Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Защита клеток миокарда H9c2 от окислительного стресса кроцетином с помощью митофагии, опосредованной путем PINK1 / Parkin

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65105
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

Summary

Основываясь на экспериментах in vitro , это исследование выявило механизм кроцетина в восстановлении окислительного стрессового повреждения кардиомиоцитов путем влияния на митофагию, в которой важную роль играет сигнальный путь PINK1 / Parkin.

Abstract

Это исследование было направлено на изучение окислительного стресс-защитного эффекта кроцетина наH2O2-опосредованные клетки миокарда H9c2 с помощью экспериментов in vitro и дальнейшее изучение того, связан ли его механизм с воздействием митофагии. Это исследование также было направлено на демонстрацию терапевтического эффекта сафлоровой кислоты на окислительный стресс в кардиомиоцитах и изучение того, связан ли ее механизм с эффектом митофагии. Здесь была построена модель окислительного стресса на основе H 2 O2и оценена степень повреждения кардиомиоцитов окислительным стрессом путем определения уровней лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (CK), малонового диальдегида (MDA), супероксиддисмутазы (SOD), каталазы (CAT) и глутатионпероксидазы (GSH Px). Для оценки повреждения митохондрий и апоптоза использовались флуоресцентные красители DCFH-DA, JC-1 и TUNEL, детектирующие активные формы кислорода (АФК). Аутофагический поток измеряли путем трансфицирования аденовируса Ad-mCherry-GFP-LC3B. Затем белки, связанные с митофагией, были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции. Однако кроцетин (0,1-10 мкМ) может значительно улучшить жизнеспособность клеток и уменьшить апоптоз и повреждение окислительным стрессом, вызванноеH2O2. В клетках с чрезмерной аутофагической активацией кроцетин также может уменьшать поток аутофагии и экспрессию связанных с митофагией белков PINK1 и Parkin, а также обращать вспять перенос паркина в митохондрии. Кроцетин может уменьшить H2O2-опосредованное окислительное стрессовое повреждение и апоптоз клеток H9c2, и его механизм был тесно связан с митофагией.

Introduction

Острый инфаркт миокарда (ОИМ) представляет собой опасный для жизни некроз миокарда, вызванный тяжелой и стойкой ишемией и гипоксией коронарных артерий 1,2. Чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) является одной из терапевтических стратегий первой линии при ОИМ и обычно защищает кардиомиоциты от ишемического повреждения 3,4. Дистальный отдел миокарда будет лишен кровоснабжения и снабжения кислородом, если его своевременно и эффективно не лечить после ОИМ, что приводит к ишемическому некрозу и дальнейшим сердечно-сосудистым осложнениям 5,6. Содействие восстановлению кардиомиоцитов и минимизация необратимого повреждения миокарда после упущения возможности хирургического вмешательства ЧКВ было горячей точкой исследований. После ОИМ кардиомиоциты находятся в состоянии ишемии и гипоксии, что приводит к ингибированию митохондриального окислительного фосфорилирования, восстановлению НАД+ до НАДФН и увеличению восстановления одиночных электронов7. В результате неполная реакция восстановления кислорода порождает избыток активных форм кислорода (АФК) и в конечном итоге приводит к повреждению кардиомиоцитов окислительным стрессом8. Чрезмерное накопление АФК вызывает перекисное окисление липидов, еще больше нарушая структуру и функцию митохондриальных мембран. Результатом является непрерывное открытие переходных пор митохондриальной проницаемости и снижение мембранного потенциала митохондрий, индуцируя апоптоз и некроз.

Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), блокаторы ангиотензин-рецепторов (БРА), ингибиторы β-адренорецепторов, антагонисты альдостерона и другие стандартные препараты при ОИМ могут помочь улучшить функцию сердца после инфаркта миокарда и предотвратить возникновение злокачественных событий, таких как аритмии и ремоделирование левого желудочка9. Однако на постинфарктную выживаемость и прогноз сильно влияют размеры инфаркта, и удовлетворительных результатов по снижению апоптоза кардиомиоцитов10,11 достигнуто не было. Таким образом, разработка препаратов, способствующих восстановлению кардиомиоцитов после инфаркта миокарда, стала актуальным вопросом.

Традиционная медицина уже много лет является источником вдохновения для современных фармацевтических исследований12,13,14,15. Традиционная китайская медицина (ТКМ) имеет долгую историю лечения ОИМ, и серия рандомизированных контрольных исследований в последние годы подтвердила, что ТКМ действительно может улучшить прогноз пациентов16,17. Согласно теории ТКМ, ОИМ вызывается застоем крови18,19, поэтому препараты для улучшения кровообращения обычно используются для лечения ОИМ в острой фазе20. Среди них считается, что шафран оказывает мощное влияние на активацию крови и застой и часто используется при остром лечении ОИМ. Кроцетин, основной компонент шафрана, может играть ключевую роль в защите кардиомиоцитов21.

В этом исследовании клетки миокарда H9c2 были индуцированыH2O2 для имитации ишемии / реперфузии миокарда, которая вызывает повреждение кардиомиоцитов ОИМ, а кроцетин использовался в качестве вмешательства для исследования его защитного эффекта против повреждения миокарда, вызванного окислительным стрессом. Механизм защиты кардиомиоцитов кроцетином был дополнительно изучен с помощью митофагии. Что еще более важно, эта статья дает ссылку на технический подход к изучению митофагии и подробно описывает всю экспериментальную процедуру.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты проводились в лаборатории физиологии Пекинского университета китайской медицины, Китай. Все методы исследования были выполнены в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами Пекинского университета.

1. Клеточная культура

  1. Добавьте 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина в модифицированную среду Дульбекко Eagle (DMEM) (с 4,5 г / л D-глюкозы, 4,г/л L-глютамина и 110 мг / л пирувата натрия; см. Таблицу материалов) для получения полной среды DMEM.
  2. Разморозьте замороженные жидким азотом клетки миокарда H9c2 (см. Таблицу материалов) в теплой воде при температуре 37 °C с быстрым и равномерным перемешиванием до тех пор, пока лед не растает.
  3. Перенесите ячейки в центрифужную пробирку и добавьте в четыре раза больше объема полной среды DMEM. Центрифугу при 358 x g в течение 5 мин при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
  4. Полученную клеточную суспензию разбавить питательной средой, осторожно продуть и инокулировать клетки в колбу для культивирования. Культуру в инкубаторе при 37 °С с 5%СО2.

2. Определение жизнеспособности клеток

  1. Растворяют кроцетин (см. Таблицу материалов) в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентраций 0,05 мМ, 0,1 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 50 мМ, 100 мМ и 200 мМ.
  2. Диссоциируют клетки миокарда H9c2 трипсином, затем нейтрализуют смесь полной средой DMEM.
  3. Переложите клетки в центрифужную пробирку и центрифугу при 179 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и смешайте клетки в полной среде DMEM, осторожно продувая.
  4. Подсчитайте клетки с помощью планшета для подсчета клетоккрови 22 (см. Таблицу материалов) и разбавьте их до 5 × 104 клеток /мл с помощью полной среды DMEM.
  5. Разделите ячейки на девять равных частей. Добавьте ДМСО (разбавленный в соотношении 1:1000 с полной средой DMEM) в контрольную группу и добавьте различные концентрации кроцетина в остальные группы в соотношении 1:1000.
  6. Засейте клетки в 96-луночные планшеты по 100 мкл на лунку. Выбрасывают надосадочную жидкость после инкубации в течение 24 ч и трижды промывают клетки PBS.
  7. После добавления 100 мкл базальной среды DMEM инкубируют клетки в течение 4 ч и добавляют 20 мкл MTS (см. Таблицу материалов).
  8. Инкубируйте клетки еще 2 часа, измерьте поглощение на длине волны 490 нм и рассчитайте жизнеспособность клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток = (обработанный OD - пустой OD) / (контроль OD - пустой OD) × 100.

3. Определение лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (КФК), малонового диальдегида (МДА), супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (GSH Px) и каталазы (КАТ)

  1. Засейте клетки H9c2 в 6-луночную пластину с плотностью 1 × 105 клеток. Соберите надосадочную жидкость после вмешательства и определите уровни ЛДГ и СОД в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  2. Соберите надосадочную жидкость и промойте ее фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) один раз. Добавьте клеточный лизат в культуральную чашку и дайте ей постоять на льду в течение 20 минут. Соберите жидкость из чашки для культуры в центрифужную пробирку.
  3. Определяйте уровни CK, MDA, GSH-Px и CAT в соответствии с инструкциямипроизводителя 23 (см. Таблицу материалов и Дополнительный файл 1).
  4. Определите общую концентрацию белка лизиса методом бицинхониновой кислоты (BCA) для коррекции концентрации CK, MDA, GSH-Px и CAT24 (см. Таблицу материалов).

4. Определение АФК

  1. Засейте клетки H9c2 в 48-луночную пластину с плотностью 5 × 103 клеток. Разбавьте DCFH-DA (см. Таблицу материалов) в соотношении 1:1,000 со средой, не содержащей сыворотки. Выбросьте надосадочную жидкость клетки и дважды промойте клетку средой, не содержащей сыворотки.
  2. Добавьте 150 мкл разбавленного DCFH-DA в каждую лунку и инкубируйте при 37 ° C в течение 20 мин. Трижды промойте клетки средой, не содержащей сыворотки, и сделайте снимки под флуоресцентным микроскопом (см. Таблицу материалов).

5. Определение мембранного потенциала митохондрий

  1. Определите потенциал митохондриальной мембраны с помощью набора для анализа потенциала митохондриальной мембраны JC-125 (см. Таблицу материалов). Выбросьте питательную среду и промойте ее один раз средством, не содержащим сыворотки.
  2. Добавьте рабочий раствор JC-1 в каждую пробирку и хорошо перемешайте. Инкубировать при 37 °C в течение 20 мин и дважды промыть клетки резервирующим буфером JC-1. Добавьте полную среду в каждую лунку и сделайте фотографии под флуоресцентным микроскопом.

6. Анализ окрашивания TUNEL

  1. Используйте набор для анализа апоптоза TUNEL (см. Таблицу материалов) для определения частоты апоптоза26. Выбросьте надосадочную жидкость и один раз промойте гранулы средой, не содержащей сыворотки.
  2. Добавьте раствор для фиксации клеток и промойте их PBS один раз после инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин.
  3. Добавьте в каждую лунку по 0,3% тритона-100 и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин. Промойте клетки с помощью PBS дважды. Добавьте рабочий раствор TUNEL и выдерживайте при 37 °C в темноте в течение 60 минут.
  4. Добавьте антифлуоресцентную гашящую герметизирующую таблетку, содержащую 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; см. Таблицу материалов), и сделайте фотографии под флуоресцентным микроскопом.

7. Мониторинг аутофагического потока путем трансфекции аденовируса mCherry GFP-LC3B

  1. Замените половину среды в каждой лунке свежей средой. Добавьте аденовирус Ad-mCherry GFP-LC3B (кратность инфекции [MOI] 2) в питательную среду и добавьте 5 мкг/мл полибрена (см. Таблицу материалов) для повышения эффективности инфекции.
  2. Замените свежую среду через 24 ч и наблюдайте за экспрессией флуоресцентного белка под конфокальным микроскопом.
  3. Культивируют клетки в тех же условиях, что и в секции 1, после подтверждения успешной вирусной инфекции и захватывают изображения под конфокальным микроскопом27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более 20% клеток показали флуоресценцию зеленого флуоресцентного белка (GFP), что указывает на успешную инфекцию.

8. Вестерн-блоттинг

  1. Соберите клетки для экстракции цельного белка и лизируйте их (RIPA, ингибитор протеазы и ингибитор фосфатазы = 100:1:1; см. Таблицу материалов) на льду в течение 30 мин.
  2. Добавьте 5-кратный буфер загрузки белка в образец белка после количественного определения белка и прокипятите образцы в течение 10 минут.
  3. Электрофорезные образцы, содержащие равные количества белка, с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле электрофореза (SDS-PAGE) гели28. Затем перенесите образцы на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF).
  4. Блокировать мембраны PVDF в течение 1 ч 5% сухим обезжиренным молоком и инкубировать с первичным антителом (PINK1, Parkin; см. Таблицу материалов) при 4 °C в течение ночи и вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 ч.
  5. Обнаружение целевых полос с помощью раствора с усиленной хемилюминесценцией (ECL) и системы обнаружения хемилюминесценции. Используйте программное обеспечение Image J для количественной оценки полос с помощью денситометрии28.

9. Обнаружение митохондриальной транслокации Паркина методом иммунофлюоресценции

  1. Наблюдайте за колокализацией паркина с митохондриями путем двойного иммунофлуоресцентного окрашивания. Выбросьте надосадочную жидкость из каждой группы и промойте их три раза PBS.
  2. Зафиксируйте ячейки на 10 мин при комнатной температуре 4% параформальдегидом и добавьте 0,1% тритона-100 в PBS.
  3. Блокировать неживотным блочным раствором (см. Таблицу материалов) в течение 1 ч для предотвращения неспецифического связывания между белками и антителами и снижения фона флуоресценции.
  4. Инкубировать с первичным антителом (Parkin и Tom20; см. Таблицу материалов) при 4 ° C в течение ночи.
  5. Добавить флуоресцентное вторичное антитело (см. Таблицу материалов) и выдержать в темноте в течение 1 ч.
  6. Добавьте DAPI-содержащие таблетки для тушения флуоресценции и сделайте снимки под конфокальным микроскопом.

10. Статистический анализ

  1. Выполняйте статистический анализ с помощью программного обеспечения для построения графиков и анализа (см. Таблицу материалов).
  2. Сравните непрерывные переменные между группами, используя одностороннюю ANOVA. p < 0,05 считался статистически значимым.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Влияние кроцетина на жизнеспособность клеток
Кроцетин в концентрациях 0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 1 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ оказывал значительное пролиферативное действие на клетки, в то время как кроцетин в концентрациях выше 200 мкМ значительно ингибировал пролиферацию клеток H9c2 (рис. 1A). После 4 ч лечения 400 мкМ H 2 O2жизнеспособность клеток значительно снижалась, и кроцетин мог в определенной степени обратить вспять это изменение (рис. 1B). Поскольку не наблюдалось существенной разницы между 10 мкМ и 100 мкМ кроцетином в отношении жизнеспособности H9c2-индуцированныхH2O2, в качестве высокой концентрации был выбран кроцетин 10 мкМ, а в качестве средней и низкой групп доз использовали 1 мкМ и 0,1 мкМ соответственно.

Влияние кроцетина на LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px и CAT в клетках H9c2
После 4 ч лечения 400 мкМ H 2 O2 уровни LDH, CK и MDA заметно увеличились, в то время как уровни SOD, GSH-Px и CAT снизились. Предварительная обработка кроцетином 10 мкМ в течение 24 ч может обратить вспять вышеуказанные изменения и проявляет очевидный дозозависимый эффект. Как препарат положительного контроля, коэнзим Q10 может изменять только уровни CK, MDA и SOD (рис. 2).

Влияние кроцетина на АФК в кардиомиоцитах H9c2
В качестве пустого контроля кардиомиоциты H9c2 почти не экспрессировали АФК. В то же время 400 мкМ H 2 O2в течение 4 часов лечения может заметно повысить уровень АФК, который может быть в некоторой степени обращен вспять с помощью кроцетина 10 мкМ (рис. 3). Результаты флуоресценции показали, что зеленая флуоресценция была очень слабой в нормальной группе. Для сравнения, 400 мкМ H 2 O2в течение 4 часов лечения может усилить зеленый сигнал флуоресценции, и это усиление может быть уменьшено на 10 мкМ кроцетина (рис. 3).

Влияние кроцетина на H2O2-индуцированный мембранный потенциал митохондрий и апоптоз
Окрашивание JC-1 показало больше красной флуоресценции и меньше зеленой флуоресценции в холостой контрольной группе. После 4 часов обработки 400 мкМ H 2 O2 наблюдалось большезеленой флуоресценции и меньше красной флуоресценции, и 10 мкМ кроцетина могли в некоторой степени обратить вспять это изменение (рис. 4A). Результаты окрашивания TUNEL показали, что передача сигналов, связанных с апоптозом, не была обнаружена в пустой контрольной группе, в то время как передача сигналов, связанных с апоптозом, была заметно усилена после 400 мкМ H 2 O2в течение 4 часов лечения, что может быть в некоторой степени обращено вспять с помощью 10 мкМ кроцетина (рис. 4B).

Влияние кроцетина на чрезмерную аутофагию, индуцированную H2O2
Кардиомиоциты H9c2 в холостой контрольной группе не показали явного потока аутофагии. Флуоресценция показала появление точечных желтых пятен в кардиомиоцитах H9c2, предварительно обработанных 400 мкМ H 2O2 в течение 4 часов, что указывает на очевидную чрезмерную активацию аутофагии. Однако это изменение было обращено вспять после предварительной обработки кроцетином 10 мкМ. В контрольной группе вирус Ad-mCherry GFP-LC3B можно было наблюдать только в виде слабого диффузного желтого фона путем флуоресценции. Однако точечные желтые пятна наблюдались после 400 мкМ H 2 O2в течение 4 часов лечения, и это изменение было обращено вспять после предварительной обработки кроцетином 10 мкМ (рис. 5).

Обнаружение кроцетина на экспрессии белков, связанных с митофагией
Результаты вестерн-блоттинга показали, что в контрольной группе уровни экспрессии PINK1 и Parkin были ниже. Через 4 чH2 O2 -стимулированные кардиомиоциты H9c2 уровни экспрессии PINK1 и Parkin увеличивались, в то время как предварительная обработка кроцетином 10 мкМ могла снижать увеличение PINK1 и Parkin (рис. 6).

Выявление влияния кроцетина на транслокацию митохондрий Паркина
Результаты иммунофлуоресценции показали, что красный флуоресцентный сигнал, представляющий Паркин в пустой контрольной группе, был очень слабым; однако после 400 мкМ H 2 O2в течение 4 часов лечения красный флуоресцентный сигнал усиливался, и колокализация с зеленой флуоресценцией, представляющей Tom20, увеличивалась. После предварительной обработки кроцетином 10 мкМ красный флуоресцентный сигнал ослаблялся, а колокализация с зеленым флуоресцентным сигналом уменьшалась (рис. 7).

Figure 1
Рисунок 1: Определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ-анализа. (A) Влияние кроцетина в различных концентрациях на жизнеспособность клеток (n = 6). (B) Влияние кроцетина в различных концентрациях на жизнеспособность клеток после вмешательства H 202 (n = 6). *p < 0,05 по сравнению с контрольной группой, #p < 0,05 по сравнению с группой лечения H 2 O2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Обнаружение уровней LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px и CAT. (A) Уровень ЛДГ в надосадочной жидкости клетки (n = 6). (B) Уровень CK в клеточном лизате (n = 6). (C) Уровень MDA в клеточном лизате (n = 6). (D) Уровень SOD в надосадочной жидкости клетки (n = 6). (E) Уровень GSH-Px в клеточном лизате (n = 6). (F) Уровень CAT в клеточном лизате (n = 6). *p < 0,05 по сравнению с холостой контрольной группой, #p < 0,05 по сравнению с группой лечения H2O2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: ROS, определяемые DCFH-DA. (A) DCFH-DA использовался для измерения уровня АФК в кардиомиоцитах H9c2. ROS: зеленый. (B) Количественные данные АФВ. а) кардиомиоциты H9c2 без лечения. (b) Кардиомиоциты H9c2 стимулировали 400 мкМ H 2 O 2 в течение 4 часов. (c) Клетки H9c2 предварительно обрабатывали 10 мкМ кроцетином в течение 24 часов, а затем стимулировали 400 мкМ H 2 O2в течение 4 часов. Масштабная линейка = 24 мкм. *p < 0,05 по сравнению с холостой контрольной группой, #p < 0,05 по сравнению с группой лечения H2O2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Обнаружение мембранного потенциала митохондрий и апоптоза. (A) Мембранный потенциал митохондрий определяли окрашиванием JC-1. Агрегаты JC-1: красные; Мономеры JC-1: зеленые. (B) Апоптоз был обнаружен путем окрашивания TUNEL в клетках H9c2. TUNEL: зеленый; DAPI: синий. а) кардиомиоциты H9c2 без лечения. (b) Кардиомиоциты H9c2 стимулировали 400 мкМ H 2 O 2 в течение 4 часов. (c) Клетки H9c2 предварительно обрабатывали 10 мкМ кроцетином в течение 24 часов, а затем стимулировали 400 мкМ H 2 O2в течение 4 часов. Масштабные линейки = 72 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Аутофагический поток, обнаруженный аденовирусом mCherry-GFP-LC3B. mCherry: красный; GFP: зеленый. а) кардиомиоциты H9c2 без лечения. (b) Кардиомиоциты H9c2 стимулировали 400 мкМ H 2 O 2 в течение 4 часов. (c) Клетки H9c2 предварительно обрабатывали 10 мкМ кроцетином в течение 24 часов, а затем стимулировали 400 мкМ H 2 O2в течение 4 часов. Масштабные линейки = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Содержание белков, связанных с митофагией, было обнаружено с помощью вестерн-блоттинга. (A) Репрезентативный вестерн-блоттинг, иллюстрирующий экспрессию PINK1 и Parkin. β-актин был принят в качестве внутреннего эталона. (B) Относительное выражение PINK1 (n = 3). (C) Относительная экспрессия Паркина (n = 3). *p < 0,05 по сравнению с контрольной группой, #p < 0,05 по сравнению с H 2 O2в группе лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Обнаружение митохондриальной транслокации Паркина методом двойного иммунофлуоресцентного окрашивания. Красный белок Паркина, меченный флуоресценцией, и зеленый белок Tom20, меченный флуоресценцией. Паркин: красный; Tom20: зеленый; DAPI: синий). а) кардиомиоциты H9c2 без лечения. (b) Кардиомиоциты H9c2 стимулировали 400 мкМ H 2 O 2 в течение 4 часов. (c) Клетки H9c2 предварительно обрабатывали 10 мкМ кроцетином в течение 24 часов, а затем стимулировали 400 мкМ H 2 O2в течение 4 часов. Масштабные линейки = 24 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Рабочие инструкции по анализам LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px и CAT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Исследование эффективных ингредиентов из сложных соединений природных лекарств с помощью передовых технологий было горячей точкой исследований ТКМ29 и может предоставить лабораторные данные для будущей разработки лекарств после проверки. Сафлор является репрезентативным препаратом в лечении «улучшения кровообращения и минимизации застоя крови» и широко используется при лечении инфаркта миокарда30,31. Считается, что шафран обладает аналогичными эффектами сафлора, и его эффект в улучшении кровообращения и устранении застоя крови значительно лучше, чем у сафлора31,32. Кроцетин является одним из основных активных компонентов шафрана33, поэтому он был использован при изучении данного эксперимента.

H2O2может вызывать окислительное стрессовое повреждение кардиомиоцитов и имитировать инфарктное состояние миокарда кардиомиоцитов, что установлено в качестве модели инфаркта миокарда in vitro34. В этом исследовании низкая концентрация кроцетина может способствовать жизнеспособности клеток кардиомиоцитов, что может быть тесно связано с активацией энергетического метаболизма митохондрий. Кроцетин может восстанавливать сниженную жизнеспособность кардиомиоцитов, индуцированнуюH2O2, и оказывает дозозависимое действие, предполагая, что кроцетин может улучшить окислительное стрессовое повреждение кардиомиоцитов. Между тем, кроцетин может эффективно обратить вспять повреждение миокарда и индексы окислительного стресса, вызванные H 2 O2, что еще раз подтверждает его защитный эффект миокарда.

Снижение мембранного потенциала митохондрий является одним из характерных событий на ранних стадиях апоптоза35. Красители JC-1 агрегируются потенциал-зависимым образом в митохондриях. В нормальном митохондриальном матриксе JC-1 образует флуоресцентный полимер красного цвета. Когда потенциал митохондриальной мембраны разрушается, JC-1 испускает зеленую флуоресценцию в виде мономеров36. TUNEL обнаруживает разрывы цепей ядерной ДНК на поздних стадиях апоптоза37. Апоптотические клетки активируют ферменты эндонуклеазы ДНК, которые разрезают геномную ДНК между нуклеосомами, и подвергшийся воздействию 3'-ОН может быть обнаружен с помощью зеленого флуоресцентного зонда, меченного флуоресцеином (FITC), dUTP, катализируемого терминальными дезоксинуклеотидилтрансферазами37. Результаты этого исследования показывают, что потенциал митохондриальной мембраны снизился и апоптоз кардиомиоцитов появился после моделирования Н2О2; Кроцетин в определенной степени может обратить вспять изменения, предполагая, что кроцетин может эффективно ингибировать апоптоз кардиомиоцитов, вызванный окислительным стрессом.

PINK1 / Parkin - это классический путь, который опосредует митофагию38. PINK1 накапливается на внешней митохондриальной мембране после повреждения митохондрий, и паркин рекрутируется для убиквитинирования белка экстрамитохондриальной мембраны, который связывается с рецепторными белками, связанными с аутофагией, с образованием аутофагосом, отмечая возникновение митофагии39,40,4 1. Результаты показывают, что уровни белка PINK1 и Parkin были увеличены в кардиомиоцитах после моделирования H 2 O2, что свидетельствует о чрезмерной аутофагии. После вмешательства кроцетина уровни белка PINK1 и Parkin в кардиомиоцитах, получавших H 2 O2, были в определенной степени изменены, что позволяет предположить, что он может играть терапевтическую роль, ингибируя чрезмерную митохондриальную аутофагию. В этом исследовании кроцетин уменьшал H2O2-индуцированное окислительное повреждение и апоптоз кардиомиоцитов H9c2, и предполагается, что этот эффект может быть достигнут путем воздействия на путь PINK1 / Parkin для ингибирования чрезмерной митофагии.

Этот эксперимент продемонстрировал влияние травяного лиофилизированного порошка на клеточный окислительный стресс и митофагию. Использование аденовируса mCherry-GFP-LC3B для наблюдения за митохондриальной аутофагией было важным шагом в эксперименте. Ключом к успеху этого шага было увеличение скорости заражения клеток, и реагент провирусной инфекции полибрен был добавлен в среду заранее, чтобы значительно повысить эффективность инфекции. Это было достигнуто путем нейтрализации электростатического отталкивания между сиаловой кислотой поверхности клетки и вирусными частицами, тем самым облегчая адсорбцию. Стоит также отметить, что, как относительно безопасный вирус, хотя геном аденовируса не интегрируется в геном клетки-хозяина после заражения и не реплицируется в клетке, он все же потенциально биологически опасен. Поэтому рекомендуется проводить эксперименты в строгом соответствии с нормативными требованиями.

Флуоресцентная маркировка является распространенным методом обнаружения митофагии, но из-за ее низкой специфичности другие органеллы могут быть неправильно мечены и, таким образом, мешать экспериментальным результатам41. По мере того, как технологический прогресс продолжается, мы можем ожидать разработки более точных и надежных флуоресцентных зондов для дальнейшего изучения механизма митофагии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Пекинским фондом естественных наук (No 7202119) и Национальным фондом естественных наук Китая (No 82274380).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin Gibco 2323363
1% Penicillin-streptomycin Sigma V900929
5x protein loading buffer Beijing Pulilai Gene Technology B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus Beyotime C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0513
Animal-free blocking solution CST 15019s
Anti-Parkin antibody Santa Cruz sc-32282
Anti-PINK1 antibody ABclonal A11435
Anti-TOM20 antibody ABclonal A19403
Anti-β-actin  antibody ABclonal AC026
BCA protein assay kit KeyGEN Biotech KGP902
Blood cell counting plate Servicebio WG607
CAT assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A007-1-1
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
CK assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10) Macklin C6129
Crocetin Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9557
DCFH-DA Beyotime S0033S
DMSO Solarbio D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution NCM Biotech P10100
Fetal bovine serum (FBS) Corning-Cellgro 35-081-CV
GraphPad Prism 7.0  https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A005-1-2
H9c2 myocardial cells Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit LABLEAD J22202
LDH assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A020-2-2
MDA assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A003-2-2
Methanol Aladdin A2114057
MTS assay Promega G3581
Perhydrol G-clone CS7730
Phosphatase inhibitor CWBIO CW2383
Polybrene Beyotime C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer Solarbio R0010
SDS-PAGE gels Shanghai Epizyme Biomedical Technology PG112
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder Servicebio G2017-1L
SOD assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A001-2-2
Tris-buffered saline powder Servicebio G0001-2L
Triton X-100 Sigma SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit Beyotime C1086
Tween-20 Solarbio T8220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
  3. Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
  4. Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
  5. Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
  6. Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
  7. Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
  8. La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
  9. De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
  10. Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
  11. Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
  12. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  13. Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
  14. Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
  15. Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
  16. Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
  17. Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  18. Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
  19. Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
  20. Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
  21. Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
  23. Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
  24. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  25. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  26. Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
  27. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  28. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
  29. Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
  30. Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
  31. Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
  32. Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
  33. Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
  34. Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
  35. Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
  36. Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
  37. Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
  38. Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
  39. Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
  40. Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
  41. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).

Tags

Медицина выпуск 195 кроцетин клетки миокарда H9c2 окислительный стресс путь PINK1/Parkin митофагия
Защита клеток миокарда H9c2 от окислительного стресса кроцетином <em>с помощью</em> митофагии, опосредованной путем PINK1 / Parkin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, J., Li, Y. f., Zhang, Y. s.,… More

Chen, J., Li, Y. f., Zhang, Y. s., Du, T. h., Lu, Y., Li, X. y., Guo, S. w. Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy. J. Vis. Exp. (195), e65105, doi:10.3791/65105 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter