Summary
本研究では、 クロ セチンが心筋細胞の酸化ストレス損傷を修復するメカニズムを、PINK1/Parkinシグナル伝達経路が重要な役割を果たすマイトファジーに影響を与えることで明らかにしました。
Abstract
この研究は、in vitro実験を通じて、H 2 O2を介したH9c2心筋細胞に対するクロセチンの酸化ストレス保護効果を調査し、そのメカニズムがマイトファジーの影響に関連しているかどうかをさらに調査することを目的としています。この研究はまた、心筋細胞の酸化ストレスに対するベニバナ酸の治療効果を実証し、そのメカニズムがマイトファジーの効果に関連しているかどうかを調べることも目的としています。ここでは、H2O2ベースの酸化ストレスモデルを構築し、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、クレアチンキナーゼ(CK)、マロンジアルデヒド(MDA)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、カタラーゼ(CAT)、およびグルタチオンペルオキシダーゼ(GSH Px)のレベルを検出することにより、心筋細胞の酸化ストレス傷害の程度を評価しました。活性酸素種(ROS)検出蛍光色素DCFH-DA、JC-1色素、およびTUNEL色素を使用して、ミトコンドリアの損傷とアポトーシスを評価しました。オートファジーフラックスは、Ad-mCherry-GFP-LC3Bアデノウイルスをトランスフェクトすることによって測定した。次に、マイトファジー関連タンパク質をウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光法で検出しました。しかしながら、クロセチン(0.1〜10μM)は、細胞生存率を有意に改善し、H 2 O2によって引き起こされるアポトーシスおよび酸化ストレス損傷を減少させる可能性がある。過剰なオートファジー活性化を有する細胞では、クロセチンはオートファジーの流れとマイトファジー関連タンパク質PINK1およびパーキンの発現を減少させ、パーキンのミトコンドリアへの移行を逆転させる可能性がある。クロセチンは、H 2O2を介した酸化ストレス損傷およびH9c2細胞のアポトーシスを減少させることができ、そのメカニズムはマイトファジーと密接に関連していた。
Introduction
急性心筋梗塞(AMI)は、冠状動脈への重度で持続的な虚血と低酸素によって引き起こされる生命を脅かす心筋壊死です1,2。経皮的冠動脈インターベンション(PCI)は、AMIの第一選択治療戦略の1つであり、通常、心筋細胞を虚血性損傷から保護します3,4。遠位心筋は、AMI後に迅速かつ効果的に治療されない場合、血液と酸素の供給が不足し、虚血性壊死とさらなる心血管合併症を引き起こします5,6。心筋細胞の回復を促進し、PCI手術の機会を逃した後の不可逆的な心筋損傷を最小限に抑えることは、研究のホットスポットとなっています。AMI後、心筋細胞は虚血と低酸素状態にあり、その結果、ミトコンドリアの酸化的リン酸化が阻害され、NAD+がNADPHに還元され、単電子還元が増加します7。その結果、酸素の不完全な還元反応は過剰な活性酸素種(ROS)を生成し、最終的には心筋細胞8への酸化ストレス損傷につながる。ROSの過剰な蓄積は脂質過酸化を引き起こし、ミトコンドリア膜の構造と機能をさらに破壊します。その結果、ミトコンドリア透過性遷移孔が連続的に開き、ミトコンドリア膜電位が低下し、アポトーシスとネクローシスが誘発されます。
AMIのアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬(ARB)、βアドレナリン受容体の阻害剤、アルドステロン拮抗薬、およびその他の標準薬は、心筋梗塞後の心機能を高め、不整脈や左心室リモデリングなどの悪性イベントの発生を防ぐのに役立ちます9。しかし、梗塞後の生存率や予後は梗塞の大きさに大きく影響され、心筋細胞のアポトーシスを減少させる上で満足のいく結果は得られていない10,11。このように、心筋梗塞後の心筋細胞回復を促進する薬剤の開発が喫緊の課題となっている。
伝統医学は、長年にわたって現代の製薬研究のインスピレーションの源となっています12,13,14,15。漢方薬(TCM)はAMIの治療に長い歴史があり、近年の一連のランダム化比較試験では、TCMが実際に患者の予後を改善できることが確認されています16,17。TCM理論によれば、AMIはうっ血によって引き起こされるため18,19、血液循環を促進するための薬物は通常、急性期20のAMIの治療に使用されます。その中でもサフランは血液の活性化やうっ滞に強力な効果があると考えられており、AMIの急性期治療によく用いられています。サフランの主成分であるクロセチンは、心筋細胞を保護する上で重要な役割を果たす可能性があります21。
本研究では、AMIの心筋細胞傷害を引き起こす心筋虚血/再灌流を模擬するためにH2O2によってH9c2心筋細胞を誘導し、酸化ストレス誘発性心筋傷害に対するその保護効果を調べるための介入としてクロセチンを使用した。クロセチンが心筋細胞を保護するメカニズムは、マイトファジーを通じてさらに調査されました。さらに重要なことに、この記事では、マイトファジーの研究への技術的アプローチのリファレンスを提供し、実験手順全体を詳細に説明します。
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Protocol
実験は、中国の北京中医薬大学の生理学研究室で行われました。すべての研究方法は、北京大学の関連ガイドラインおよび規制に従って実施されました。
1. 細胞培養
- 10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンをダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)基本培地(4.5 g/L D-グルコース、4.g.g/L L-グルタミン、および110 mg/Lピルビン酸ナトリウムを含む; 材料表を参照)に添加して、DMEM完全培地を調製します。
- 液体窒素凍結H9c2心筋細胞( 材料表を参照)を37°Cの温水で解凍し、氷が溶けるまですばやく均一に攪拌します。
- 細胞を遠沈管に移し、DMEM完全培地の4倍の容量を加えます。358 x g で室温で5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄します。
- 得られた細胞懸濁液を培養液で希釈し、穏やかに吹き、培養フラスコに細胞を接種する。インキュベーター内で37°C、5%CO2で培養する。
2.細胞生存率の決定
- クロセチン( 材料表参照)をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、0.05 mM、0.1 mM、0.5 mM、1 mM、5 mM、10 mM、50 mM、100 mM、および200 mMの濃度にします。
- トリプシンによってH9c2心筋細胞を解離し、次いで混合物をDMEM完全培地で中和する。
- 細胞を遠沈管に移し、179 x g で室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、穏やかに吹き付けることによりDMEM完全培地中の細胞を混合する。
- 血球計数プレート22 ( 材料表を参照)を使用して細胞を計数し、DMEM完全培地で5 × 104 細胞/ mLに希釈します。
- セルを9つの等しい部分に分割します。DMSO(DMEM完全培地で1:1,000の比率に希釈)を対照群に加え、残りの群に1:1,000の比率で異なる濃度のクロセチンを加えます。
- 細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり100 μLで播種します。24時間のインキュベーション後に上清を捨て、細胞をPBSで3回洗浄します。
- 100 μLのDMEM基礎培地を添加した後、細胞を4時間インキュベートし、20 μLのMTSを添加します( 材料表を参照)。
- 細胞をさらに2時間インキュベートし、波長490nmの吸光度を測定し、細胞生存率を計算します。
注:細胞生存率=(OD処理-ODブランク)/(ODコントロール-ODブランク)×100。
3.乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、クレアチンキナーゼ(CK)、マロンジアルデヒド(MDA)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH Px)、およびカタラーゼ(CAT)の測定
- H9c2細胞を6ウェルプレートに1 × 105 細胞の密度で播種します。介入後に上清を収集し、製造元の指示に従ってLDHおよびSODレベルを検出します( 材料表を参照)。
- 上清を採取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で一度洗浄します。細胞ライセートを培養皿に加え、氷の上に20分間放置します。培養皿から遠沈管に液体を採取する。
- 製造元の指示に従って、CK、MDA、GSH-PX、およびCATレベルを検出します23(材料および補足ファイルの表1を参照)。
- ビシンコニン酸(BCA)法により溶解の全タンパク質濃度を検出し、CK、MDA、GSH-PX、およびCAT24の濃度を補正します( 材料表参照)。
4. ROSの測定
- H9c2細胞を48ウェルプレートに5 × 103 細胞の密度で播種します。DCFH-DA( 材料表参照)を無血清培地で1:1,000の比率で希釈します。細胞上清を捨て、無血清培地で細胞を2回洗浄します。
- 150 μLの希釈DCFH-DAを各ウェルに加え、37°Cで20分間インキュベートします。無血清培地で細胞を3回洗浄し、蛍光顕微鏡で画像を撮影します( 材料表を参照)。
5. ミトコンドリア膜電位の検出
- JC-1ミトコンドリア膜電位アッセイキット25 を用いてミトコンドリア膜電位を検出する( 材料表参照)。培養液を廃棄し、無血清培地で一度洗浄します。
- JC-1作業溶液を各チューブに追加し、よく混ぜます。37°Cで20分間インキュベートし、JC-1染色バッファーで細胞を2回洗浄します。各ウェルに完全な培地を添加し、蛍光顕微鏡で写真を撮影します。
6. TUNEL染色アッセイ
- TUNELアポトーシスアッセイキット( 材料表を参照)を使用して、アポトーシス率を測定します26。上清を捨て、ペレットを無血清培地で一度洗浄します。
- 細胞固定液を加え、室温で30分間インキュベートした後、PBSで1回洗浄します。
- 各ウェルに0.3%トリトン-100を加え、室温で5分間インキュベートします。細胞をPBSで2回洗浄します。TUNEL検出作業溶液を加え、暗所で37°Cで60分間インキュベートします。
- 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI; 材料表参照)を含む抗蛍光消光シーリング錠剤を添加し、蛍光顕微鏡で写真を撮影します。
7. mCherry GFP-LC3Bアデノウイルスのトランスフェクションによるオートファジーフローのモニタリング
- 各ウェルの培地の半分を新しい培地と交換します。Ad-mCherry GFP-LC3Bアデノウイルス(感染多重度[MOI]2)を培地に加え、5 μg/mLポリブレン( 材料表参照)を加えて感染効率を向上させます。
- 24時間後に新鮮な培地を交換し、共焦点顕微鏡で蛍光タンパク質の発現を観察します。
- ウイルス感染の成功を確認した後、セクション1と同じ条件で細胞を培養し、共焦点顕微鏡27で画像を撮影する。
注:細胞の20%以上が緑色蛍光タンパク質(GFP)蛍光を示し、感染が成功したことを示しています。
8. ウェスタンブロット解析
- 全タンパク質抽出のために細胞を収集し、氷上で30分間溶解します(RIPA、プロテアーゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤= 100:1:1; 材料表を参照)。
- タンパク質定量後にタンパク質サンプルに5倍タンパク質ローディングバッファーを加え、サンプルを10分間煮沸します。
- 等量のタンパク質を含む試料をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)ゲル28で電気泳動する。次に、サンプルをポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに転写します。
- PVDFメンブレンを5%脱脂粉乳で1時間ブロックし、一次抗体(PINK1、Parkin; 材料表を参照)と4°Cで一晩インキュベートし、二次抗体を室温で1時間インキュベートします。
- 増強化学発光(ECL)溶液と化学発光検出システムを使用して、ターゲットバンドを検出します。Image Jソフトウェアを使用して、デンシトメトリー28でバンドを定量化します。
9. 免疫蛍光法によるパーキンミトコンドリア転座の検出
- パーキンとミトコンドリアの共局在を二重免疫蛍光染色により観察します。各群の細胞上清を捨て、PBSで3回洗浄した。
- 細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、PBSに0.1%トリトン-100を加えます。
- 動物を含まないブロック溶液( 材料表を参照)で1時間ブロックして、タンパク質と抗体間の非特異的結合を防ぎ、蛍光バックグラウンドを低減します。
- 一次抗体(ParkinおよびTom20; 材料表を参照)とともに4°Cで一晩インキュベートします。
- 蛍光二次抗体( 材料表を参照)を添加し、暗所で1時間インキュベートします。
- DAPI含有抗蛍光消光錠剤を添加し、共焦点顕微鏡で画像を撮影します。
10. 統計解析
- グラフ作成および分析ソフトウェアを使用して統計分析を実行します( 材料表を参照)。
- 一元配置分散分析を使用してグループ間で連続変数を比較します。 p < 0.05は統計的に有意であると考えられた。
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Representative Results
細胞生存率に対するクロセチンの影響
0.1 μM、0.5 μM、1 μM、5 μM、10 μM、50 μM、および100 μMのクロセチンは細胞に対して有意な増殖効果を示し、200 μMを超える濃度のクロセチンはH9c2細胞の増殖を有意に阻害しました(図1A)。400μM H 2 O2で4時間処理した後、細胞生存率はかなり低下し、クロセチンはこの変化をある程度逆転させることができた(図1B)。H2O2誘導性H9c2細胞の生存率に10μMと100μMのクロセチンの間に有意差は認められなかったため、10μMのクロセチンを高濃度として選択し、1μMおよび0.1μMをそれぞれ中用量群および低用量群として使用した。
H9c2細胞におけるLDH、CK、MDA、SOD、GSH-PX、およびCATに対するクロセチンの影響
400μMH2O2で4時間処理した後、LDH、CK、およびMDAのレベルは著しく増加したが、SOD、GSH-Px、およびCATのレベルは減少した。10μMクロセチンを24時間前処理すると、上記の変化を逆転させることができ、明らかな用量依存効果が示されます。.ポジティブコントロール薬として、コエンザイムQ10はCK、MDA、およびSODのレベルのみを変化させることができます(図2)。
H9c2心筋細胞のROSに対するクロセチンの効果
ブランクコントロールとして、H9c2心筋細胞はほとんどROSを発現しなかった。同時に、400 μM H 2 O2を4時間処理すると、ROSレベルが著しく向上する可能性があり、10 μMクロセチンによってある程度逆転する可能性があります(図3)。蛍光結果は、緑色蛍光が正常群で非常に弱いことを示した。比較すると、400 μM H 2O2 を 4 時間処理すると、緑色蛍光シグナルが増強され、この増強は 10 μM クロセチンによって減少する可能性があります(図 3)。
H 2 O2誘導性ミトコンドリア膜電位およびアポトーシスに対するクロセチンの影響
JC-1染色は、ブランク対照群でより多くの赤色蛍光とより少ない緑色蛍光を示した。400μMH2O2の4時間処理後、より多くの緑色蛍光およびより少ない赤色蛍光が観察され、10μMクロセチンはこの変化をある程度逆転させることができた(図4A)。TUNEL染色の結果は、ブランク対照群ではアポトーシス関連シグナル伝達が検出されなかったが、アポトーシス関連シグナル伝達は400μMH2O2を4時間処理した後にかなり増強され、10μMクロセチンによってある程度逆転することができた(図4B)。
H2O2誘導性過剰オートファジーに対するクロセチンの効果
ブランク対照群のH9c2心筋細胞は、明らかなオートファジーフローを示さなかった。蛍光は、400μM H 2 O2で4時間前処理したH9c2心筋細胞において点状の黄色の斑点の出現を示し、オートファジーの明らかな過剰活性化を示した。ただし、この変化は10 μMクロセチンの前処理後に逆転しました。対照群では、Ad-mCherry GFP-LC3Bウイルスは、蛍光によって弱いびまん性の黄色の背景としてのみ観察できました。しかし、400 μMH2O2を4時間処理した後、点状の黄色の斑点が観察され、この変化は10 μMクロセチン前処理後に逆転しました(図5)。
マイトファジー関連タンパク質の発現に関するクロセチンの検出
ウェスタンブロットの結果は、対照群において、PINK1およびパーキンの発現レベルが低いことを示した。4時間H2O2刺激H9c2心筋細胞では、PINK1とパーキンの発現レベルが増加し、10μMクロセチン前処理はPINK1とパーキンの増加を減少させることができました(図6)。
パーキンミトコンドリアの転座に対するクロセチンの効果の検出
免疫蛍光の結果は、ブランク対照群のパーキンを表す赤色蛍光シグナルが非常に弱いことを示しました。しかし、400μM H2O2を4時間処理した後、赤色蛍光シグナルが増強され、Tom20を表す緑色蛍光との共局在が増加した。10 μMクロセチンの前処理後、赤色蛍光シグナルは弱まり、緑色蛍光シグナルとの共局在は減少しました(図7)。
図1:MTTアッセイによる細胞生存率の検出。 (A)細胞生存率(n = 6)に対する異なる濃度のクロセチンの影響。(B)H 2 02介入後の細胞生存率に対する異なる濃度のクロセチンの影響(n = 6)。*p < 0.05対対照群、#p < 0.05対H2O2治療群。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:LDH、CK、MDA、SOD、GSH-PX、およびCATレベルの検出。 (a)細胞上清中のLDHレベル(n=6)。(B)細胞ライセート中のCKレベル(n=6)。(C)細胞ライセート中のMDAレベル(n=6)。(d)細胞上清中のSODレベル(n=6)。(E)細胞ライセート中のGSH-Pxレベル(n = 6)。(F)細胞ライセート中のCATレベル(n=6)。*p < 0.05対ブランク対照群、#p < 0.05対H2O2治療群。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DCFH-DAによって決定されたROS。 (A)DCFH-DAを用いて、H9c2心筋細胞のROSレベルを測定した。ロス:緑。(B)ROSの定量データ。(a)無治療のH9c2心筋細胞。(b)H9c2心筋細胞を400μM H2O2で4時間刺激した。 (c)H9c2細胞を10μMクロセチンで24時間前処理し、次いで400μMH2O2で4時間刺激した。スケールバー = 24 μm。 *p < 0.05対ブランク対照群、#p < 0.05対H2O2治療群。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ミトコンドリア膜電位とアポトーシスの検出。 (a)ミトコンドリア膜電位はJC-1染色により測定した。JC-1 アグリゲート: 赤;JC-1モノマー:緑色。(B)アポトーシスは、H9c2細胞におけるTUNEL染色によって検出された。チューネル:緑;ダピ:青。(a)無治療のH9c2心筋細胞。(b)H9c2心筋細胞を400μM H2O2で4時間刺激した。 (c)H9c2細胞を10μMクロセチンで24時間前処理し、次いで400μMH2O2で4時間刺激した。スケールバー = 72 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:mCherry-GFP-LC3Bアデノウイルスによって検出されたオートファジーフラックス。 mチェリー:赤;GFP:緑。(a)無治療のH9c2心筋細胞。(b)H9c2心筋細胞を400μM H2O2で4時間刺激した。 (c)H9c2細胞を10μMクロセチンで24時間前処理し、次いで400μMH2O2で4時間刺激した。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:マイトファジー関連タンパク質の含有量をウェスタンブロッティングにより検出した。 (a)PINK1およびパーキン発現を示す代表的なウェスタンブロット。β-アクチンを内部参照として採用した。(B)相対的なPINK1発現(n=3)。(c)相対的なパーキン発現(n=3)。*p < 0.05対対照群、#p < 0.05対H2O2治療群。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:免疫蛍光二重染色によるパーキンミトコンドリア転座の検出。赤色蛍光標識パーキンタンパク質および緑色蛍光標識-Tom20タンパク質。パーキン:赤;トム20:緑;ダピ:青)。(a)無治療のH9c2心筋細胞。(b)H9c2心筋細胞を400μM H2O2で4時間刺激した。 (c)H9c2細胞を10μMクロセチンで24時間前処理し、次いで400μMH2O2で4時間刺激した。スケールバー = 24 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:LDH、CK、MDA、SOD、GSH-PX、およびCATアッセイの作業手順。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
高度な技術による天然薬の複雑な化合物からの効果的な成分の探索は、TCM研究29のホットスポットであり、検証後の将来の医薬品開発のための実験室の証拠を提供することができます。ベニバナは「血行を促進し、うっ血を最小限に抑える」治療における代表的な薬剤であり、心筋梗塞の治療に広く使用されています30,31。サフランはベニバナと同様の効果があると考えられており、血液循環を促進し、うっ血を取り除く効果はベニバナよりも大幅に優れています31,32。クロセチンはサフラン33の主要な有効成分の1つであるため、この実験の研究に使用されました。
H2O2は、心筋細胞の酸化ストレス傷害を引き起こし、心筋細胞の心筋梗塞状態をシミュレートすることができ、これはインビトロ34で心筋梗塞のモデルとして確立されている。この研究では、低濃度のクロセチンが心筋細胞の細胞生存率を促進する可能性があり、これはミトコンドリアエネルギー代謝の活性化と密接に関連している可能性があります。クロセチンは、H 2 O2によって誘導される心筋細胞の生存率の低下を回復させることができ、用量依存的な効果を有し、クロセチンが心筋細胞の酸化ストレス損傷を改善できることを示唆している。一方、クロセチンは、H 2 O2によって引き起こされる心筋損傷および酸化ストレス指数を効果的に逆転させることができ、その心筋保護効果をさらに確認する。
ミトコンドリア膜電位の低下は、アポトーシスの初期段階における特徴的な事象の1つです35。JC-1色素は、ミトコンドリア内で電位依存的に凝集します。正常なミトコンドリアマトリックスにおいて、JC-1は赤色の蛍光ポリマーを形成する。ミトコンドリア膜電位が破綻すると、JC-1はモノマー36として緑色の蛍光を発する。TUNELは、アポトーシスの後期段階で核DNA鎖切断を検出します37。アポトーシス細胞は、ヌクレオソーム間のゲノムDNAを切断するDNAエンドヌクレアーゼ酵素を活性化し、露出した3'-OHは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって触媒される緑色蛍光プローブフルオレセイン(FITC)標識dUTPで検出できます37。この研究の結果は、ミトコンドリア膜電位が低下し、心筋細胞のアポトーシスがH 2 O2モデリング後に現れたことを示しています。この変化はクロセチンによってある程度逆転する可能性があり、クロセチンが酸化ストレスによって引き起こされる心筋細胞のアポトーシスを効果的に阻害できることを示唆しています。
PINK1 /パーキンは、マイトファジー38を媒介する古典的な経路です。PINK1はミトコンドリア損傷後にミトコンドリア外膜に蓄積し、パーキンはミトコンドリア外膜タンパク質をユビキチン化するために動員され、オートファジー関連受容体タンパク質に結合してオートファゴソームを形成し、マイトファジーの発生をマークします39,40,4 1。結果は、PINK1およびパーキンのタンパク質レベルが、H2O2モデリング後に心筋細胞において増加したことを示し、過剰なオートファジーを示唆している。クロセチンの介入後、H 2 O2で処理した心筋細胞におけるPINK1およびパーキンのタンパク質レベルはある程度逆転し、過剰なミトコンドリアオートファジーを阻害することによって治療的役割を果たし得ることが示唆された。この研究では、クロセチンはH2O2誘発性の酸化的損傷とH9c2心筋細胞のアポトーシスを減少させ、この効果はPINK1 /パーキン経路に影響を与えて過剰なマイトファジーを阻害することによって達成される可能性があると推測されています。
この実験は、細胞の酸化ストレスとマイトファジーに対するハーブ凍結乾燥粉末の介入を実証しました。mCherry-GFP-LC3Bアデノウイルスを使用してミトコンドリアのオートファジーを観察することは、実験の重要なステップでした。このステップの成功の鍵は、細胞の感染率を高めることであり、プロウイルス感染試薬ポリブレンを事前に培地に添加して、感染効率を大幅に高めました。これは、細胞表面のシアル酸とウイルス粒子との間の静電反発力を中和し、吸着を促進することによって達成された。比較的安全なウイルスとして、アデノウイルスゲノムは感染後に宿主細胞ゲノムに組み込まれず、細胞内で複製されませんが、それでも潜在的に生物学的に危険であることも注目に値します。したがって、規制要件に厳密に準拠した状態で実験を実施することをお勧めします。
蛍光標識はマイトファジーを検出するための一般的な方法ですが、その特異性が低いため、他の細胞小器官が誤って標識され、実験結果を妨げる可能性があります4 1。技術の進歩が進むにつれて、マイトファジーのメカニズムをさらに探求するための、より正確で信頼性の高い蛍光プローブの開発が期待できます。
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Disclosures
著者には、宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
本研究は、北京自然科学基金会(第7202119号)と中国国家自然科学基金会(第82274380号)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
References
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