JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Bescherming van H9c2 myocardiale cellen tegen oxidatieve stress door crocetine via PINK1 / Parkin Pathway-gemedieerde mitofagie

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/65105
, , , , , ,
1School of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital,Beijing University of Chinese Medicine

Summary

Op basis van in vitro experimenten onthulde deze studie het mechanisme van crocetine bij het repareren van oxidatieve stressschade van cardiomyocyten door mitofagie te beïnvloeden, waarbij de PINK1 / Parkin-signaleringsroute een belangrijke rol speelt.

Abstract

Deze studie was gericht op het onderzoeken van het oxidatieve stressbeschermende effect van crocetine op H 2 O2-gemedieerdeH9c2 myocardiale cellen door middel van in vitro experimenten, en verder onderzoeken of het mechanisme ervan gerelateerd is aan de impact van mitofagie. Deze studie was ook bedoeld om het therapeutische effect van saffloerzuur op oxidatieve stress in cardiomyocyten aan te tonen en te onderzoeken of het mechanisme ervan verband houdt met het effect van mitofagie. Hier werd een opH 2 O2 gebaseerd oxidatief stressmodel geconstrueerd en de mate van oxidatieve stressschade van cardiomyocyten beoordeeld door de niveaus van lactaatdehydrogenase (LDH), creatinekinase (CK), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) en glutathionperoxidase (GSH Px) te detecteren. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) – detecterende fluorescerende kleurstof DCFH-DA, JC-1-kleurstof en TUNEL-kleurstof werden gebruikt om mitochondriale schade en apoptose te beoordelen. Autofagische flux werd gemeten door transfectie Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitofagie-gerelateerde eiwitten werden vervolgens gedetecteerd via western blotting en immunofluorescentie. Crocetine (0,1-10 μM) kan echter de levensvatbaarheid van cellen aanzienlijk verbeteren en apoptose en oxidatieve stressschade veroorzaakt door H 2 O2verminderen. In cellen met overmatige autofagische activering kan crocetine ook de autofagiestroom en de expressie van mitofagie-gerelateerde eiwitten PINK1 en Parkin verminderen en de overdracht van Parkin naar mitochondriën omkeren. Crocetine kon H 2 O2-gemedieerde oxidatieve stressschade en de apoptose van H9c2-cellen verminderen, en het mechanisme was nauw verwant aan mitofagie.

Introduction

Acuut myocardinfarct (AMI) is een levensbedreigende myocardiale necrose veroorzaakt door ernstige en aanhoudende ischemie en hypoxie van kransslagaders 1,2. Percutane coronaire interventie (PCI) is een van de eerstelijns therapeutische strategieën voor AMI en beschermt cardiomyocyten meestal tegen ischemische schade 3,4. Het distale myocard zal geen bloed- en zuurstoftoevoer hebben als het niet snel en effectief wordt behandeld na AMI, wat leidt tot ischemische necrose en verdere cardiovasculaire complicaties 5,6. Het bevorderen van cardiomyocytenherstel en het minimaliseren van onomkeerbare myocardiale schade na het missen van de PCI-chirurgische kans is een onderzoekshotspot geweest. Na AMI bevinden cardiomyocyten zich in een toestand van ischemie en hypoxie, wat resulteert in de remming van mitochondriale oxidatieve fosforylering, reductie van NAD + tot NADPH en verhoogde reductie van één elektron7. Als gevolg hiervan genereert de onvolledige reductiereactie van zuurstof een overmaat aan reactieve zuurstofsoorten (ROS) en leidt uiteindelijk tot oxidatieve stressschade aan cardiomyocyten8. Een overmatige accumulatie van ROS veroorzaakt lipideperoxidatie, waardoor de structuur en functie van mitochondriale membranen verder wordt verstoord. Het resultaat is een continue opening van mitochondriale permeabiliteitsovergangsporiën en een afname van het mitochondriale membraanpotentiaal, waardoor apoptose en necrose worden geïnduceerd.

Angiotensine-converting enzyme (ACE) -remmers, angiotensine-receptorblokkers (ARB’s), de remmers van β-adrenoceptoren, aldosteronantagonisten en andere standaardgeneesmiddelen in AMI kunnen helpen de hartfunctie na een hartinfarct te verbeteren en het optreden van kwaadaardige gebeurtenissen, zoals aritmieën en linkerventrikelremodellering, te voorkomen9. De overleving en prognose na een infarct worden echter sterk beïnvloed door de grootte van het infarct en er zijn geen bevredigende resultaten bereikt voor het verminderen van cardiomyocytenapoptose10,11. Zo is de ontwikkeling van geneesmiddelen om het herstel van cardiomyocyten na een hartinfarct te bevorderen een urgent probleem geworden.

De traditionele geneeskunde is al vele jaren een inspiratiebron voor het moderne farmaceutische onderzoek12,13,14,15. Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft een lange geschiedenis in de behandeling van AMI, en een reeks gerandomiseerde controlestudies in de afgelopen jaren hebben bevestigd dat TCM inderdaad de prognose van patiënten16,17 kan verbeteren. Volgens de TCM-theorie wordt AMI veroorzaakt door bloedstasis18,19, dus geneesmiddelen voor het bevorderen van de bloedcirculatie worden meestal gebruikt voor de behandeling van AMI in de acute fase20. Onder hen wordt aangenomen dat saffraan een krachtig effect heeft op bloedactivering en stasis, en wordt vaak gebruikt bij de acute behandeling van AMI. Crocetine, een belangrijk bestanddeel van saffraan, kan een sleutelrol spelen bij de bescherming van cardiomyocyten21.

In deze studie werden H9c2 myocardiale cellen geïnduceerd door H2 O2 om myocardiale ischemie / reperfusie te simuleren, wat een cardiomyocytenbeschadiging van AMI veroorzaakt, en crocetine werd gebruikt als een interventie om het beschermende effect tegen oxidatieve stress-geïnduceerde myocardiale schade te onderzoeken. Het mechanisme van crocetine dat cardiomyocyten beschermt, werd verder onderzocht door middel van mitofagie. Wat nog belangrijker is, dit artikel biedt een referentie voor de technische benadering van de studie van mitofagie en beschrijft de hele experimentele procedure in detail.

Protocol

De experimenten werden uitgevoerd in het Laboratorium voor Fysiologie aan de Beijing University of Chinese Medicine, China. Alle studiemethoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften van de Universiteit van Beijing. 1. Celkweek Voeg 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine toe aan dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium (DMEM) basismedium (met 4,5 g/l D-glucose, 4,g.g/l L-glutamine en 110 mg/l natriumpyruvaat;…

Representative Results

Effecten van crocetine op de levensvatbaarheid van cellenCrocetine bij 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM en 100 μM had een significant proliferatief effect op cellen, terwijl crocetine bij concentraties boven 200 μM de proliferatie van H9c2-cellen significant remde (figuur 1A). Na 4 uur behandeling met 400 μM H 2 O2was de levensvatbaarheid van de cel aanzienlijk verminderd en kon crocetine deze verandering tot op zekere hoogte omkere…

Discussion

De exploratie van effectieve ingrediënten uit complexe verbindingen van natuurlijke geneesmiddelen door middel van geavanceerde technologie is een hotspot geweest van TCM-onderzoek29 en kan laboratoriumbewijs leveren voor toekomstige medicijnontwikkeling na verificatie. Saffloer is een representatief medicijn bij de behandeling van “het bevorderen van de bloedcirculatie en het minimaliseren van bloedstasis” en wordt veel gebruikt bij de behandeling van een hartinfarct30,31…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door de Beijing Natural Science Foundation (nr. 7202119) en de National Natural Science Foundation of China (nr. 82274380).

Materials

0.25% trypsin Gibco 2323363
1% Penicillin-streptomycin Sigma V900929
5x protein loading buffer Beijing Pulilai Gene Technology B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus Beyotime C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0513
Animal-free blocking solution CST 15019s
Anti-Parkin antibody Santa Cruz sc-32282
Anti-PINK1 antibody ABclonal A11435
Anti-TOM20 antibody ABclonal A19403
Anti-β-actin  antibody ABclonal AC026
BCA protein assay kit KeyGEN Biotech KGP902
Blood cell counting plate Servicebio WG607
CAT assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A007-1-1
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
CK assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10) Macklin C6129
Crocetin Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9557
DCFH-DA Beyotime S0033S
DMSO Solarbio D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution NCM Biotech P10100
Fetal bovine serum (FBS) Corning-Cellgro 35-081-CV
GraphPad Prism 7.0  https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A005-1-2
H9c2 myocardial cells Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit LABLEAD J22202
LDH assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A020-2-2
MDA assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A003-2-2
Methanol Aladdin A2114057
MTS assay Promega G3581
Perhydrol G-clone CS7730
Phosphatase inhibitor CWBIO CW2383
Polybrene Beyotime C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer Solarbio R0010
SDS-PAGE gels Shanghai Epizyme Biomedical Technology PG112
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder Servicebio G2017-1L
SOD assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A001-2-2
Tris-buffered saline powder Servicebio G0001-2L
Triton X-100 Sigma SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit Beyotime C1086
Tween-20 Solarbio T8220
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
  3. Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
  4. Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
  5. Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
  6. Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
  7. Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
  8. La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
  9. De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
  10. Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
  11. Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
  12. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  13. Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
  14. Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
  15. Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
  16. Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
  17. Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  18. Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
  19. Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
  20. Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
  21. Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
  23. Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
  24. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  25. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  26. Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
  27. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  28. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
  29. Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
  30. Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
  31. Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
  32. Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
  33. Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
  34. Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
  35. Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
  36. Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
  37. Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
  38. Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
  39. Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
  40. Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
  41. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).

Tags

H9c2 Myocardial CellsOxidative StressCrocetinPINK1/Parkin PathwayMitophagyROS DetectionMitochondrial Membrane PotentialTUNEL Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chen, J., Li, Y., Zhang, Y., Du, T., Lu, Y., Li, X., Guo, S. Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy. J. Vis. Exp. (195), e65105, doi:10.3791/65105 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image