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Medicine

PINK1/パーキン経路を介したマイトファジー を介した クロセチンによる酸化ストレスからのH9c2心筋細胞の保護

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/65105
, , , , , ,
1School of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital,Beijing University of Chinese Medicine

Summary

本研究では、 クロ セチンが心筋細胞の酸化ストレス損傷を修復するメカニズムを、PINK1/Parkinシグナル伝達経路が重要な役割を果たすマイトファジーに影響を与えることで明らかにしました。

Abstract

この研究は、in vitro実験を通じて、H 2 O2を介したH9c2心筋細胞に対するクロセチンの酸化ストレス保護効果を調査し、そのメカニズムがマイトファジーの影響に関連しているかどうかをさらに調査することを目的としています。この研究はまた、心筋細胞の酸化ストレスに対するベニバナ酸の治療効果を実証し、そのメカニズムがマイトファジーの効果に関連しているかどうかを調べることも目的としています。ここでは、H2O2ベースの酸化ストレスモデルを構築し、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、クレアチンキナーゼ(CK)、マロンジアルデヒド(MDA)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、カタラーゼ(CAT)、およびグルタチオンペルオキシダーゼ(GSH Px)のレベルを検出することにより、心筋細胞の酸化ストレス傷害の程度を評価しました。活性酸素種(ROS)検出蛍光色素DCFH-DA、JC-1色素、およびTUNEL色素を使用して、ミトコンドリアの損傷とアポトーシスを評価しました。オートファジーフラックスは、Ad-mCherry-GFP-LC3Bアデノウイルスをトランスフェクトすることによって測定した。次に、マイトファジー関連タンパク質をウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光法で検出しました。しかしながら、クロセチン(0.1〜10μM)は、細胞生存率を有意に改善し、H 2 O2によって引き起こされるアポトーシスおよび酸化ストレス損傷を減少させる可能性がある。過剰なオートファジー活性化を有する細胞では、クロセチンはオートファジーの流れとマイトファジー関連タンパク質PINK1およびパーキンの発現を減少させ、パーキンのミトコンドリアへの移行を逆転させる可能性がある。クロセチンは、H 2O2を介した酸化ストレス損傷およびH9c2細胞のアポトーシスを減少させることができ、そのメカニズムはマイトファジーと密接に関連していた。

Introduction

急性心筋梗塞(AMI)は、冠状動脈への重度で持続的な虚血と低酸素によって引き起こされる生命を脅かす心筋壊死です1,2。経皮的冠動脈インターベンション(PCI)は、AMIの第一選択治療戦略の1つであり、通常、心筋細胞を虚血性損傷から保護します3,4。遠位心筋は、AMI後に迅速かつ効果的に治療されない場合、血液と酸素の供給が不足し、虚血性壊死とさらなる心血管合併症を引き起こします5,6。心筋細胞の回復を促進し、PCI手術の機会を逃した後の不可逆的な心筋損傷を最小限に抑えることは、研究のホットスポットとなっています。AMI後、心筋細胞は虚血と低酸素状態にあり、その結果、ミトコンドリアの酸化的リン酸化が阻害され、NAD+がNADPHに還元され、単電子還元が増加します7。その結果、酸素の不完全な還元反応は過剰な活性酸素種(ROS)を生成し、最終的には心筋細胞8への酸化ストレス損傷につながる。ROSの過剰な蓄積は脂質過酸化を引き起こし、ミトコンドリア膜の構造と機能をさらに破壊します。その結果、ミトコンドリア透過性遷移孔が連続的に開き、ミトコンドリア膜電位が低下し、アポトーシスとネクローシスが誘発されます。

AMIのアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬(ARB)、βアドレナリン受容体の阻害剤、アルドステロン拮抗薬、およびその他の標準薬は、心筋梗塞後の心機能を高め、不整脈や左心室リモデリングなどの悪性イベントの発生を防ぐのに役立ちます9。しかし、梗塞後の生存率や予後は梗塞の大きさに大きく影響され、心筋細胞のアポトーシスを減少させる上で満足のいく結果は得られていない10,11。このように、心筋梗塞後の心筋細胞回復を促進する薬剤の開発が喫緊の課題となっている。

伝統医学は、長年にわたって現代の製薬研究のインスピレーションの源となっています12,13,14,15。漢方薬(TCM)はAMIの治療に長い歴史があり、近年の一連のランダム化比較試験では、TCMが実際に患者の予後を改善できることが確認されています16,17。TCM理論によれば、AMIはうっ血によって引き起こされるため18,19、血液循環を促進するための薬物は通常、急性期20のAMIの治療に使用されます。その中でもサフランは血液の活性化やうっ滞に強力な効果があると考えられており、AMIの急性期治療によく用いられています。サフランの主成分であるクロセチンは、心筋細胞を保護する上で重要な役割を果たす可能性があります21。

本研究では、AMIの心筋細胞傷害を引き起こす心筋虚血/再灌流を模擬するためにH2O2によってH9c2心筋細胞を誘導し、酸化ストレス誘発性心筋傷害に対するその保護効果を調べるための介入としてクロセチンを使用した。クロセチンが心筋細胞を保護するメカニズムは、マイトファジーを通じてさらに調査されました。さらに重要なことに、この記事では、マイトファジーの研究への技術的アプローチのリファレンスを提供し、実験手順全体を詳細に説明します。

Protocol

実験は、中国の北京中医薬大学の生理学研究室で行われました。すべての研究方法は、北京大学の関連ガイドラインおよび規制に従って実施されました。 1. 細胞培養 10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンをダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)基本培地(4.5 g/L D-グルコース、4.g.g/L L-グルタミン、および110 mg/Lピルビン酸ナトリウムを含む; <st…

Representative Results

細胞生存率に対するクロセチンの影響0.1 μM、0.5 μM、1 μM、5 μM、10 μM、50 μM、および100 μMのクロセチンは細胞に対して有意な増殖効果を示し、200 μMを超える濃度のクロセチンはH9c2細胞の増殖を有意に阻害しました(図1A)。400μM H 2 O2で4時間処理した後、細胞生存率はかなり低下し、クロセチンはこの変化をある程度逆転させることができ…

Discussion

高度な技術による天然薬の複雑な化合物からの効果的な成分の探索は、TCM研究29のホットスポットであり、検証後の将来の医薬品開発のための実験室の証拠を提供することができます。ベニバナは「血行を促進し、うっ血を最小限に抑える」治療における代表的な薬剤であり、心筋梗塞の治療に広く使用されています30,31。サフラ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、北京自然科学基金会(第7202119号)と中国国家自然科学基金会(第82274380号)の支援を受けて行われました。

Materials

0.25% trypsin Gibco 2323363
1% Penicillin-streptomycin Sigma V900929
5x protein loading buffer Beijing Pulilai Gene Technology B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus Beyotime C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0513
Animal-free blocking solution CST 15019s
Anti-Parkin antibody Santa Cruz sc-32282
Anti-PINK1 antibody ABclonal A11435
Anti-TOM20 antibody ABclonal A19403
Anti-β-actin  antibody ABclonal AC026
BCA protein assay kit KeyGEN Biotech KGP902
Blood cell counting plate Servicebio WG607
CAT assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A007-1-1
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
CK assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10) Macklin C6129
Crocetin Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9557
DCFH-DA Beyotime S0033S
DMSO Solarbio D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution NCM Biotech P10100
Fetal bovine serum (FBS) Corning-Cellgro 35-081-CV
GraphPad Prism 7.0  https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A005-1-2
H9c2 myocardial cells Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit LABLEAD J22202
LDH assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A020-2-2
MDA assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A003-2-2
Methanol Aladdin A2114057
MTS assay Promega G3581
Perhydrol G-clone CS7730
Phosphatase inhibitor CWBIO CW2383
Polybrene Beyotime C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer Solarbio R0010
SDS-PAGE gels Shanghai Epizyme Biomedical Technology PG112
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder Servicebio G2017-1L
SOD assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A001-2-2
Tris-buffered saline powder Servicebio G0001-2L
Triton X-100 Sigma SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit Beyotime C1086
Tween-20 Solarbio T8220
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References

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H9c2 Myocardial CellsOxidative StressCrocetinPINK1/Parkin PathwayMitophagyROS DetectionMitochondrial Membrane PotentialTUNEL Assay

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Chen, J., Li, Y., Zhang, Y., Du, T., Lu, Y., Li, X., Guo, S. Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy. J. Vis. Exp. (195), e65105, doi:10.3791/65105 (2023).
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