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Biochemistry

तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री और जैव सूचना विज्ञान द्वारा पेप्टिडोग्लाइकन का अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण

Published: October 13, 2020 doi: 10.3791/61799
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

Summary

इस प्रोटोकॉल में उन्नत सुविधा निष्कर्षण और जैव सूचना विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके पेप्टिडोग्लाइकन संरचना का विस्तृत विश्लेषण शामिल है।

Abstract

पेप्टिडोग्लाइकन जीवाणु कोशिका की दीवारों का एक महत्वपूर्ण घटक है और रोगाणुरोधी के लिए एक सामान्य सेलुलर लक्ष्य है। यद्यपि पेप्टिडोग्लाइकन संरचना के पहलुओं को सभी बैक्टीरिया में काफी संरक्षित किया जाता है, लेकिन ग्राम-पॉजिटिव / नकारात्मक और प्रजातियों के बीच भी काफी भिन्नता है। इसके अलावा, पेप्टिडोग्लाइकन के लिए कई ज्ञात विविधताएं, संशोधन या अनुकूलन हैं जो विकास चरण और / या पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में एक जीवाणु प्रजाति के भीतर हो सकते हैं। ये विविधताएं एक अत्यधिक गतिशील संरचना का उत्पादन करती हैं जो विकास / विभाजन, एंटीबायोटिक प्रतिरोध और मेजबान रक्षा परिहार सहित कई सेलुलर कार्यों में भाग लेने के लिए जानी जाती हैं। पेप्टिडोग्लाइकन के भीतर भिन्नता को समझने के लिए, समग्र संरचना को इसके संवैधानिक भागों (जिसे मुरोपेप्टाइड्स के रूप में जाना जाता है) में विभाजित किया जाना चाहिए और समग्र सेलुलर संरचना के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए। पेप्टिडोग्लाइकेमिक्स उन्नत मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग उच्च शक्ति वाले जैव सूचना विज्ञान डेटा विश्लेषण के साथ संयुक्त रूप से करता है ताकि पेप्टिडोग्लाइकन संरचना की बारीक विस्तार से जांच की जा सके। निम्नलिखित प्रोटोकॉल बैक्टीरियल संस्कृतियों से पेप्टिडोग्लाइकन के शुद्धिकरण, तरल क्रोमैटोग्राफ-मास स्पेक्ट्रोमीटर के माध्यम से मुरोपेप्टाइड तीव्रता डेटा का अधिग्रहण, और जैव सूचना विज्ञान का उपयोग करके पेप्टिडोग्लाइकन संरचना के अंतर विश्लेषण का वर्णन करता है।

Introduction

पेप्टिडोग्लाइकन (पीजी) बैक्टीरिया की एक परिभाषित विशेषता है जो प्रोटीन और अन्य सेलुलर घटकोंके लिए संरचनात्मक सहायता प्रदान करते हुए सेल आकृति विज्ञान को बनाए रखने का कार्य करता है। पीजी की रीढ़ वैकल्पिक β -1,4-लिंक्ड एन-एसिटाइल मुरमिक एसिड (एमयूआरएनएसी) और एन-एसिटाइल ग्लूकोसामाइन (जीएलसीएनएसी) 1,2 से बना है। प्रत्येक MurNAC में एक छोटा पेप्टाइड होता है जो '-लैक्टिल अवशेषों' पर बंधा होता है जिसे आसन्न डिसैकराइड-लिंक्ड पेप्टाइड्स (चित्रा 1ए, बी) से क्रॉसलिंक किया जा सकता है। यह क्रॉसलिंकिंग एक जाल जैसी संरचना पैदा करता है जो पूरे सेल को शामिल करता है और इसे अक्सर सैकुलस (चित्रा 1 सी) के रूप में जाना जाता है। पीजी संश्लेषण के दौरान, अग्रदूत साइटोप्लाज्म में उत्पन्न होते हैं, और फ्लिपपेस द्वारा साइटोप्लाज्मिक झिल्ली में ले जाया जाता है। अग्रदूतों को बाद में ट्रांसग्लाइकोसिलेज और ट्रांसपेप्टिडेस एंजाइमों द्वारा परिपक्व पीजी में शामिल किया जाता है,जो क्रमशः ग्लाइकोसिडिक और पेप्टाइड बॉन्ड का उत्पादन करते हैं। हालांकि, एक बार इकट्ठा होने के बाद, बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित कई एंजाइम होते हैं जो विकास और विभाजन सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए पीजी को संशोधित और / या नीचा दिखाते हैं। इसके अलावा, पीजी के विभिन्न संशोधनों को तनाव, विकास की स्थिति और पर्यावरणीय तनाव के लिए विशिष्ट अनुकूलन प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, जिसे सेल सिग्नलिंग, रोगाणुरोधी प्रतिरोध और मेजबान प्रतिरक्षा चोरी4 में फंसाया गया है। उदाहरण के लिए, एक सामान्य संशोधन MurNAC पर एक C6 एसिटाइल समूह को जोड़ना है जो ग्लाइकन β -1,4 लिंकेज को मेजबान-उत्पादित लाइसोजाइम एंजाइमों तक पहुंच को सीमित करके प्रतिरोध प्रदान करता है जो पीजी 4,5,6 को नीचा दिखाते हैं। एंटरोकोकी में, पेप्टाइड साइडचेन के टर्मिनल -अला का प्रतिस्थापन -लैक के साथ रोगाणुरोधी, वैनकोमाइसिन 7,8 के लिए अधिक प्रतिरोध प्रदान करता है।

पीजी अलगाव और शुद्धिकरण के लिए सामान्य प्रक्रिया अपेक्षाकृत अपरिवर्तित रही है क्योंकि इसे 1960के दशक में वर्णित किया गया था। बैक्टीरियल झिल्ली को एसडीएस के साथ गर्मी उपचार के माध्यम से भंग कर दिया जाता है, इसके बाद बाध्य प्रोटीन, ग्लाइकोलिपिड्स और शेष डीएनए के एंजाइमैटिक हटाने के बाद। शुद्ध बरकरार सकुलस को बाद में जीएलसीएनएसी और एमयूआरएनएसी के बीच β -1,4 लिंकेज के हाइड्रोलिसिस द्वारा व्यक्तिगत घटकों में पचाया जा सकता है। यह पाचन किसी भी संरचनात्मक संशोधनों और / या क्रॉसलिंक के साथ GlcNac-MurNAC डिसैकराइड्स का उत्पादन करता है और इसे मुरोपेप्टाइड्स (चित्रा 1 बी) कहा जाता है।

पीजी का रचनात्मक विश्लेषण शुरू में प्रत्येक मुरोपेप्टाइड को शुद्ध करने के लिए उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण (एचपीएलसी) के माध्यम से आयोजित किया गया था, जिसके बाद मुरोपेप्टाइड्स10,11 की मैन्युअल पहचान की गई थी। तब से इसे तरल क्रोमैटोग्राफी टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है, जो पहचान संवेदनशीलता को बढ़ाता है और प्रत्येक व्यक्ति के मुरोपेप्टाइड को शुद्ध करने के मैनुअल वर्कलोड को कम करता है। हालांकि, मुरोपेप्टाइड्स की मैनुअल पहचान की समय लेने वाली और जटिल प्रकृति एक सीमित कारक बनी हुई है, जिससे किए गए अध्ययनों की संख्या कम हो गई है। हाल के वर्षों में "ओमिक" प्रौद्योगिकियों के उद्भव के साथ, स्वचालित एलसी-एमएस सुविधा निष्कर्षण एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है, जो बहुत बड़े डेटासेट से जटिल नमूनों में व्यक्तिगत यौगिकों का तेजी से पता लगाने और पहचान करने की अनुमति देता है। एक बार सुविधाओं की पहचान हो जाने के बाद, जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर सांख्यिकीय रूप से जटिल डेटासेट के बीच न्यूनतम अंतर को अलग करने और उन्हें उपयोगकर्ता को ग्राफिक रूप से प्रदर्शित करने वाले अंतर विश्लेषण का उपयोग करके नमूनों के बीच भिन्नता की तुलना करता है। पीजी संरचना के विश्लेषण के लिए फीचर निष्कर्षण सॉफ्टवेयर का अनुप्रयोग केवल12,13,14 का पता लगाया जाना शुरू हुआ है और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण12 के साथ युग्मित है। प्रोटिओमिक विश्लेषण के विपरीत जो आसानी से उपलब्ध प्रोटीन डेटाबेस से लाभान्वित होता है जो पेप्टाइड विखंडन की भविष्यवाणी करता है जो पूरी तरह से स्वचालित पहचान की अनुमति देता है, वर्तमान में पेप्टिडोग्लाइकोमिक्स के लिए कोई विखंडन पुस्तकालय मौजूद नहीं है। हालांकि, फीचर निष्कर्षण को मुरोपेप्टाइड पहचान12 की भविष्यवाणी करने के लिए ज्ञात और अनुमानित संरचनात्मक डेटाबेस के साथ जोड़ा जा सकता है। यहां हम पीजी संरचना के स्वचालित पहचान और जैव सूचना त्मक अंतर विश्लेषण के लिए एक मुरोपेप्टाइड लाइब्रेरी के साथ संयुक्त एलसी-एमएस-आधारित फीचर निष्कर्षण के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं (चित्रा 2)।

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Protocol

1. पेप्टिडोग्लाइकन नमूना तैयारी

  1. बैक्टीरियल संस्कृतियों का विकास
    नोट: बैक्टीरियल संस्कृतियों की वृद्धि बैक्टीरिया प्रजातियों और जांच की जा रही विकास स्थितियों के आधार पर भिन्न होगी। परीक्षण किए जाने वाले प्रयोगात्मक पैरामीटर विकास की स्थिति को परिभाषित करेंगे।
    1. बैक्टीरियल स्ट्रेन और प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए आवश्यक विकास स्थितियों के तहत बैक्टीरिया संस्कृतियों को विकसित करें। बैक्टीरिया को तीन प्रतियों (जैविक प्रतिकृति) के रूप में विकसित करें, यानी, प्रति तनाव या विकास की स्थिति में तीन अलग-अलग कॉलोनियां।
      नोट: विकास की स्थिति और विकास चरण पीजी संरचना1,2,10 पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालने के लिए जाने जाते हैं। संस्कृतियों और प्रतिकृतियों के बीच स्थिरता बनाए रखने के लिए बहुत सावधानी बरतनी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि रचनात्मक परिवर्तन प्रयोगात्मक मापदंडों के कारण हैं, न कि प्रयोगात्मक त्रुटि के कारण।
    2. तेजी से संस्कृति को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, सेंट्रीफ्यूजेशन (11,000 x g, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा एकत्र करें और सेल गोली को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। ठंड से पहले सेल पेलेट को प्री-कूल्ड 4 डिग्री सेल्सियस, 20 एमएम सोडियम फॉस्फेट पीएच 6.5 से धोएं। जमे हुए सेल पेलेट का उत्पादन नमूनों के बीच जितनी जल्दी हो सके और लगातार किया जाना चाहिए ताकि एंजाइमों की गतिविधि को सीमित किया जा सके जो संग्रह प्रक्रिया के दौरान पीजी को संशोधित और / या नीचा दिखा सकते हैं। नमूने फ्रीजिंग के बिना निष्कर्षण प्रक्रिया (धारा 1.2) के माध्यम से सीधे संसाधित किए जा सकते हैं; हालांकि, सुनिश्चित करें कि सभी नमूने एक समान तरीके से संसाधित किए जाते हैं।
      नोट: बाद के चरणों के लिए पर्याप्त उत्पाद सुनिश्चित करने के लिए, एक महत्वपूर्ण आकार के गीले सेल गोली का उपयोग किया जाता है। यह एक बड़ी पर्याप्त सकुली गोली का उत्पादन करता है, जिसे उत्पाद के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना दोहराए जाने वाले धोने के चरणों (धारा 1.2.5 और 1.2.14) के दौरान आसानी से देखा और बनाए रखा जाता है। जीवाणु और विकास की स्थिति के आधार पर, यह उपज संभवतः भिन्न होगी। ग्राम-नकारात्मक जीवाणु स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के लिए, पीएओ 1, 0.5 ओडी600 संस्कृति के 4 एल ने 3-4 ग्राम सेल गोली का उत्पादन किया और ~ 10 मिलीग्राम शुद्ध सैकुली (खंड 1.2.17)12 का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त था। यह एलसी-एमएस (अनुभाग 2) के लिए आवश्यक की तुलना में सैकुली की एक बड़ी अधिकता है; हालांकि, यह माप सटीकता (धारा 1.2.17) और सामान्यीकरण (धारा 1.3) में सहायता करेगा।
  2. पेप्टिडोग्लाइकन सैकुली का निष्कर्षण
    नोट: पीजी के निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल रेफरी से अनुकूलित है।9,11,15. यह प्रोटोकॉल अन्य सेलुलर घटकों से मुक्त, व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं से पीजी को एक पूरे सकुली के रूप में निकाल देगा। प्रोटोकॉल का उपयोग ग्राम-नकारात्मक या ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया के साथ किया जा सकता है। हालांकि, ग्राम-पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए, मोटी पीजी संरचना को अलग करने और सेल-दीवार से जुड़े पॉलिमर को हटाने के लिए समायोजन आवश्यक हो सकता है; जैसे, तीचोइक एसिड।
    1. 20 एमएम सोडियम फॉस्फेट पीएच 6.5 की मूल संस्कृति मात्रा के लगभग 1:10 पर जमे हुए सेल छर्रों को पुन: निलंबित करें। इस चरण को 4 डिग्री सेल्सियस पर करें (बफर 11,12 के प्रति एमएल1-8 मिलीग्राम गीले सेल पेलेट वजन हो सकता है)।
      नोट: पीजी की एसिटिलीकरण स्थिति को बनाए रखने के लिए, 6.5 या उससे कम का पीएच15,16 आवश्यक है।
    2. अंतिम 1: 1 मात्रा (यानी, अंतिम एकाग्रता 4% एसडीएस है) के लिए 8% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) 20 एमएम सोडियम फॉस्फेट पीएच 6.5 उबालने के लिए सेल सस्पेंशन ड्रॉपवाइज जोड़ें, धीरे से पानी-ठंडा कंडेनसर के साथ तैयार किए गए गोल तल फ्लास्क में हिलाएं। (चित्र 2, चरण 2)
    3. पूर्ण झिल्ली पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट से 3 घंटे के लिए एक कोमल उबाल बनाए रखें। सुनिश्चित करें कि परिणामी मिश्रण पूरी तरह से स्पष्ट है जिसमें कोई शेष सेल झुरमुट या चिपचिपाहट नहीं है। पूर्ण पृथक्करण की गारंटी के लिए लंबे समय तक उबलना पसंद किया जाता है।
    4. इसे कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें। नमूना रात भर कमरे के तापमान पर छोड़ा जा सकता है।
      नोट: जब एसडीएस मौजूद होता है, तो समाधान में एसडीएस रखने के लिए कमरे के तापमान पर नमूने बनाए रखें।
    5. 25 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 70,000 x g पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से सकुली को एक गोली के रूप में इकट्ठा करें (या पूरी तरह से तलछट सैकुली के लिए आवश्यक समय)।
    6. लगातार अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (धारा 1.2.5) द्वारा सकुली को बार-बार धोएं और कमरे के तापमान के ~ 50 एमएल 20 एमएम सोडियम फॉस्फेट पीएच 6.5 में निलंबन करें जब तक कि वॉश बफर में एसडीएस एकाग्रता ~ 0.001% न हो। आमतौर पर, 5 से 7 धोने पर्याप्त होते हैं।
      नोट: वॉश बफर में शेष एसडीएस की एकाग्रता का परीक्षण करने के लिए, कलरिमेट्रिक डाई, स्टेन्स-ऑल17 का उपयोग करें।
    7. कमरे के तापमान के 5-10 एमएल 20 एमएम सोडियम फॉस्फेट पीएच 6.5 में पुन: निलंबन।
    8. झुरमुट को फैलाने के लिए कमरे के तापमान पर नमूने को संक्षेप में (~ 40%, 50 डब्ल्यू, 20 किलोहर्ट्ज, 20 एस) करें।
      नोट: विस्तारित सोनिकेशन यांत्रिक रूप से पीजी संरचना18 की कतरन का कारण बनेगा।
    9. नमूने को 50 μg / mL प्रत्येक एमाइलेज, DNase और RNase, 10 mM मैग्नीशियम सल्फेट के साथ पूरक करें, और आंदोलन या न्यूट्रेशन के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाएं।
      नोट: एमाइलेज पाचन सैकुली11 के भीतर फंसे किसी भी शेष ग्लाइकोजन को हटा देता है।
    10. 100 μg / mL प्रोनेस जोड़ें और आंदोलन या अखरोट और ~ 0.02% सोडियम एज़ाइड के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाएं।
      नोट: प्रोनेस पाचन जोड़े गए एंजाइमों (खंड 1.2.9 से) को हटा देता है और लिपोप्रोटीन को हटा देता है जो पीजी से सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं।
      चेतावनी: सोडियम एज़ाइड अत्यधिक विषाक्त है और उचित उपयोग / निपटान विधियों की आवश्यकता होती है।
    11. सोडियम एज़ाइड को हटाने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट (या पूरी तरह से तलछट सैकुली के लिए आवश्यक समय) के लिए 70,000 x g पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज।
    12. गोली को 2% एसडीएस 20 एमएम सोडियम फॉस्फेट पीएच 6.5 के 25 एमएल में पुन: निलंबित करें।
    13. एक स्टीमर या गोल तल फ्लास्क में 1 घंटे के लिए पानी-ठंडा कंडेनसर (खंड 1.2.2) के साथ उबालें।
      नोट: दूसरा एसडीएस उबलता कदम सैकुली से सभी शेष प्रोटीन और दूषित पदार्थों को हटा देता है।
    14. ~ 50 एमएल कमरे के तापमान डबल डिस्टिल्ड वाटर (डीडीएच 2 ओ) के साथ सैकुली वॉश (खंड1.2.6) को तब तक दोहराएं जब तक कि एसडीएस एकाग्रता ~ 0.001% न हो।
    15. सकुली को निलंबित करने के लिए डीडीएच2ओ की पर्याप्त मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें, साथ ही कंटेनर (जैसे, 25 एमएल) को धोएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रीज करें। मात्रा भिन्न हो सकती है क्योंकि नमूना अगले चरण में लियोफिलाइज्ड हो जाएगा, हालांकि, छोटे वॉल्यूम को लियोफिलाइज़ करने के लिए कम समय की आवश्यकता होती है।
    16. अगले दिन, निलंबन को लियोफिलाइज़ करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    17. विश्लेषणात्मक संतुलन पर प्राप्त लियोफिलाइज्ड सैकुली की मात्रा को मापें।
    18. डीडीएच2ओ से 10 मिलीग्राम / एमएल में सकुली को पतला करें और आगे के विश्लेषण से पहले झुरमुट को तोड़ने के लिए संक्षेप में सोनिकेट करें।
  3. शुद्ध पेप्टिडोग्लाइकन का परिमाणीकरण
    1. खंड 1.2.18 से शुद्ध सकुली की मात्रा निर्धारित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अंतर विश्लेषण (धारा 3.2) के दौरान द्रव्यमान स्पेक डेटा बराबर हो। संदर्भ15 में उल्लिखित विस्तृत पद्धति का पालन करें।
      नोट: शुद्ध सकुली (खंड 1.2.18) एसिड हाइड्रोलिसिस द्वारा व्यक्तिगत चीनी और अमीनो एसिड घटकों में विभाजित होते हैं। स्पंदित-एम्पीरोमेट्रिक डिटेक्शन का उपयोग करके आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग-अलग घटकों को अलग और परिमाणित किया जाता है। पीजी (चित्रा 1) की संरचना को देखते हुए, व्यक्तिगत मुरोपेप्टाइड्स एक एकल एमयूआरएनएसी और एक एकल जीएलसीएनएसी अवशेषों से बने होते हैं। इसलिए, या तो अवशेषों की एकाग्रता को निर्धारित करना नमूने के भीतर मुरोपेप्टाइड्स 1: 1 की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है। क्रोमैटोग्राफी16 के दौरान अन्य पीजी घटकों से स्वच्छ शिखर पृथक्करण के कारण एमयूआरएनएसी को पसंद किया जाता है।

2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण

  1. मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए मुरोपेप्टाइड्स की तैयारी
    1. 100 μl प्रतिक्रिया में 100 mM अमोनियम एसीटेट pH 5.5, और 50 mM मैग्नीशियम क्लोराइड के साथ शुद्ध सकुली के 800 μg पूरक।
    2. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाएं।
    3. 1: 1 वॉल्यूम 0.5 एम बोरेट बफर पीएच 9.0 जोड़ें और ~ 10 मिलीग्राम / एमएल सोडियम बोरोहाइड्राइड (एनएबीएच4) के साथ पूरक करें।
      नोट: α और β एनोमेरिक रूपों के बीच चक्रीय शर्करा का उत्परिवर्तन मुरोपेप्टाइड्स के तरल क्रोमैटोग्राफी पृथक्करण के दौरान कई चरम संरचनाओं का कारण बनेगा। एनएबीएच 4 के साथ उपचारमुरनाक को मुरामिटोल11 में कम करके दो रूपों के बीच अंतर-रूपांतरण को समाप्त करता है। उपचार 1,6-एनहाइड्रो मुर्नाक या 1,4-लिंक्ड चीनी अवशेषों को कम नहीं करता है।
      सावधानी: एनएबीएच4 की प्रतिक्रिया हाइड्रोजन गैस की थोड़ी मात्रा का उत्पादन करती है। एनएबीएच4 प्रतिक्रिया बुलबुले पैदा करेगी और गैस को भागने की अनुमति देने के लिए माइक्रोफ्यूज ट्यूबों को खुला रखा जाना चाहिए।
    4. ~ 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने को इनक्यूबेट करें।
    5. माइक्रोफ्यूज ट्यूब में नमूने को व्यवस्थित करने और बुलबुले को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूज संक्षेप में।
    6. 1: 5 फॉस्फोरिक एसिड का उपयोग करके पीएच को <4.0 में समायोजित करें, जिसे 5 μL वृद्धि में जोड़ा गया है। लिटमस पीएच परीक्षण स्ट्रिप्स का उपयोग करके पीएच का परीक्षण करें।
    7. किसी भी शेष अघुलनशील सामग्री को तलछट करने के लिए 1 मिनट के लिए ~ 17,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    8. 0.2 μm माइक्रोसेंट्रीफ्यूज फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें।
    9. नमूने एलसी-एमएस में इंजेक्शन से पहले 30,000 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किए जाते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि किसी भी कण को एमएस में इंजेक्ट नहीं किया गया है।
  2. LC-MS का सेटअप
    1. न्यूनतम चार दशमलव बिंदु एम / जेड डिटेक्शन सटीकता के साथ क्वाड्रोपोल-टाइम ऑफ फ्लाइट (क्यूटीओएफ) मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए एक सी 18 सतही रूप से छिद्रपूर्ण कण स्तंभ (100 मिमी x 2.1 मिमी, छिद्र आकार <3 μm) संलग्न करें।
    2. मुरोपेप्टाइड्स के तरल क्रोमैटोग्राफी पृथक्करण का प्रदर्शन करें
      नोट: प्रत्येक जैविक तीन प्रतियों (धारा 1.1.1) को एलसी-एमएस (धारा 2.2.2 से 2.2.3) के माध्यम से तीन बार (तकनीकी तीन प्रतियों) चलाया जाना चाहिए। इसलिए, प्रत्येक परीक्षण की गई स्थिति में कुल नौ एलसी-एमएस डेटा फाइलें होंगी। डेटा अधिग्रहण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। हालांकि, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर एमएस मशीनरी के आधार पर चुना जाना चाहिए। निम्नलिखित इस प्रोटोकॉल को चलाने के लिए विशिष्ट मापदंडों के साथ एमएस स्थापित करने के लिए एक गाइड का प्रतिनिधित्व करता है। एक विस्तृत विवरण के लिए, कृपया निर्माता के मैनुअल को देखें।
      1. क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण के लिए, निम्नलिखित सॉल्वैंट्स 0.1% फॉर्मिक एसिड (ए) और एसिटोनिट्राइल को 0.1% फॉर्मिक एसिड (बी) के साथ तैयार करें।
      2. निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण के लिए एक विधि सेट करें।
      3. प्रवाह दर को 0.4 mL/min पर सेट करें।
      4. कॉलम को 2% बी (~ 24 कॉलम वॉल्यूम) पर 10 मिनट के लिए कंडीशन करें।
      5. एक ऑटोसैंपलर का उपयोग करके, अनुभाग 2.1.9 से नमूने के 10 μL इंजेक्ट करें।
        नोट: डेटा संग्रह शुरू करने से पहले एलसी-एमएस प्रोटोकॉल के माध्यम से एक प्रारंभिक नमूना चलाएँ। इस रन का उपयोग डेटा के लिए नहीं किया जाता है, लेकिन बाद के सभी रन के लिए अवधारण समय प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए किया जाता है। द्रव्यमान-से-आवेश अनुपात (m/z ) चोटियों की सटीक पहचान और समूहीकरण के लिए वर्णक्रमीय प्रसंस्करण (धारा 3.1) के दौरान अवधारण समय की पुनरुत्पादकता की आवश्यकता होती है।
      6. 5 मिनट (~ 12 कॉलम वॉल्यूम) के लिए 2% बी का उपयोग करके मुरोपेप्टाइड्स को अलग करें, फिर इसे 13 मिनट (~ 30 कॉलम वॉल्यूम) में 15% बी तक बढ़ाएं, इसे 10 मिनट (~ 24 कॉलम वॉल्यूम) में 50% बी तक बढ़ाएं, और अंत में इसे 2 मिनट (~ 5 कॉलम वॉल्यूम) में 98% बी तक बढ़ाएं।
        नोट: ढाल के पहले 2 मिनट और अंतिम 5 मिनट को छोड़ दें (कचरे को भेजें)।
      7. 6 मिनट (~ 14 कॉलम वॉल्यूम) और 20 मिनट (~ 47 कॉलम वॉल्यूम) के लिए 98% बी पर कॉलम वॉश के साथ समाप्त करें।
    3. मुरोपेप्टाइड्स का मास स्पेक्ट्रोमेट्री डिटेक्शन करें
      1. एमएस निर्माता के निर्देशों के बाद एलसी-एमएस संदर्भ द्रव्यमान मानकों वाले एसिटोनिट्राइल में ट्यूनिंग मिश्रण का उपयोग करके सकारात्मक मोड में द्रव्यमान अक्ष को कैलिब्रेट करें।
        नोट: एमएस क्रोमैटोग्राफिक रन (खंड 2.2.2.1) की शुरुआत से पहले ट्यून किया गया है।
      2. निम्न पैरामीटर का उपयोग कर MS डेटा अधिग्रहण के लिए एक विधि सेट करें।
        नोट: एमएस और एमएस / एमएस डेटा को म्यूरोपेप्टाइड्स (खंड 2.2.2.4 और 2.2.2.2.5) के क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण के साथ एक साथ एकत्र किया जाता है ।। क्रोमैटोग्राफिक और एमएस पैरामीटर (अनुभाग 2.2.2.2 और 2.2.3.2) दोनों एक एकल विधि है जिसे अनुक्रम में कई नमूने चलाने के लिए वर्कलिस्ट के सेटअप के दौरान जोड़ा जाता है।
      3. इलेक्ट्रोस्प्रे केशिका वोल्टेज को 4.0 केवी पर और सुखाने वाली गैस का तापमान 350 डिग्री सेल्सियस पर 13 एल / मिनट की प्रवाह दर के साथ सेट करें।
        नोट: नाइट्रोजन (शुद्धता >99%) का उपयोग सभी मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा संग्रह के दौरान नेबुलाइजिंग, सुखाने और टकराव गैस के रूप में किया जाना चाहिए।
      4. नेब्युलाइज़र दबाव को 40 पीएसआई पर सेट करें और फ्रैग्मेंटर को 150 वी पर सेट करें।
      5. नोजल, स्किमर और ऑक्टापोल आरएफ वोल्टेज को क्रमशः 1000 वी, 65 वी और 750 वी पर सेट करें।
      6. स्कैन रेंज को 4 गीगाहर्ट्ज (विस्तारित गतिशील रेंज) सकारात्मक आयन मोड में 300-2,000 मीटर / जेड पर सेट करें।
      7. 1 स्पेक्ट्रा/सेकंड की एमएस और एमएस/एमएस स्कैन दर के साथ डेटा निर्भर एमएस/एमएस अधिग्रहण का उपयोग करके डेटा संग्रह सेट करें। एकल, दोगुना और त्रिगुणित चार्ज के क्रम में प्रति चक्र पांच अग्रदूत द्रव्यमान का चयन करें।
      8. एमएस विखंडन टकराव ऊर्जा को 15, 20 और 30 ईवी पर सेट करें।

3. मुरोपेप्टाइड बहुतायत का अंतर विश्लेषण

  1. एलसी-एमएस क्रोमैटोग्राम स्पेक्ट्रल प्रोसेसिंग
    नोट: पुनरावर्ती सुविधा निष्कर्षण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। अन्य सुविधा निष्कर्षण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, अन्य सॉफ़्टवेयर को अत्यधिक मजबूत पुनरावर्ती निष्कर्षण को पूरा करने के लिए अतिरिक्त मैनुअल डेटा प्रोसेसिंग की आवश्यकता हो सकती है। विभिन्न सॉफ्टवेयर शब्दावली सुविधा, इकाई और यौगिक का उपयोग लगभग परस्पर करते हैं। पीजी विश्लेषण के लिए, सभी एक व्यक्तिगत मुरोपेप्टाइड (जैसे, चित्रा 3) के एलसी-एमएस आयन क्रोमैटोग्राम प्रतिनिधि की पहचान का उल्लेख करते हैं। वर्णक्रमीय प्रसंस्करण (खंड 3.1) के दौरान, एक विशेषता कई एम / जेड चोटियों का प्रतिनिधित्व करती है जो एक एकल मुरोपेप्टाइड की कई संभावित आयन प्रजातियों को शामिल करती है जिन्हें एक यौगिक लेबल के तहत एक साथ समूहीकृत किया जाता है।
    1. फ़ाइल के अंतर्गत, एक नया प्रोजेक्ट प्रारंभ करें।
    2. एलसी-एमएस क्यूटीओएफ डेटा फ़ाइलों को जोड़ें और व्यक्तिगत डेटा फ़ाइलों को एक प्रयोगात्मक स्थिति / समूह में असाइन करें, उदाहरण के लिए, दो अलग-अलग विकास स्थितियां।
    3. डेटा प्रोसेसिंग विज़ार्ड बैच रिकर्सिव फीचर निष्कर्षण (छोटे अणु / पेप्टाइड्स) चलाएं और व्यक्तिगत मुरोपेप्टाइड्स का प्रतिनिधित्व करने वाले एम / जेड चोटियों को सटीक रूप से पहचानने, समूहित करने और सत्यापित करने के लिए एलसी-एमएस स्थितियों और इंस्ट्रूमेंटेशन के मापदंडों से मेल खाने के लिए डेटा प्रोसेसिंग फिल्टर सेट करें। क्रोमैटोग्राम से, प्रारंभिक फ़िल्टर पैरामीटर सेट करने के लिए ज्ञात समान चोटियों के प्रतिधारण समय बहाव और एम / जेड की भिन्नता की जांच करें।
      नोट: रिकर्सिव फीचर निष्कर्षण सभी डेटा फ़ाइलों में क्रोमैटोग्राम सुविधाओं (एम / जेड चोटियों) को पहचानने और संरेखित करने के लिए एक प्रारंभिक अलक्षित आणविक सुविधा निष्कर्षण एल्गोरिथ्म का उपयोग करता है। एक बार बनाए जाने के बाद, इन सुविधाओं का उपयोग पहचान की गई सुविधाओं की विश्वसनीयता और सटीकता में सुधार के लिए लक्षित आणविक सुविधा निष्कर्षण एल्गोरिथ्म के साथ मूल डेटा फ़ाइलों (पुनरावर्ती) का पुनर्मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। प्रारंभिक अलक्षित निष्कर्षण को एक संकीर्ण पहचान विंडो के साथ सेट करना और प्रारंभिक निष्कर्षण में गायब होने वाली सभी डेटा फ़ाइलों में चोटियों की पहचान करने के लिए पुनरावर्ती निष्कर्षण के लिए व्यापक पहचान मापदंडों का उपयोग करना सबसे अच्छा है। पुनरावर्ती सुविधा निष्कर्षण चलाने से नमूनों की संख्या, डेटा की जटिलता और मौजूद कंप्यूटर हार्डवेयर के आधार पर पूरा होने में घंटों लग सकते हैं
    4. सुविधा निष्कर्षण परिणामों की समीक्षा करें। यदि किसी समूह में बड़ी संख्या में सुविधाएँ संरेखित करने में विफल रहती हैं, तो आवश्यकतानुसार डिटेक्शन विंडो को व्यापक/प्रतिबंधित करने के लिए पुनरावर्ती फ़िल्टरिंग पैरामीटर समायोजित करें. इसे पूरा करने के लिए, प्रत्येक निकाले गए फीचर के क्रोमैटोग्राम और आइसोटोपिक प्रोफाइल का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि फीचर डिटेक्शन सभी डेटा फ़ाइलों में समान रूप से पूरा किया गया था। इसके अलावा, डेटा फ़ाइल के भीतर प्रत्येक पहचान की गई सुविधा के लिए, स्कोर, किसी भी चेतावनी की जांच करें और क्या सुविधा ने चुने हुए फ़िल्टर मापदंडों को पारित किया है।
      नोट: डिटेक्शन विंडो को इतना संकीर्ण रखने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए कि अलग-अलग विशेषताओं को गलती से एक साथ समूहीकृत न किया जाए। यह अक्सर डेटा फ़ाइलों, या महत्वपूर्ण m / z / अवधारण समय भिन्नताओं के बीच असमान समस्थानिक प्रोफाइल द्वारा नोट किया जाता है। इसके विपरीत, यदि समान एम / जेड और प्रतिधारण समय के साथ कई विशेषताएं हैं, तो यह संभव है कि फ़िल्टर पैरामीटर बहुत कठोर थे जिसके परिणामस्वरूप एक एमएस शिखर को दो विशेषताओं में विभाजित किया गया था। इसलिए, इन सुविधाओं के बेहतर समूहीकरण की अनुमति देने के लिए समायोजित अवधारण समय फ़िल्टर पैरामीटर के साथ सुविधा निष्कर्षण (अनुभाग 3.1.3) फिर से चलाएं। सबसे कम बहुतायत चोटियों की कल्पना करने से संकेत मिलेगा कि उपयोग किए गए फिल्टर (खंड 3.1.3) ने पृष्ठभूमि शोर के ऊपर चोटियों की सटीक पहचान की है या नहीं। यदि सबसे कम बहुतायत चोटियाँ पृष्ठभूमि के समान दिखाई देती हैं, तो नए पृष्ठभूमि फ़िल्टर मापदंडों के साथ सुविधा निष्कर्षण को फिर से चलाएं।
    5. डेटा को एक यौगिक विनिमय फ़ाइल (.cef) (सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम के साथ संगत प्रारूप), या एक स्तंभ पृथक फ़ाइल (.csv) के रूप में निर्यात करें जिसमें प्रत्येक नमूने के लिए प्रत्येक सुविधा का द्रव्यमान, अवधारण समय और बहुतायत होती है।
  2. वर्णक्रमीय विशेषताओं का विभेदक विश्लेषण
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विभेदक विश्लेषण किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। अन्य जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है।
    1. प्रोग्राम खोलें और जब निर्देश दिया जाए तो एक नई परियोजना शुरू करें।
    2. डेटा आयात और डेटा विश्लेषण के लिए आने वाले अनुदेशों का पालन करें. डेटा आयात के दौरान, निकाली गई फ़ाइलों की सुविधा अपलोड करें (अनुभाग 3.1). डेटा विश्लेषण के दौरान, अंतर विश्लेषण के लिए महत्व और गुना परिवर्तन चुनें और सभी डेटा फ़ाइलों में औसत तीव्रता के लिए बेसलाइन डेटा का चयन करें। किसी भी डेटा फ़िल्टर को सेट न करें (यदि यह पिछले स्पेक्ट्रा प्रोसेसिंग चरण (अनुभाग 3.1) में किया गया था) क्योंकि फ़िल्टर को फिर से लागू करने से मजबूत पुनरावर्ती सुविधा निष्कर्षण को नकार दिया जाएगा। हालांकि, फीचर निष्कर्षण के समान, एलसी-एमएस डेटा संग्रह में बहाव के कारण द्रव्यमान (एम / जेड) और प्रतिधारण समय के आधार पर अंतर विश्लेषण को संरेखित किया जाना चाहिए। सुविधा निष्कर्षण (अनुभाग 3.1) में निर्धारित पैरामीटर का उपयोग करें।
      नोट: म्यूरोपेप्टाइड मात्रा (खंड 1.3) का उपयोग करके डेटा फ़ाइलों के बीच सामान्यीकरण यह सुनिश्चित करने के लिए कि भिन्नताएं प्रयोगात्मक मापदंडों के कारण हैं, न कि सैकुली शुद्धिकरण (धारा 1.2) में भिन्नता के कारण। नमूना MURNAC एकाग्रता में अंतर के लिए प्रत्येक डेटा फ़ाइल को समायोजित करने के लिए बाहरी स्केलर विकल्प का उपयोग करें।
    3. एक बार विश्लेषण पूरा हो जाने के बाद, मुरोपेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए परिणामी ग्राफिकल और सांख्यिकीय विश्लेषणों की जांच करें जो परीक्षण की गई प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच एक महत्वपूर्ण बहुतायत परिवर्तन प्रदर्शित करते हैं।
    4. प्रोजेक्ट नेविगेटर के तहत, विभिन्न विश्लेषणों पर राइट-क्लिक करें और फीचर विवरण को एक कॉलम अलग (.csv) डेटा फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए एक निर्यात विकल्प चुनें जिसमें एम / जेड, प्रतिधारण समय, कच्चे और सामान्यीकृत तीव्रता मान, पी-वैल्यू, एफडीआर और प्रत्येक सुविधा के लिए फोल्ड परिवर्तन शामिल हैं। सभी प्रासंगिक डेटा प्राप्त करने के लिए कई विश्लेषण सहेजे जाने चाहिए।
    5. एक दूसरी .csv फ़ाइल निर्यात करें जिसमें केवल मुरोपेप्टाइड्स होते हैं जिन्होंने पी-वैल्यू <0.05 और गुना परिवर्तन >2 सहित सांख्यिकीय विश्लेषणों को पार कर लिया है।
  3. वर्णक्रमीय विशेषताओं के लिए मुरोपेप्टाइड पहचान को एनोटेट करना
    नोट: प्रत्येक पहचान की गई सुविधा को एम / जेड के आधार पर एक अनुमानित मुरोपेप्टाइड संरचना सौंपी जानी चाहिए और इस एनोटेशन की पुष्टि एमएस / एमएस विखंडन की जांच करके की जाती है। एनोटेशन की पुष्टि करने के बाद, अंतर विश्लेषण (धारा 3.2) को निष्पादित करना और परिष्कृत करना आवश्यक हो सकता है।
    1. अंतर विश्लेषण सॉफ्टवेयर के भीतर, परिणाम व्याख्या के तहत, आईडी ब्राउज़र का चयन करें। अपेक्षित मुरोपेप्टाइड संरचनाओं की एक लाइब्रेरी जोड़ें और पहले उपयोग किए गए समान मापदंडों का चयन करें (अनुभाग 3.1.3)। यह प्रत्येक पहचान की गई सुविधा के लिए एक अनुमानित मुरोपेप्टाइड एनोटेशन का उत्पादन करेगा। अनुमानित मुरोपेप्टाइड संरचनाओं और एमएस डेटाबेस सॉफ्टवेयर के लिए एम / जेड का उपयोग करके मुरोपेप्टाइड संरचनाओं की एक लाइब्रेरी का उत्पादन किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)। हालांकि, >6,000 संभावित मुरोपेप्टाइड्स के एम / जेड की एक लाइब्रेरी संदर्भ12 में पाई जा सकती है।
    2. मिलान स्कोर और अनुमानित मुरोपेप्टाइड की जैविक प्रासंगिकता के आधार पर अनुमानित मुरोपेप्टाइड एनोटेशन का चयन करें, यानी, जैविक नमूने में मौजूद होने के लिए सबसे अधिक संभावना वाले मुरोपेप्टाइड का चयन करें।
    3. एमएस क्रोमैटोग्राम की एम / जेड चोटियों की तुलना ज्ञात मुरोपेप्टाइड संरचना के सभी संभावित विखंडनों के अनुमानित एम / जेड से करके अनुमानित मुरोपैप्टाइड एनोटेशन की मैन्युअल रूप से पुष्टि करें (उदाहरण के लिए, चित्रा 4)।
      1. क्रोमैटोग्राम-देखने वाले प्रोग्राम का उपयोग करके एमएस और एमएस / एमएस डेटा देखें ( सामग्री की तालिका, चित्रा 4 देखें)।
      2. आणविक संपादक (रासायनिक संरचना ड्राइंग प्रोग्राम) का उपयोग करके अनुमानित मुरोपेप्टाइड संरचना खींचें ( सामग्री की तालिका, चित्रा 4, ग्रे इनसेट देखें)। एमएस टुकड़ों के एम / जेड को दिखाने के लिए द्रव्यमान विखंडन उपकरण का उपयोग करें जब प्रत्येक बंधन व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में टूट जाता है।
        एमएस के लिए उपयोग की जाने वाली विखंडन ऊर्जा के आधार पर, विखंडन मुरोपेप्टाइड संरचना में किसी भी बंधन पर हो सकता है। हालांकि, कुछ बांड कम ऊर्जा स्तरों पर अधिक आसानी से / अक्सर खंडित होते हैं। उदाहरण के लिए, पेप्टाइड साइडचेन में विखंडन अमीनो एसिड के बीच एमाइड बॉन्ड पर सबसे अधिक बार होता है। विखंडन का आकलन करते समय, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जीएलसीएनएसी अवशेष मुरोपेप्टाइड से बहुत आसानी से खंडित होते हैं। इसलिए, ज्ञात मुरोपेप्टाइड संरचना के विखंडन का मूल्यांकन जीएलसीएनएसी के साथ और बिना किया जाना चाहिए। GlcNac के इन-सोर्स विखंडन के कारण, वर्णक्रमीय प्रसंस्करण (अनुभाग 3.1) में निकाली गई कई विशेषताएं एकल मुरोपेप्टाइड संरचना का प्रतिनिधित्व कर सकती हैं। यदि पाया जाता है, तो इन विशेषताओं को विलय कर दिया जाना चाहिए और अंतर विश्लेषण का पुनर्मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
      3. एमएस क्रोमैटोग्राम (धारा 3.3.3.1) से निर्धारित किए गए म्यूरोपेप्टाइड संरचना के सभी संभावित विखंडनों की तुलना करें। मुरोपेप्टाइड एनोटेशन की पुष्टि करने के लिए, कई टुकड़ों की एम / जेड चोटियों को एमएस / एमएस क्रोमैटोग्राम में बहुत कम एम / जेड संरेखण विंडो (चित्रा 4) के साथ पाया जाना चाहिए।
      4. अस्पष्ट एमएस/एमएस विखंडन के मामले में मुरोपेप्टाइड पहचान को स्पष्ट करने के लिए, अतिरिक्त एमएस/एमएस डेटा अधिग्रहण के लिए नमूने (धारा 2.1.9) के साथ खंड 2.2.2 से 2.2.3 को दोहराएं, जिसमें एम/जेड की पसंदीदा अग्रदूत सूची और अतिरिक्त एमएस/एमएस विखंडन टकराव ऊर्जा के साथ अवधारण समय शामिल हो।
    4. सह-एल्यूटिंग संस्थाओं के लिए जिन्हें एक ही मुरोपेप्टाइड के रूप में एनोटेट किया गया था, अंतर विश्लेषण (धारा 3.2.2) को फिर से चलाएं और निकाली गई सुविधाओं को विलय करें।
  4. मुरोपेप्टाइड संशोधनों में वैश्विक परिवर्तनों का आकलन
    1. प्रत्येक मुरोपेप्टाइड संशोधन के लिए एक कॉलम शामिल करने के लिए सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण उच्च गुना परिवर्तन म्यूरोपेप्टाइड्स की .csv फ़ाइल (धारा 3.2.4) को संपादित करें। इस कॉलम को प्रत्येक मुरोपैप्टाइड एनोटेट (धारा 3.3) (उदाहरण के लिए, एसिटाइलेटेड बनाम डी-एन-एसिटाइलेटेड जीएलसीएनएसी या मुरनाक) के लिए एक पदनाम के साथ पॉप्युलेट करें।
    2. संशोधित .csv फ़ाइल को Perseus22,23 में अपलोड करें। सामान्यीकृत तीव्रता मानों को मुख्य आयात बॉक्स में आयात करें और संशोधन पदनाम श्रेणीबद्ध आयात बॉक्स में आयात करें।
    3. एनोटेट पंक्तियों के अंतर्गत, स्पष्ट रूप से एनोटेट पंक्तियों पर क्लिक करें और प्रत्येक प्रयोगात्मक पैरामीटर में डेटाफ़ाइल जोड़ें.
    4. परीक्षण के तहत, छात्र के टी-टेस्ट (पी-वैल्यू < 0.05, एफडीआर < 0.05, एस0 = 1) करने के लिए दो नमूना परीक्षणों पर क्लिक करें।
    5. 1 डी एनोटेशन22,23 करने के लिए 1 डी पर क्लिक करें। 0.05 < एक 1 डी एनोटेशन एफडीआर परीक्षण किए गए प्रयोगात्मक मापदंडों के बीच मुरोपेप्टाइड संशोधन के लिए एक महत्वपूर्ण बहुतायत परिवर्तन को इंगित करता है। थ्रेशोल्ड मान (एस 0) = 1 सेट करना सभी मुरोपेप्टाइड्स के लिए 1 डी एनोटेशन एफडीआर स्कोर प्रदर्शित करेगा।
    6. एक ग्राफिंग सॉफ्टवेयर के भीतर ( सामग्री की तालिका देखें), प्रत्येक मुरोपेप्टाइड संशोधन के लिए बहुतायत गुना परिवर्तन का एक गर्मी मानचित्र तैयार करें और महत्व प्रदर्शित करने के लिए 1 डी एनोटेशन स्कोर दिखाएं (चित्रा 5 बी)। प्रत्येक मुरोपेप्टाइड संशोधन का गुना परिवर्तन माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल में सभी व्यक्तिगत मुरोपेप्टाइड्स की कच्ची तीव्रता का उपयोग करके उत्पादित किया जा सकता है जिसमें संशोधन होता है।

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Representative Results

उच्च शक्ति वाले पीक रिकग्निशन सॉफ्टवेयर के साथ मिलकर एमएस मशीनरी की बढ़ती पहचान संवेदनशीलता ने जटिल नमूनों की पदार्थ रचनाओं को बहुत ही मिनट विस्तार से अलग करने, निगरानी करने और विश्लेषण करने की क्षमता में सुधार किया है। इन तकनीकी प्रगति का उपयोग करते हुए, पेप्टिडोग्लाइकन संरचना पर हाल के अध्ययनों ने पुराने एचपीएलसी-आधारित पद्धति 11,25,26,27,28,29,30,31 पर स्वचालित एलसी-एमएस फीचर निष्कर्षण तकनीकों का उपयोग करना शुरू कर दिया है . यद्यपि कई सामान्य सुविधा निष्कर्षण सॉफ्टवेयर पैकेज उपलब्ध हैं, पुनरावर्ती सुविधा निष्कर्षण का उपयोग करने वाला वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर एलसी-एमएस डेटासेट (चित्रा 3) के भीतर पाए जाने वाले प्रत्येक मुरोपेप्टाइड के सभी चार्ज, आइसोटोप और जोड़ संस्करणों को स्वचालित रूप से पहचानकर और संयोजन करके तेजी से और अत्यधिक मजबूत है। इसके अलावा, सभी डेटा फ़ाइलों में प्रत्येक सुविधा की सटीक पहचान सुनिश्चित करने के लिए डेटासेट का पुनर्मूल्यांकन (पुनरावर्ती) करने के लिए प्रारंभिक अवधारण समय, एम / जेड और निकाले गए सुविधाओं के आइसोटोपिक पैटर्न का उपयोग किया जाता है। इसलिए, पुनरावर्ती एल्गोरिथ्म चरम पहचान में विश्वास को मान्य करने और बढ़ाने में सहायता करता है। अधिकांश सामान्य सुविधा निष्कर्षण कार्यक्रम समूह शुल्क / आइसोटोप आदि नहीं करते हैं। और इसे एक अतिरिक्त मैनुअल चरण के रूप में आवश्यक होगा। इसके अलावा, जेनेरिक प्रोग्राम कम मजबूत होंगे क्योंकि सुविधाओं को प्रत्येक डेटा फ़ाइल के भीतर अलग से निकाला जाता है और पूरे डेटासेट के रूप में नहीं, जो पुनरावर्ती एल्गोरिथ्म का हिस्सा है।

यहां प्रस्तुत पेप्टिडोग्लाइकोमिक प्रोटोकॉल का उपयोग हाल ही में दो शारीरिक विकास स्थितियों, अर्थात्, फ्री-स्विमिंग प्लवक और स्थिर सांप्रदायिक बायोफिल्म 12 के बीच पीजी के रचनात्मकपरिवर्तनों की जांच करने के लिए किया गया था। पुनरावर्ती सुविधा निष्कर्षण के साथ युग्मित एक अत्यधिक संवेदनशील क्यूटीओएफ एमएस का उपयोग करते हुए, 160 अलग-अलग मुरोपेप्टाइड्स को पहचाना और ट्रैक किया गया था। यह पहले29,32 से इस जीव में पहचाने गए मुरोपेप्टाइड्स की संख्या का आठ गुना था, और अन्य जीवों में अन्य पद्धतियों का उपयोग करके पहचाने गए मुरोपेप्टाइड्स के दोगुने से अधिक10,14,24 था।

एमएस डेटा से निकाले गए प्रत्येक एम / जेड शिखर को एक विशेष म्यूरोपेप्टाइड के साथ जोड़ना ज्ञात और अनुमानित मुरोपेप्टाइड संरचनाओं के डेटाबेस के साथ क्रॉस-संदर्भित करके सुविधाजनक है। प्रत्येक निकाली गई सुविधा के लिए विखंडन एमएस / एमएस क्रोमैटोग्राम (चित्रा 4) की तुलना डेटाबेस का उपयोग करके प्रस्तावित मुरोपेप्टाइड के विखंडन प्रोफ़ाइल (चित्रा 4, ग्रे इनसेट) से की जाती है।

पेप्टिडोग्लाइकोमिक डेटा को प्रयोगात्मक सेटअप और पूछे जा रहे प्रश्नों के आधार पर कई अलग-अलग तरीकों से देखा जा सकता है। इस तरह के ग्राफिकल विश्लेषण में प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए), स्कैटरप्लॉट, ज्वालामुखी भूखंड, गर्मी मानचित्र और पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विश्लेषण शामिल हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, ज्वालामुखी भूखंड मुरोपेप्टाइड्स को उजागर करते हैं जो परीक्षण की गई स्थितियों (चित्रा 5 ए) के बीच बहुतायत परिवर्तन के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण उच्च परिमाण का प्रदर्शन करते हैं। ये चयनित मुरोपेप्टाइड्स जो परीक्षण की गई स्थितियों के बीच महत्वपूर्ण बहुतायत परिवर्तनों का प्रतिनिधित्व करते हैं, उन्हें मुरोपेप्टाइड संशोधनों के लिए आगे की जांच की जा सकती है। इन संशोधनों में अमीनो एसिड प्रतिस्थापन, एसिटिलीकरण परिवर्तन, या एमिडेस गतिविधि की उपस्थिति शामिल हो सकती है। जब एक साथ जांच की जाती है, तो एक ही संशोधन रखने वाले कई मुरोपेप्टाइड्स को एक प्रयोगात्मक स्थिति (चित्रा 5 ए-हाइलाइट किए गए बिंदु हरे) की ओर एक प्रवृत्ति के लिए जांच की जा सकती है और पूरे समूह का महत्व के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है (चित्रा 5 बी)। इस तरह से एक मुरोपेप्टाइड संशोधन को ट्रैक करना, एक विशेष एंजाइमेटिक गतिविधि का संकेत दे सकता है जो प्रयोगात्मक पैरामीटर से प्रभावित होता है। इसके अलावा, इस प्रवृत्ति से आउटलायर्स एक विशेष विशिष्टता या जैविक कार्य के साथ एंजाइमेटिक गतिविधि का संकेत दे सकते हैं (चित्रा 5 ए-हाइलाइट किए गए बिंदु नारंगी)।

Figure 1
चित्रा 1: एक विशिष्ट ग्राम-नकारात्मक पेप्टिडोग्लाइकन संरचना का उदाहरण। (ए) ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में, पेप्टिडोग्लाइकन आंतरिक और बाहरी झिल्ली के बीच पेरिप्लाज्म में स्थित होता है। (बी) एक एकल मुरोपेप्टाइड में एक β-1,4-लिंक्ड एन-एसिटाइल ग्लूकोसामाइन (जीएलसीएनएसी) (नीला) और एक एन-एसिटाइल मुरमिक एसिड (मुरनाक) (बैंगनी) होता है, जिसमें एक संलग्न पेप्टाइड साइडचेन (नारंगी) होता है। पेप्टाइड साइडचेन को परिपक्व जाल जैसे पेप्टिडोग्लाइकन (ए) का उत्पादन करने वाले आसन्न मुरोपेप्टाइड के साइडचेन से क्रॉसलिंक किया जा सकता है। शुद्धिकरण में पेप्टिडोग्लाइकन का अलगाव पूरे सेल से एक सकुलस के रूप में शामिल है जहां अन्य सभी सेलुलर सामग्री को छीन लिया गया है। (सी) पेप्टिडोग्लाइकन सैकुली का ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। इसकी तुलना में, ग्राम-पॉजिटिव पीजी में संरचना में भिन्नताओं की एक बड़ी सरणी शामिल हो सकती है और यह ग्राम-पॉजिटिव टैक्सोनोमिक वर्गीकरण33 का हिस्सा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पेप्टिडोग्लाइकोमिक्स वर्कफ़्लो। नमूना तैयारी. चरण 1, बैक्टीरिया कोशिकाओं को विकसित करें और गोली मार दें (खंड 1.1)। चरण 2, पेप्टिडोग्लाइकन सकुली को 4% एसडीएस उबाल (धारा 1.2) द्वारा शुद्ध करें। डेटा अधिग्रहण. चरण 3, पेप्टिडोग्लाइकन बैकबोन के एन-एसिटाइलग्लूकोसामाइन (जीएलसीएनएसी) और एन-एसिटाइलमुरामिक एसिड (मुरनाक) के बीच β-1,4-लिंकेज के टूटने से म्यूरोपेप्टाइड्स का उत्पादन करने के लिए सकुली का एंजाइमेटिक पाचन (खंड 2.1)। चरण 4, एलसी-एमएस / एमएस (खंड 2.2) के माध्यम से मुरोपेप्टाइड तीव्रता का विश्लेषण। डेटा विश्लेषण। चरण 5, पुनरावर्ती सुविधा निष्कर्षण एकल मुरोपेप्टाइड (धारा 3.1) से जुड़े सभी चार्ज, जोड़ों और आइसोटोप की पहचान और संग्रह करता है। चरण 6, एमएस / एमएस क्रोमैटोग्राम (खंड 3.3) के साथ अनुमानित विखंडन की तुलना करके मुरोपेप्टाइड्स की पहचान। चरण 7, जैव सूचना त्मक अंतर विश्लेषण (खंड 3.2) विभिन्न प्रयोगात्मक मापदंडों के बीच पेप्टिडोग्लाइकन संरचना परिवर्तनों की तुलना करता है। चरण 8, 1 डी एनोटेशन (धारा 3.4) का उपयोग करके विभिन्न प्रयोगात्मक मापदंडों के भीतर म्यूरोपेप्टाइड संशोधनों में वैश्विक परिवर्तन की जांच करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एक पुनरावर्ती सुविधा निष्कर्षण का उदाहरण। एलानिन (ए) के पेप्टाइड साइडचेन का प्रतिनिधित्व करने वाले एक मुरोपेप्टाइड के लिए, आइसो-ग्लूटामेट (ई), मेसो-डायमिनोपिमेलिक एसिड (एम), एलानिन (ए) आसन्न मुरोपैप्टाइड साइडचेन (1864.8 मीटर / जेड) के एईएमए से क्रॉसलिंक किया गया है। 1864.8 मीटर /जेड के लिए निकाली गई सुविधा में शामिल चार्ज (+1, +2, और +3), जोड़ (जैसे, सोडियम और पोटेशियम), जीएलसीएनएसी का नुकसान (1 या 2 जीएलसीएनएसी), और प्रत्येक भिन्नता के लिए कई आइसोटोपिक चोटियां (जैसे, ज़ूम इनसेट)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: मुरोपेप्टाइड विखंडन और पहचान। एनोटेशन के लिए, एमएस क्रोमैटोग्राम से निकाले गए प्रत्येक एम / जेड पीक (सुविधा) को एक मुरोपेप्टाइड लाइब्रेरी से समानता के आधार पर एक प्रस्तावित मुरोपेप्टाइड संरचना दी जाती है। इस प्रस्तावित संरचना की पुष्टि करने के लिए, अनुमानित एमएस / एमएस टुकड़े एक रासायनिक ड्राइंग प्रोग्राम (ग्रे इनसेट) का उपयोग करके उत्पन्न होते हैं। इस अनुमानित विखंडन की तुलना एमएस / एमएस क्रोमैटोग्राम से की जाती है। जब अनुमानित टुकड़े (ग्रे इनसेट) एमएस / एमएस क्रोमैटोग्राम से मेल खाते हैं, तो प्रस्तावित मुरोपेप्टाइड संरचना की पुष्टि की जाती है। आंकड़े को संदर्भ12 से संशोधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पेप्टिडोग्लाइकन संरचना का अंतर विश्लेषण। (ए) फ्री-स्विमिंग प्लवक या स्थिर बायोफिल्म संस्कृति के रूप में उगाए गए पी. एरुगिनोसा से शुद्ध पेप्टिडोग्लाइकन के बीच मुरोपेप्टाइड तीव्रता में परिवर्तन के गुणा परिवर्तन और सांख्यिकीय महत्व का ज्वालामुखी प्लॉट। पेप्टाइड साइडचेन के भीतर विशिष्ट अमीनो एसिड व्यवस्था में बदलाव का प्रतिनिधित्व करने वाले सभी मुरोपेप्टाइड्स पर प्रकाश डाला गया है। एमिनो एसिड प्रतिस्थापित मुरोपेप्टाइड्स जो बायोफिल्म-व्युत्पन्न पेप्टिडोग्लाइकन में कम बहुतायत की ओर प्रवृत्ति दिखाते हैं, हरे रंग में हाइलाइट किए जाते हैं। एमिनो एसिड प्रतिस्थापित मुरोपेप्टाइड्स जो इस प्रवृत्ति के लिए आउटलायर थे और बायोफिल्म-व्युत्पन्न पेप्टिडोग्लाइकन में बढ़ी हुई प्रचुरता दिखाते थे, नारंगी में हाइलाइट किए जाते हैं। (बी) बायोफिल्म में प्रचुरता (नारंगी) और बहुतायत (हरे) में कमी के साथ प्रतिस्थापित सभी एमिनो एसिड के बहुतायत में वैश्विक गुना परिवर्तन का हीट मैप। इन मुरोपेप्टाइड्स को फिर से संगठित किया गया और मूल्यांकन किया गया कि क्या मोनोमर्स, क्रॉसलिंक्ड डिमर पर अमीनो एसिड प्रतिस्थापन हुआ था, या क्या चौथा (एईएम +), पांचवां (एईएमए +) या दोनों एमिनो एसिड (एईएम ++) प्रतिस्थापित किया गया था। म्यूरोपेप्टाइड्स के प्रत्येक समूह के महत्व का मूल्यांकन एफडीआर < 0.05 के साथ 1 डी एनोटेशन द्वारा महत्व के लिए किया गया था और संबंधित 1 डी स्कोर प्रदर्शित किया गया है। 1 डी एनोटेशन केवल 2 से अधिक मुरोपेप्टाइड्स पर किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एईएम ++ प्रतिस्थापन केवल दो मुरोपेप्टाइड्स पर पाया गया था)। इसलिए, इस मामले में, व्यक्तिगत मुरोपेप्टाइड्स के लिए महत्व की जांच की जानी चाहिए, न कि समूह पर। आंकड़े को संदर्भ12 से संशोधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल बैक्टीरियल संस्कृतियों से पेप्टिडोग्लाइकन को शुद्ध करने की एक विधि का वर्णन करता है, एलसी-एमएस का पता लगाने की प्रक्रिया और जैव सूचना विज्ञान तकनीकों का उपयोग करके संरचना का विश्लेषण करता है। यहां, हम ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया पर ध्यान केंद्रित करते हैं और ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए कुछ मामूली संशोधन की आवश्यकता होगी।

मुरोपेप्टाइड्स की तैयारी लगभग वही रही है क्योंकि यह पहली बार 1960 के दशक 9,11,15 में उत्पादित किया गया था। एक बार शुद्ध होने के बाद, सैकुली (खंड 1.2.18) को स्ट्रेप्टोमाइसेस ग्लोबिस्पोरस से म्यूमिडेस एंजाइम मुटानोलिसिन का उपयोग करके अलग-अलग मुरोपेप्टाइड्स में पचाया जाता है। मुटानोलिसिन β-1,4-ग्लाइकोसिडिक लिंकेज को तोड़कर पीजी संरचना को पचाता है, जो व्यक्तिगत मुरोपेप्टाइड्स को जारी करता है जिसमें संलग्न पेप्टाइड साइडचेन के साथ जीएलसीएनएसी-मुरनाक डिसैकराइड होता है और इसमें कोई संशोधन या क्रॉसलिंकेज शामिल होता है (चित्रा 1)।

पीजी संरचना का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली पिछली पद्धति की एक सीमा मुरोपेप्टाइड्स की समय लेने वाली मैनुअल पहचान रही है। जटिलता और कठिनाई के कारण, जोड़ों, आवेशों और / या आइसोटोप को विश्लेषण में शामिल किया जा सकता है या नहीं भी किया जा सकता है। इसके अलावा, अधिकांश अध्ययनों ने विश्लेषण को सबसे प्रचुर मात्रा में सीमित कर दिया, इसलिए शुद्ध करना सबसे आसान है, मुरोपेप्टाइड्स। इसलिए, कार्यप्रणाली की जटिल प्रकृति के कारण, अपेक्षाकृत कुछ उच्च-स्तरीय विस्तृत पीजी रचनात्मक विश्लेषण किए गए हैं। "ओमिक" प्रकार के विश्लेषण ने जैविक प्रणालियों के उच्च-स्तरीय अवलोकन के लिए अपेक्षाकृत बड़े और जटिल एलसी-एमएस डेटासेट के उत्पादन और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए हाल के तकनीकी सुधारों का उपयोग किया है। पेप्टिडोग्लाइकोमिक्स का आवेदन पीजी संरचना के विश्लेषण को बहुत बारीक विस्तार से सक्षम करेगा।

पेप्टिडोग्लाइकोमिक्स के भीतर, पुनरावर्ती सुविधा निष्कर्षण मैन्युअल कार्यभार को कम करता है और एक बार में सभी डेटा फ़ाइलों की जांच करके सटीकता बढ़ाता है। एक पुनरावर्ती सुविधा निष्कर्षण एल्गोरिथ्म का उपयोग कई एलसी-एमएस क्रोमैटोग्राफिक डेटा फ़ाइलों में अद्वितीय वर्णक्रमीय विशेषताओं (एम / जेड चोटियों) की पहचान, संरेखण और समूहीकृत करने के लिए किया जाता है, जिससे मुरोपेप्टाइड एम / जेड चोटियों की पहचान स्वचालित हो जाती है। यह एल्गोरिथ्म आइसोटोपिक पैटर्न मिलान का उपयोग करता है जो कई संभावित आइसोटोप, आयन जोड़ और चार्ज अवस्थाओं को लेता है और कई एम / जेड चोटियों को अपने प्रतिनिधि एकल यौगिक (या विशेषता) में संघनित करता है, जो इस मामले में एकल मुरोपेप्टाइड (चित्रा 3) का प्रतिनिधित्व करेगा। वर्णक्रमीय सुविधा समूह का सत्यापन पूरे डेटासेट में सुविधा के मजबूत निष्कर्षण को सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक क्रोमैटोग्राफिक डेटा फ़ाइल के भीतर प्रतिधारण समय, एम / जेड और आइसोटोपिक पैटर्न मिलान की तुलना करके पूरा किया जाता है। जेनेरिक फीचर खोजने वाले एल्गोरिदम में आइसोटोप मिलान या संरेखित, समूह, या कई नमूनों में एम / जेड चोटियों को सत्यापित करना शामिल नहीं हो सकता है और इस सुविधा निष्कर्षण को पूरा करने के लिए अतिरिक्त मैनुअल डेटा प्रोसेसिंग की आवश्यकता होगी।

एक बार विशेषताओं की पहचान हो जाने के बाद, जैव सूचना विज्ञान अंतर विश्लेषण एल्गोरिदम बहुत बड़े डेटासेट को समग्र रूप से संभालते हैं, इस प्रकार जटिल डेटा से उपयोगी तुलना और व्याख्याओं की अनुमति देते हैं। इन जैव सूचना विज्ञान ग्राफिकल विश्लेषणों का उपयोग करना रुझानों की जांच करने के लिए बड़े डेटासेट की कल्पना और व्याख्या करने का एक शक्तिशाली तरीका है जो जैविक प्रक्रियाओं को इंगित कर सकता है। यह केवल हाल ही में था कि इन उच्च शक्ति वाले ग्राफिकल विश्लेषणों का उपयोग पेप्टिडोग्लाइकन की जांच करने के लिए बहुत बारीक विस्तारसे किया गया था। विभेदक विश्लेषण (खंड 3.2) विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच व्यक्तिगत मुरोपेप्टाइड्स की बहुतायत में परिवर्तन का आकलन करता है। हालांकि, पूरे जीवाणु कोशिकाओं के संदर्भ में, पीजी संशोधित एंजाइमों की गतिविधि के परिणामस्वरूप उत्प्रेरक गतिविधि की विशिष्टता के आधार पर कई अलग-अलग मुरोपेप्टाइड संरचनाएं हो सकती हैं (यानी, डिसैकराइड पर एक एसिटाइल समूह को जोड़ना पेप्टाइड साइडचेन के संशोधन के साथ या बिना हो सकता है)। इसलिए, सभी व्यक्तिगत एनोटेटेड मुरोपेप्टाइड्स में एक विशेष संशोधन के वैश्विक बहुतायत परिवर्तनों का आकलन पीजी (चित्रा 5) पर अभिनय करने वाली एंजाइमेटिक गतिविधि पर अंतर्दृष्टि देगा, इसलिए, अलग-अलग मुरोपेप्टाइड्स के बहुतायत परिवर्तनों की जांच करने के लिए अंतर विश्लेषण का उपयोग किया जाता है; जबकि, 1 डी एनोटेशन एक विशेष पीजी संशोधन के बहुतायत परिवर्तनों की जांच करता है। 1 डी एनोटेशन के साथ युग्मन अंतर विश्लेषण पीजी संरचना को एक व्यक्तिगत मुरोपेप्टाइड स्तर पर और समग्र पीजी एंजाइमेटिक गतिविधि के संकेतक के रूप में मूल्यांकन करने की अनुमति देता है।

विभेदक विश्लेषण के दौरान, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पीजी कुछ अत्यधिक प्रचुर मात्रा में मुरोपेप्टाइड्स और कई कम प्रचुरता वाले मुरोपेप्टाइड्स12 से बना है। इसलिए, विश्लेषण के बाद के चरणों के दौरान उच्च बहुतायत मुरोपेप्टाइड्स से किसी भी पूर्वाग्रह को हटाने के लिए बेसलाइनिंग बहुत महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, किए गए कई टी-परीक्षणों के कारण, झूठे सकारात्मक को कम करने के लिए एक सांख्यिकीय सुधार लागू किया जाना चाहिए। डिफ़ॉल्ट अक्सर बेंजामिनी-होचबर्ग झूठी-खोज दर (एफडीआर) 19 है। अन्य सुधार जैसे कि अधिक रूढ़िवादी बोनफेरोनी परिवारवार त्रुटि दर (एफडब्ल्यूईआर) 20,21 संभव हैं।

जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर के भीतर, फीचर निष्कर्षण में पहचाने गए एम / जेड पीक को एक अनुमानित संरचना भी सौंपी गई है। अन्य "ओमिक" -प्रकार (जैसे, प्रोटिओमिक) विश्लेषण बड़े यौगिक डेटाबेस की उपलब्धता से लाभान्वित होते हैं, जो पूर्वानुमानित विखंडन स्पेक्ट्रा मिलान के माध्यम से यौगिक पहचान की अनुमति देते हैं। वर्तमान में, कोई मुरोपेप्टाइड अनुमानित विखंडन पुस्तकालय मौजूद नहीं है और मुरोपेप्टाइड पहचान की पुष्टि एक मैनुअल कदम बनी हुई है। हालांकि, जैसे-जैसे पेप्टिडोग्लाइकोमिक विखंडन डेटाबेस विकसित होते हैं और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हो जाते हैं, यह मैनुअल पहचान चरण अनुभाग 3.3.3 और 3.3.4 को समाप्त या अत्यधिक कम करके अधिक स्वचालित और सुलभ हो जाएगा।

एस्चेरिचिया कोलाई में, पीजी में ~ 3.5 x 106 मुरोपेप्टाइड्स प्रति सेल34 होते हैं। क्यूटीओएफ एमएस की पहचान सीमा के भीतर, यहां तक कि सबसे कम प्रचुर मात्रा में मुरोपेप्टाइड अभी भी सेल12 के भीतर एकल मुरोपेप्टाइड की सैकड़ों प्रतियों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इसलिए, यहां तक कि सबसे कम प्रचुर मात्रा में मुरोपेप्टाइड्स में परिवर्तन को समझना सेल के भीतर पीजी-लक्षित एंजाइमों की जैविक गतिविधि में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

जेनिफर गेडेस-मैकएलिस्टर और डॉ एंथनी क्लार्क को इस प्रोटोकॉल को परिष्कृत करने में उनके योगदान के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को सीएमके (पीजेटी 156111) को दिए गए सीआईएचआर से परिचालन अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और ईएमए को दिए गए एनएसईआरसी अलेक्जेंडर ग्राहम बेल सीजीएस डी को BioRender.com को आंकड़े बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) Agilent LC-MS data acquisition
Heating mantle controller, Optichem Fisher 50-401-788 for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL Hemispherical Fisher CG1000008 for 4% SDS boil
Incubator, 37°C for sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40, Fisher CG121805 for 4% SDS boil
Lyophilizer Labconco for lyophilization of sacculi
Magentic stirrer Fisher 90-691-18 for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 Aglient LC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm Fisher 50-197-9573 cleanup of sample before MS injection
Retort stand Fisher 12-000-102 for 4% SDS boil
Retort clamp Fisher S02629 for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrex Fisher 07-250-084 for 4% SDS boil
Sonicator model 120 Fisher FB120 for sacculi purification
Sonicator - micro tip Fisher FB4422 for sacculi purification
Ultracentrifuge Beckman sacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45 Fisher NC9691797 sacculi wash steps
Water supply City for water cooled condenser
Software
Chemdraw Cambridgesoft molecular editor for muropeptide fragmentation prediction
Excel Microsoft viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter Acquisition Aglient running QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professional Aglient bioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager Aglient muropeptide m/z MS database
MassHunter Profinder Aglient recursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysis Aglient viewing MS and MS/MS chromatograms
Prism Graphpad Graphing software
Perseus Max Plank Institute of Biochemistry 1D annotation
Material
Acetonitrile Fisher A998-4
Ammonium acetate Fisher A637
Amylase Sigma-Aldrich A6380
Boric acid Fisher BP168-1
DNase Fisher EN0521
Formic acid Sigma-Aldrich 27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321 Agilent G1969-85000
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 Sigma-Aldrich M9901
Nitrogen gas (>99% purity) Praxair NI 5.0UH-T
Phosphoric acid Fisher A242
Pronase E from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
RNase Fisher EN0531
Sodium azide Fisher S0489
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166
Sodium hydroxide Fisher S318
Sodium Phosphate (dibasic) Fisher S373
Sodium Phosphate (monobasic) Fisher S369
Stains-all Sigma-Aldrich E9379

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References

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