caratteristiche del cromatogramma (picchi m/z ) su tutti i file di dati. Una volta create, queste funzionalità vengono utilizzate per rivalutare i file di dati originali (ricorsivi) con un algoritmo di estrazione delle caratteristiche molecolari mirato per migliorare l'affidabilità e l'accuratezza delle caratteristiche identificate. È consigliabile impostare l'estrazione iniziale non mirata con una finestra di rilevamento ristretta e utilizzare parametri di rilevamento più ampi per l'estrazione ricorsiva per identificare i picchi in tutti i file di dati che potrebbero mancare nell'estrazione iniziale. Il completamento dell'esecuzione dell'estrazione ricorsiva delle funzionalità può richiedere ore a seconda del numero di campioni, della complessità dei dati e dell'hardware del computer presente
    4. Esaminare i risultati dell'estrazione delle feature. Se un numero significativo di feature non è stato allineato in un gruppo, modificare i parametri di filtro ricorsivo per ampliare/limitare la finestra di rilevamento in base alle esigenze. A tale scopo, ispezionare il cromatogramma e il profilo isotopico di ciascuna caratteristica estratta per garantire che il rilevamento delle caratteristiche sia stato eseguito in modo simile in tutti i file di dati. Inoltre, per ogni caratteristica identificata all'interno di un file di dati, esaminare il punteggio, eventuali avvisi e se la caratteristica ha superato i parametri di filtro scelti.
      NOTA: è necessario prestare attenzione a mantenere le finestre di rilevamento sufficientemente strette da non raggruppare erroneamente feature distinte. Questo è spesso notato da profili isotopici disparati tra i file di dati o significative variazioni m/z / tempo di conservazione. Al contrario, se ci sono più caratteristiche con tempi di ritenzione e m /z simili, è possibile che i parametri del filtro fossero troppo rigorosi, con conseguente suddivisione di un picco MS in due caratteristiche. Pertanto, eseguire nuovamente l'estrazione delle feature (sezione 3.1.3) con parametri di filtro del tempo di conservazione regolati per consentire un migliore raggruppamento di queste caratteristiche. La visualizzazione dei picchi di abbondanza più bassi indicherà se i filtri utilizzati (sezione 3.1.3) hanno identificato con precisione i picchi al di sopra del rumore di fondo. Se i picchi di abbondanza più bassi sono simili allo sfondo, eseguire nuovamente l'estrazione della feature con nuovi parametri del filtro di sfondo.
    5. Esportare i dati come file di scambio composto (.cef) (un formato compatibile con il programma software statistico) o un file separato da colonne (.csv) che contiene la massa, il tempo di conservazione e l'abbondanza di ogni caratteristica per ogni campione.
  2. Analisi differenziale delle caratteristiche spettrali
    NOTA: l'analisi differenziale è stata eseguita utilizzando software disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali). Possono essere utilizzati altri software bioinformatici.
    1. Apri il programma e quando richiesto inizia un nuovo progetto.
    2. Seguire le istruzioni per l'importazione e l'analisi dei dati. Durante l'importazione dei dati, caricate i file estratti (sezione 3.1). Durante l'analisi dei dati, scegliere la significatività e la modifica della piega per l'analisi differenziale e selezionare i dati di base per l'intensità mediana in tutti i file di dati. Non impostare alcun filtro dati (se questa operazione è stata eseguita nella precedente fase di elaborazione degli spettri (sezione 3.1)) poiché l'applicazione di nuovi filtri annullerebbe l'estrazione robusta della feature ricorsiva. Tuttavia, analogamente all'estrazione delle caratteristiche, l'analisi differenziale deve essere allineata in base alla massa (m/z) e al tempo di ritenzione dovuto alla deriva nella raccolta dei dati LC-MS. Utilizzare i parametri determinati nell'estrazione delle feature (sezione 3.1).
      NOTA: Normalizzare tra file di dati utilizzando la quantificazione del muropeptide (sezione 1.3) per garantire che le variazioni siano dovute a parametri sperimentali e non a variazioni nella purificazione dei sacculi (punto 1.2). Utilizzare l'opzione scaler esterno per regolare ogni file di dati per le differenze nella concentrazione di MurNAc del campione.
    3. Una volta completata l'analisi, esaminare le analisi grafiche e statistiche risultanti per identificare i muropeptidi che dimostrano un cambiamento significativo dell'abbondanza tra le condizioni sperimentali testate.
    4. Sotto il navigatore del progetto, fate clic con il pulsante destro del mouse sulle varie analisi e scegliete un'opzione di esportazione per salvare i dettagli della feature come file di dati separati da colonne (.csv) che contiene m /z, tempo di ritenzione, valori di intensità grezzi e normalizzati, valore p, FDR e modifiche di piegatura per ciascuna feature. È necessario salvare più analisi per ottenere tutti i dati rilevanti.
    5. Esportare un secondo file .csv contenente solo i muropeptidi che hanno superato le analisi statistiche, tra cui il valore p <0,05 e il cambio di piega >2.
  3. Annotazione dell'identità del muropeptide alle caratteristiche spettrali
    NOTA: Ad ogni caratteristica identificata deve essere assegnata una struttura di muropeptide prevista basata su m/z e questa annotazione è confermata esaminando la frammentazione MS/MS. Dopo aver confermato le annotazioni, può essere necessario eseguire e perfezionare l'analisi differenziale (sezione 3.2).
    1. All'interno del software di analisi differenziale, in Interpretazione dei risultati, selezionare ID browser. Aggiungere una libreria di strutture muropeptidiche attese e selezionare parametri simili a quelli usati in precedenza (sezione 3.1.3). Ciò produrrà un'annotazione di muropeptide prevista per ogni caratteristica identificata. Una libreria di strutture muropeptidiche può essere prodotta utilizzando m /z per le strutture muropeptidiche previste e il software di database MS (vedi Tabella dei materiali). Tuttavia, una libreria di m/z di >6.000 possibili muropeptidi può essere trovata nel riferimento12.
    2. Selezionare l'annotazione del muropeptide previsto in base al punteggio corrispondente e alla rilevanza biologica del muropeptide previsto, ovvero scegliere il muropeptide più probabile da presentare nel campione biologico.
    3. Confermare manualmente l'annotazione del muropeptide prevista confrontando i picchi m/z del cromatogramma MS/MS con il m/z previsto di tutte le possibili frammentazioni di una struttura di muropeptide nota (ad esempio, Figura 4).
      1. Visualizzare i dati MS e MS/MS utilizzando un programma di visualizzazione del cromatogramma (vedere la tabella dei materiali, figura 4).
      2. Disegnare la struttura del muropeptide prevista utilizzando un editor molecolare (programma di disegno della struttura chimica) (vedi Tabella dei materiali, Figura 4, riquadro grigio). Utilizzare lo strumento di frammentazione di massa per mostrare la m/z dei frammenti MS quando ogni legame viene rotto singolarmente o in combinazione.
        NOTA: A seconda dell'energia di frammentazione utilizzata per MS/MS, la frammentazione può avvenire in qualsiasi legame nella struttura del muropeptide. Tuttavia, alcuni legami sono più facilmente / frequentemente frammentati a livelli di energia più bassi. Ad esempio, la frammentazione nella catena laterale del peptide si verifica più spesso nel legame ammidico tra gli amminoacidi. Durante la valutazione della frammentazione, è importante notare che i residui di GlcNAc sono molto facilmente frammentati dal muropeptide. Pertanto, la frammentazione della struttura del muropeptide nota deve essere valutata con e senza GlcNAc. A causa della frammentazione in-source del GlcNAc, diverse caratteristiche estratte nell'elaborazione spettrale (sezione 3.1) possono rappresentare una singola struttura muropeptidica. Se trovate, queste caratteristiche dovrebbero essere unite e l'analisi differenziale rivalutata.
      3. Confrontare tutte le possibili frammentazioni della struttura del muropeptide che è stata determinata (sezione 3.3.3.2) con il cromatogramma MS/MS (sezione 3.3.3.1). Per confermare l'annotazione del muropeptide, i picchi m /z di più frammenti dovrebbero essere trovati nel cromatogramma MS/MS con una finestra di allineamento m /z molto minima (Figura 4).
      4. Al fine di chiarire l'identità del muropeptide in caso di frammentazione ambigua MS/MS, ripetere le sezioni da 2.2.2 a 2.2.3 con campioni (sezione 2.1.9) per un'ulteriore acquisizione di dati MS/MS che incorpora un elenco precursore preferito di m/z e tempo di ritenzione con energie di collisione di frammentazione MS/MS aggiuntive.
    4. Per le entità co-eluenti che sono state annotate come lo stesso muropeptide, eseguire nuovamente l'analisi differenziale (sezione 3.2.2) e unire le caratteristiche estratte.
  4. Valutazione dei cambiamenti globali nelle modificazioni del muropeptide
    1. Modificare il file .csv (sezione 3.2.4) dei muropeptidi statisticamente significativi ad alto cambiamento di piega per includere una singola colonna per ogni modifica del muropeptide. Popolare questa colonna con una designazione per ogni muropeptide annotato (sezione 3.3) (ad esempio, GlcNAc acetilato rispetto a GlcNAc o MurNAc de-N-acetilato).
    2. Carica il file .csv modificato in Perseus22,23. Importare i valori di intensità normalizzati nella casella Importazione principale e importare la designazione di modifica nella casella Importazione categoriale.
    3. In Annota righe, fare clic su Categoricamente annota righe e aggiungere file di dati a ciascun parametro sperimentale.
    4. In test, fai clic su due test di esempio per eseguire il test t di uno studente (valore p < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
    5. Fare clic su 1D per eseguire l'annotazione 1D22,23. Un'annotazione 1D FDR < 0,05 indica un cambiamento significativo dell'abbondanza per la modifica del muropeptide tra i parametri sperimentali testati. Impostando il valore di soglia (s0) = 1 verranno visualizzati i punteggi FDR dell'annotazione 1D per tutti i muropeptidi.
    6. All'interno di un software grafico (vedi Tabella dei materiali), produrre una mappa termica del cambiamento di piega dell'abbondanza per ogni modifica del muropeptide e mostrare il punteggio di annotazione 1D per dimostrare la significatività (Figura 5B). Il cambiamento di piega di ogni modifica del muropeptide può essere prodotto in Microsoft Excel utilizzando le intensità grezze di tutti i singoli muropeptidi che contengono la modifica.

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Representative Results

La maggiore sensibilità di rilevamento dei macchinari MS unita al potente software di riconoscimento dei picchi ha migliorato la capacità di isolare, monitorare e analizzare le composizioni di sostanze di campioni complessi con dettagli molto minuti. Utilizzando questi progressi tecnologici, recenti studi sulla composizione del peptidoglicano hanno iniziato a utilizzare tecniche automatizzate di estrazione delle caratteristiche LC-MS 12,13,14,24 rispetto alla vecchia metodologia basata su HPLC 11,25,26,27,28,29,30,31 . Sebbene siano disponibili numerosi pacchetti software generici per l'estrazione di caratteristiche, il software commerciale che utilizza l'estrazione ricorsiva delle caratteristiche è rapido e altamente robusto identificando e combinando automaticamente tutte le cariche, gli isotopi e le versioni adduttrici di ciascun muropeptide trovato all'interno del set di dati LC-MS (Figura 3). Inoltre, i tempi di conservazione iniziali, i modelli m/z e isotopici delle feature estratte vengono utilizzati per rivalutare (ricorsivamente) il set di dati per garantire un'identificazione accurata di ciascuna caratteristica in tutti i file di dati. Pertanto, l'algoritmo ricorsivo aiuta a convalidare e aumentare la fiducia nell'identificazione dei picchi. La maggior parte dei programmi generici di estrazione delle caratteristiche non raggruppano cariche/isotopi, ecc. e lo richiederà come passaggio manuale aggiuntivo. Inoltre, i programmi generici saranno meno robusti in quanto le funzionalità vengono estratte separatamente all'interno di ciascun file di dati e non come un intero set di dati, che fa parte dell'algoritmo ricorsivo.

Il protocollo peptidoglicomico qui presentato è stato recentemente utilizzato per esaminare i cambiamenti compositivi del PG tra due condizioni fisiologiche di crescita, vale a dire, il biofilm planctonico a nuoto libero e il biofilm comunitario stazionario12. Utilizzando un QTOF MS altamente sensibile accoppiato con l'estrazione di caratteristiche ricorsive, sono stati riconosciuti e monitorati 160 muropeptidi distinti. Ciò rappresentava otto volte il numero di muropeptidi identificati in questo organismo in precedenza 29,32 e più del doppio dei muropeptidi identificati utilizzando altre metodologie in altri organismi10,14,24.

L'associazione di ogni picco m/z estratto dai dati MS con un particolare muropeptide è facilitata dal riferimento incrociato con un database di strutture muropeptidiche note e previste. Il cromatogramma MS/MS di frammentazione (Figura 4) per ogni caratteristica estratta viene confrontato con il profilo di frammentazione (Figura 4, inserto grigio) del muropeptide proposto utilizzando il database.

I dati peptidoglicomici possono essere visualizzati in diversi modi a seconda della configurazione sperimentale e delle domande poste. Tale analisi grafica può includere l'analisi delle componenti principali (PCA), i grafici a dispersione, i grafici vulcanici, le mappe di calore e l'analisi del clustering gerarchico. Ad esempio, i grafici dei vulcani evidenziano muropeptidi che dimostrano un'elevata entità statisticamente significativa di variazione dell'abbondanza tra le condizioni testate (Figura 5A). Questi muropeptidi selezionati che rappresentano cambiamenti significativi di abbondanza tra le condizioni testate possono essere ulteriormente esaminati per le modifiche del muropeptide. Queste modifiche possono includere la presenza di sostituzioni aminoacidiche, cambiamenti di acetilazione o la presenza di attività amidasi. Se esaminati insieme, più muropeptidi che possiedono la stessa modifica possono essere esaminati per una tendenza verso una condizione sperimentale (Figura 5A - punti evidenziati in verde) e l'intero gruppo valutato per la significatività (Figura 5B). Tracciare una modifica del muropeptide in questo modo, può indicare una particolare attività enzimatica che è influenzata dal parametro sperimentale. Inoltre, i valori anomali di questa tendenza possono indicare attività enzimatica con una particolare specificità o funzione biologica (Figura 5A - punti evidenziati in arancione).

Figure 1
Figura 1: Esempio di una tipica struttura peptidoglicana Gram-negativa. (A) Nei batteri Gram-negativi, il peptidoglicano si trova nel periplasma tra le membrane interne ed esterne. (B) Un singolo muropeptide è costituito da una N-acetil glucosamina legata al β-1,4 (GlcNAc) (blu) e da un acido N-acetil muramico (MurNAc) (viola) con una catena laterale peptidica aggiunta (arancione). La catena laterale del peptide può essere reticolata alla catena laterale del muropeptide adiacente producendo il peptidoglicano maturo simile a una maglia (A). La purificazione comporta l'isolamento del peptidoglicano dall'intera cellula come un sacculus in cui tutto il resto del materiale cellulare è stato strappato via. (C) Micrografia elettronica a trasmissione di un peptidoglicano sacculi. In confronto, il PG Gram-positivo può consistere in una gamma maggiore di variazioni nella struttura e fa parte della classificazione tassonomica Gram-positiva33. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Flusso di lavoro di Peptidoglycomics. Preparazione del campione. Fase 1, coltivare e pellettare cellule batteriche (paragrafo 1.1). Fase 2, purificare il peptidoglicano sacculi con l'ebollizione SDS al 4% (paragrafo 1.2). Acquisizione dati. Fase 3, digestione enzimatica dei sacculi per produrre muropeptidi mediante rottura del legame β-1,4 tra la N-acetilglucosamina (GlcNAc) e l'acido N-acetilmuramico (MurNAc) della spina dorsale del peptidoglicano (paragrafo 2.1). Fase 4, analisi dell'intensità del muropeptide attraverso LC-MS/MS (paragrafo 2.2). Analisi dei dati. Fase 5, l'estrazione ricorsiva delle caratteristiche identifica e raccoglie tutte le cariche, gli addotti e gli isotopi associati a un singolo muropeptide (sezione 3.1). Fase 6, identificazione dei muropeptidi confrontando la frammentazione prevista con i cromatogrammi MS/MS (paragrafo 3.3). Fase 7, analisi differenziale bioinformatica (sezione 3.2) confrontando i cambiamenti della composizione del peptidoglicano tra diversi parametri sperimentali. Fase 8, esaminare il cambiamento globale nelle modifiche del muropeptide all'interno dei diversi parametri sperimentali utilizzando l'annotazione 1D (sezione 3.4). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Esempio di estrazione ricorsiva di feature. Per un muropeptide che rappresenta una catena laterale peptidica di alanina (A), iso-ᴅ-glutammato (E), acido meso-diaminopimelico (m), alanina (A) reticolato all'AE m A della catena laterale del muropeptide adiacente (1864,8 m/z). Inclusi nella caratteristica estratta per 1864,8 m/z sono cariche (+1, +2 e +3), addotti (ad esempio, sodio e potassio), perdita di GlcNAc (1 o 2 GlcNAc) e picchi isotopici multipli per ogni variazione (ad esempio, infisso ingrandito). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Frammentazione e identificazione del muropeptide. Per l'annotazione, ad ogni picco m/z (caratteristica) estratto dal cromatogramma MS viene data una struttura muropeptidica proposta basata sulla somiglianza con una libreria di muropeptidi. Per confermare questa struttura proposta, i frammenti MS/MS previsti vengono generati utilizzando un programma di disegno chimico (inserto grigio). Questa frammentazione prevista viene confrontata con il cromatogramma MS/MS. Quando i frammenti previsti (inserto grigio) corrispondono al cromatogramma MS/MS, la struttura del muropeptide proposta è confermata. La cifra è stata modificata rispetto al riferimento12. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Analisi differenziale della composizione del peptidoglicano. (A) Grafico del vulcano del cambiamento di piega e significato statistico dei cambiamenti nell'intensità del muropeptide tra peptidoglicano purificato da P. aeruginosa coltivato come coltura planctonica a nuoto libero o biofilm stazionario. Vengono evidenziati tutti i muropeptidi che hanno una modifica che ha rappresentato un cambiamento nella tipica disposizione degli amminoacidi all'interno della catena laterale del peptide. I muropeptidi sostituiti da aminoacidi che hanno mostrato una tendenza alla diminuzione dell'abbondanza nel peptidoglicano derivato dal biofilm sono evidenziati in verde. Gli aminoacidi hanno sostituito i muropeptidi che erano valori anomali di questa tendenza e hanno mostrato una maggiore abbondanza di peptidoglicano derivato dal biofilm sono evidenziati in arancione. (B) Mappa termica della variazione globale della piega in abbondanza di tutti i muropeptidi sostituiti da amminoacidi con aumento dell'abbondanza (arancione) e diminuzione dell'abbondanza (verde) nei biofilm. Questi muropeptidi sono stati raggruppati e valutati per verificare se la sostituzione aminoacidica si è verificata su monomeri, dimeri reticolati o se il quarto (AE m+), il quinto (AE m A +) o entrambi gli amminoacidi (AEm++) sono stati sostituiti. Il significato di ciascun gruppo di muropeptidi è stato valutato mediante annotazione 1D con FDR < 0,05 per la significatività e viene visualizzato il punteggio 1D associato. L'annotazione 1D può essere eseguita solo su più di 2 muropeptidi (ad esempio, la sostituzione AEm++ è stata trovata solo su due muropeptidi). Pertanto, in questo caso, la significatività deve essere esaminata per i singoli muropeptidi e non sul gruppo. La cifra è stata modificata rispetto al riferimento12. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo descrive un metodo per purificare il peptidoglicano da colture batteriche, processo per il rilevamento di LC-MS e analizzare la composizione utilizzando tecniche bioinformatiche. Qui, ci concentriamo sui batteri Gram-negativi e sarà necessaria qualche leggera modifica per consentire l'analisi dei batteri Gram-positivi.

La preparazione dei muropeptidi è rimasta praticamente la stessa da quando è stata prodotta per la prima volta nel 1960 9,11,15. Una volta purificati, i sacculi (paragrafo 1.2.18) vengono digeriti in singoli muropeptidi utilizzando l'enzima muramidesi mutanolysin da Streptomyces globisporus. La mutanolisina digerisce la struttura del PG rompendo il legame β-1,4-glicosidico rilasciando singoli muropeptidi costituiti da un disaccaride GlcNAc-MurNAc con catena laterale peptidica aggiunta e include eventuali modifiche o legami incrociati (Figura 1).

Una limitazione della precedente metodologia utilizzata per studiare la composizione della PG è stata l'identificazione manuale dispendiosa in termini di tempo dei muropeptidi. A causa della complessità e della difficoltà, addotti, cariche e/o isotopi possono o non possono essere stati inclusi nell'analisi. Inoltre, la maggior parte degli studi ha limitato l'analisi ai muropeptidi più abbondanti, quindi più facili da purificare. Pertanto, a causa della natura complicata della metodologia, sono state eseguite relativamente poche analisi compositive PG dettagliate di alto livello. Le analisi di tipo "omico" hanno utilizzato recenti miglioramenti tecnologici per la produzione e l'analisi statistica di set di dati LC-MS relativamente grandi e complessi per la panoramica di alto livello dei sistemi biologici. L'applicazione di peptidoglycomics consentirà l'analisi della composizione PG in dettaglio molto fine.

All'interno di peptidoglycomics, l'estrazione ricorsiva delle feature riduce il carico di lavoro manuale e aumenta la precisione esaminando tutti i file di dati contemporaneamente. Un algoritmo di estrazione delle caratteristiche ricorsive viene utilizzato per identificare, allineare e raggruppare caratteristiche spettrali uniche (picchi m / z) su più file di dati cromatografici LC-MS rendendo automatizzata l'identificazione dei picchi m/z del muropeptide. Questo algoritmo utilizza la corrispondenza isotopica che prende i numerosi isotopi potenziali, gli addotti ionici e gli stati di carica e condensa i picchi multipli m / z nel suo singolo composto rappresentativo (o caratteristica), che in questo caso rappresenterebbe un singolo muropeptide (Figura 3). La verifica del gruppo di feature spettrali viene eseguita confrontando il tempo di ritenzione, m/z e la corrispondenza del pattern isotopico all'interno di ciascun file di dati cromatografici per garantire un'estrazione affidabile della feature nell'intero set di dati. Gli algoritmi generici di ricerca delle caratteristiche potrebbero non includere la corrispondenza degli isotopi o allineare, raggruppare o verificare i picchi m/z su più campioni e richiederanno un'ulteriore elaborazione manuale dei dati per eseguire questa estrazione delle caratteristiche.

Una volta identificate le caratteristiche, gli algoritmi di analisi differenziale bioinformatica gestiscono il set di dati molto grande nel suo complesso, consentendo così utili confronti e interpretazioni dai dati complessi. L'utilizzo di queste analisi grafiche bioinformatiche è un modo potente per visualizzare e interpretare grandi set di dati per esaminare le tendenze che possono indicare processi biologici. Solo di recente queste analisi grafiche ad alta potenza sono state utilizzate per esaminare il peptidoglicano in dettaglio molto fine12. L'analisi differenziale (sezione 3.2) valuta i cambiamenti nell'abbondanza di singoli muropeptidi tra diverse condizioni sperimentali. Tuttavia, nel contesto di cellule batteriche intere, l'attività degli enzimi modificanti PG potrebbe portare a più strutture muropeptidiche distinte a seconda della specificità dell'attività catalitica (cioè, l'aggiunta di un gruppo acetilico sul disaccaride potrebbe essere con o senza una modifica della catena laterale peptidica). Pertanto, la valutazione dei cambiamenti di abbondanza globale di una particolare modifica in tutti i singoli muropeptidi annotati fornirà informazioni sull'attività enzimatica che agisce sul PG (Figura 5) Pertanto, l'analisi differenziale viene utilizzata per studiare i cambiamenti di abbondanza dei singoli muropeptidi; mentre l'annotazione 1D esamina i cambiamenti di abbondanza di una particolare modifica PG. L'analisi differenziale di accoppiamento con annotazione 1D consente di valutare la composizione di PG sia a livello di muropeptide individuale che come indicatore dell'attività enzimatica complessiva del PG.

Durante l'analisi differenziale, è importante notare che PG è composto da pochi muropeptidi altamente abbondanti e numerosi muropeptidi a bassa abbondanza12. Pertanto, la baseline è molto importante al fine di rimuovere qualsiasi pregiudizio dai muropeptidi ad alta abbondanza durante le fasi successive dell'analisi. Inoltre, a causa dei molteplici test t eseguiti, deve essere applicata una correzione statistica per ridurre i falsi positivi. L'impostazione predefinita è spesso il tasso di false scoperte (FDR) di Benjamini-Hochberg19. Sono possibili altre correzioni come il più prudente Bonferroni familywise error rate (FWER)20,21.

All'interno del software bioinformatico, al picco m/z identificato nell'estrazione delle caratteristiche viene assegnata anche una struttura prevista. Altre analisi di tipo "omico" (ad esempio, proteomica) beneficiano della disponibilità di grandi database di composti, che consentono l'identificazione dei composti attraverso la corrispondenza predittiva degli spettri di frammentazione. Attualmente, non esiste una libreria di frammentazione prevista dal muropeptide e la conferma dell'identificazione del muropeptide rimane un passaggio manuale. Tuttavia, man mano che le banche dati di frammentazione peptidoglicica si sviluppano e diventano disponibili al pubblico, questa fase di identificazione manuale diventerà più automatizzata e accessibile eliminando o riducendo notevolmente le sezioni 3.3.3 e 3.3.4.

In Escherichia coli , PG è costituito da ~3,5 x 106 muropeptidi per cellula34. Entro i limiti di rilevazione del QTOF MS, anche i muropeptidi abbondanti più bassi possono ancora rappresentare centinaia di copie di un singolo muropeptide all'interno di una cellula12. Pertanto, comprendere i cambiamenti anche dei muropeptidi abbondanti più bassi può fornire informazioni utili sull'attività biologica degli enzimi mirati al PG all'interno della cellula.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Jennifer Geddes-McAlister e il dottor Anthony Clarke per il loro contributo nel perfezionamento di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni operative del CIHR assegnate a C.M.K (PJT 156111) e da un NSERC Alexander Graham Bell CGS D assegnato a E.M.A. Le figure sono state create su BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) Agilent LC-MS data acquisition
Heating mantle controller, Optichem Fisher 50-401-788 for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL Hemispherical Fisher CG1000008 for 4% SDS boil
Incubator, 37°C for sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40, Fisher CG121805 for 4% SDS boil
Lyophilizer Labconco for lyophilization of sacculi
Magentic stirrer Fisher 90-691-18 for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 Aglient LC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm Fisher 50-197-9573 cleanup of sample before MS injection
Retort stand Fisher 12-000-102 for 4% SDS boil
Retort clamp Fisher S02629 for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrex Fisher 07-250-084 for 4% SDS boil
Sonicator model 120 Fisher FB120 for sacculi purification
Sonicator - micro tip Fisher FB4422 for sacculi purification
Ultracentrifuge Beckman sacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45 Fisher NC9691797 sacculi wash steps
Water supply City for water cooled condenser
Software
Chemdraw Cambridgesoft molecular editor for muropeptide fragmentation prediction
Excel Microsoft viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter Acquisition Aglient running QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professional Aglient bioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager Aglient muropeptide m/z MS database
MassHunter Profinder Aglient recursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysis Aglient viewing MS and MS/MS chromatograms
Prism Graphpad Graphing software
Perseus Max Plank Institute of Biochemistry 1D annotation
Material
Acetonitrile Fisher A998-4
Ammonium acetate Fisher A637
Amylase Sigma-Aldrich A6380
Boric acid Fisher BP168-1
DNase Fisher EN0521
Formic acid Sigma-Aldrich 27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321 Agilent G1969-85000
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 Sigma-Aldrich M9901
Nitrogen gas (>99% purity) Praxair NI 5.0UH-T
Phosphoric acid Fisher A242
Pronase E from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
RNase Fisher EN0531
Sodium azide Fisher S0489
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166
Sodium hydroxide Fisher S318
Sodium Phosphate (dibasic) Fisher S373
Sodium Phosphate (monobasic) Fisher S369
Stains-all Sigma-Aldrich E9379

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Retraction Numero 164 peptidoglicano muropeptidi spettrometria di massa estrazione di caratteristiche analisi differenziale bioinformatica peptidoglycomics
Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica
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Anderson, E. M., Greenwood, N. A.,… More

Anderson, E. M., Greenwood, N. A., Brewer, D., Khursigara, C. M. Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics. J. Vis. Exp. (164), e61799, doi:10.3791/61799 (2020).

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