Summary
Basierend auf in vitro Experimenten enthüllte diese Studie den Mechanismus von Crocetin bei der Reparatur von oxidativen Stressschäden von Kardiomyozyten durch Beeinflussung der Mitophagie, bei der der PINK1/Parkin-Signalweg eine wichtige Rolle spielt.
Abstract
Ziel dieser Studie war es, die oxidative stressschützende Wirkung von Crocetin auf H2O2-vermittelte H9c2-Myokardzellen durch in vitro Experimente zu untersuchen und weiter zu untersuchen, ob sein Mechanismus mit dem Einfluss der Mitophagie zusammenhängt. Diese Studie zielte auch darauf ab, die therapeutische Wirkung von Distelsäure auf oxidativen Stress in Kardiomyozyten zu demonstrieren und zu untersuchen, ob ihr Mechanismus mit der Wirkung der Mitophagie zusammenhängt. In dieser Arbeit wurde ein H2O2-basiertes Modell für oxidativen Stress konstruiert und der Grad der oxidativen Stressschädigung von Kardiomyozyten durch Detektion der Konzentrationen von Laktatdehydrogenase (LDH), Kreatinkinase (CK), Malondialdehyd (MDA), Superoxiddismutase (SOD), Katalase (CAT) und Glutathionperoxidase (GSH Px) bewertet. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS)-detektierende Fluoreszenzfarbstoffe DCFH-DA, JC-1 und TUNEL-Farbstoffe wurden verwendet, um mitochondriale Schäden und Apoptose zu beurteilen. Der autophagische Fluss wurde durch Transfizierung des Ad-mCherry-GFP-LC3B-Adenovirus gemessen. Mitophagie-verwandte Proteine wurden dann mittels Western Blot und Immunfluoreszenz nachgewiesen. Crocetin (0,1-10 μM) könnte jedoch die Lebensfähigkeit der Zellen signifikant verbessern und die Apoptose und die durchH2O2verursachten Schäden durch oxidativen Stress reduzieren. In Zellen mit übermäßiger autophagischer Aktivierung könnte Crocetin auch den Autophagiefluss und die Expression der Mitophagie-verwandten Proteine PINK1 und Parkin reduzieren und den Transfer von Parkin in die Mitochondrien umkehren. Crocetin konnte H2O2-vermittelte oxidative Stressschäden und die Apoptose von H9c2-Zellen reduzieren, und sein Mechanismus war eng mit der Mitophagie verbunden.
Introduction
Der akute Myokardinfarkt (AMI) ist eine lebensbedrohliche Myokardnekrose, die durch eine schwere und anhaltende Ischämie und Hypoxie der Koronararterien verursacht wird 1,2. Die perkutane Koronarintervention (PCI) ist eine der ersten Therapiestrategien bei AMI und schützt die Kardiomyozyten in der Regel vor ischämischen Schäden 3,4. Dem distalen Myokard fehlt es an Blut- und Sauerstoffversorgung, wenn es nicht umgehend und effektiv nach AMI behandelt wird, was zu ischämischen Nekrosen und weiteren kardiovaskulären Komplikationen führt 5,6. Die Förderung der Erholung von Kardiomyozyten und die Minimierung irreversibler Myokardschäden nach verpasster PCI-Chirurgie war ein Forschungsschwerpunkt. Nach AMI befinden sich die Kardiomyozyten in einem Zustand der Ischämie und Hypoxie, was zu einer Hemmung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung, einer Reduktion von NAD+ zu NADPH und einer verstärkten Einzelelektronenreduktion führt7. Infolgedessen erzeugt die unvollständige Reduktionsreaktion von Sauerstoff einen Überschuss an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und führt schließlich zu einer Schädigung der Kardiomyozyten durch oxidativen Stress8. Eine übermäßige Anhäufung von ROS löst eine Lipidperoxidation aus, die die Struktur und Funktion der mitochondrialen Membranen weiter stört. Das Ergebnis ist eine kontinuierliche Öffnung der Übergangsporen der mitochondrialen Permeabilität und eine Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials, was Apoptose und Nekrose induziert.
ACE-Hemmer (Angiotensin-Converting-Enzyme), Angiotensin-Rezeptor-Blocker (ARBs), die Inhibitoren von β-Adrenozeptoren, Aldosteron-Antagonisten und andere Standardmedikamente bei AMI können dazu beitragen, die Herzfunktion nach einem Myokardinfarkt zu verbessern und das Auftreten bösartiger Ereignisse wie Arrhythmien und linksventrikuläres Remodeling zu verhindern9. Das Überleben und die Prognose nach einem Infarkt werden jedoch stark von der Infarktgröße beeinflusst, und es wurden keine zufriedenstellenden Ergebnisse zur Verringerung der Apoptose von Kardiomyozyten erzielt10,11. Daher ist die Entwicklung von Medikamenten zur Förderung der Erholung von Kardiomyozyten nach einem Myokardinfarkt zu einem dringenden Thema geworden.
Die traditionelle Medizin ist seit vielen Jahren eine Inspirationsquelle für die moderne pharmazeutische Forschung12,13,14,15. Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) hat eine lange Geschichte in der Behandlung von AMI, und eine Reihe von randomisierten kontrollierten Studien in den letzten Jahren hat bestätigt, dass TCM tatsächlich die Prognose von Patienten verbessern kann16,17. Nach der TCM-Theorie wird AMI durch Blutstauungverursacht 18,19, daher werden zur Behandlung von AMI in der akuten Phase20 in der Regel durchblutungsfördernde Medikamente eingesetzt. Unter ihnen wird angenommen, dass Safran eine starke Wirkung auf die Blutaktivierung und -stase hat und häufig bei der Akutbehandlung von AMI eingesetzt wird. Crocetin, ein Hauptbestandteil von Safran, könnte eine Schlüsselrolle beim Schutz von Kardiomyozyten spielen21.
In dieser Studie wurden H9c2-Myokardzellen durchH2O2induziert, um eine myokardiale Ischämie/Reperfusion zu simulieren, die eine Kardiomyozytenschädigung der AMI verursacht, und Crocetin wurde als Intervention verwendet, um seine schützende Wirkung gegen oxidativen Stress induzierte Myokardschädigung zu untersuchen. Der Mechanismus, den Crocetin vor Kardiomyozyten schützt, wurde durch Mitophagie weiter erforscht. Noch wichtiger ist, dass dieser Artikel eine Referenz für den technischen Ansatz zur Untersuchung der Mitophagie bietet und den gesamten experimentellen Ablauf im Detail beschreibt.
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Protocol
Die Experimente wurden im Labor für Physiologie der Pekinger Universität für Chinesische Medizin, China, durchgeführt. Alle Studienmethoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften der Universität Peking durchgeführt.
1. Zellkultur
- Fügen Sie 10 % fötales Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin dem modifizierten Basismedium Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco (mit 4,5 g/l D-Glucose, 4 g/l L-Glutamin und 110 mg/l Natriumpyruvat; siehe Materialtabelle) hinzu, um ein DMEM-Komplettmedium herzustellen.
- Tauen Sie die mit flüssigem Stickstoff gefrorenen H9c2-Myokardzellen (siehe Materialtabelle) in warmem Wasser bei 37 °C unter schnellem und gleichmäßigem Rühren auf, bis das Eis schmilzt.
- Übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und fügen Sie das vierfache Volumen des DMEM-Komplettmediums hinzu. Bei 358 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen.
- Verdünnen Sie die erhaltene Zellsuspension mit Nährmedium, blasen Sie vorsichtig und beimpfen Sie die Zellen in einem Kulturkolben. Kultivierung im Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2.
2. Bestimmung der Zellviabilität
- Crocetin (siehe Materialtabelle) in Dimethylsulfoxid (DMSO) in Konzentrationen von 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM und 200 mM lösen.
- Dissoziieren Sie die H9c2-Myokardzellen mit Trypsin und neutralisieren Sie dann das Gemisch mit DMEM-Komplettmedium.
- Übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 179 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und mischen Sie die Zellen durch leichtes Blasen in DMEM-Komplettmedium.
- Zählen Sie die Zellen mit einer Blutzellzählplatte22 (siehe Materialtabelle) und verdünnen Sie sie auf 5 × 104 Zellen/ml mit DMEM-Vollmedium.
- Teilen Sie die Zellen in neun gleiche Portionen. Fügen Sie der Kontrollgruppe DMSO (verdünnt im Verhältnis 1:1.000 mit DMEM-Komplettmedium) hinzu und fügen Sie den übrigen Gruppen verschiedene Konzentrationen von Crocetin im Verhältnis 1:1.000 hinzu.
- Säen Sie die Zellen in 96-Well-Platten mit 100 μl pro Well. Verwerfen Sie den Überstand nach einer Inkubationszeit von 24 h und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
- Nach Zugabe von 100 μl DMEM-Basalmedium werden die Zellen 4 h lang inkubiert und 20 μl MTS zugegeben (siehe Materialtabelle).
- Inkubieren Sie die Zellen für weitere 2 Stunden, messen Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 490 nm und berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen.
HINWEIS: Zellviabilität = (OD behandelt - OD blank) / (OD control - OD blank) × 100.
3. Bestimmung von Laktatdehydrogenase (LDH), Kreatinkinase (CK), Malondialdehyd (MDA), Superoxiddismutase (SOD), Glutathionperoxidase (GSH Px) und Katalase (CAT)
- Die H9c2-Zellen werden in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen ausgesät. Sammeln Sie den Überstand nach dem Eingriff und ermitteln Sie die LDH- und SOD-Werte gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
- Sammeln Sie den Überstand und waschen Sie ihn einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Geben Sie das Zelllysat in die Kulturschale und lassen Sie es 20 Minuten auf Eis ruhen. Sammeln Sie die Flüssigkeit aus der Kulturschale in ein Zentrifugenröhrchen.
- CK-, MDA-, GSH-Px- und CAT-Werte gemäß den Anweisungen des Herstellerserkennen 23 (siehe Materialverzeichnis und Zusatzdatei 1).
- Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration der Lyse mit der Bicinchoninsäure (BCA)-Methode, um die Konzentration von CK, MDA, GSH-Px und CAT24 zu korrigieren (siehe Materialtabelle).
4. Bestimmung der ROS
- Säen Sie die H9c2-Zellen in einer 48-Well-Platte mit einer Dichte von 5 × 103 Zellen. DCFH-DA (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:1.000 mit dem serumfreien Medium verdünnen. Entsorgen Sie den Zellüberstand und waschen Sie die Zelle zweimal mit einem serumfreien Medium.
- In jede Vertiefung werden 150 μl verdünntes DCFH-DA gegeben und 20 min bei 37 °C inkubiert. Waschen Sie die Zellen dreimal mit einem serumfreien Medium und nehmen Sie die Bilder unter einem Fluoreszenzmikroskop auf (siehe Materialtabelle).
5. Nachweis des mitochondrialen Membranpotentials
- Nachweis des mitochondrialen Membranpotentials mit einem JC-1 mitochondrialen Membranpotential-Assay-Kit25 (siehe Materialtabelle). Entsorgen Sie das Nährmedium und waschen Sie sie einmal mit serumfreiem Medium.
- Geben Sie JC-1 Arbeitslösung in jedes Röhrchen und mischen Sie sie gut. 20 min bei 37 °C inkubieren und die Zellen zweimal mit JC-1 Färbepuffer waschen. Fügen Sie jedem Well ein komplettes Medium hinzu und nehmen Sie Fotos unter einem Fluoreszenzmikroskop auf.
6. TUNEL-Färbetest
- Verwenden Sie ein TUNEL-Apoptose-Assay-Kit (siehe Materialtabelle), um die Apoptoseratenzu bestimmen 26. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet einmal mit serumfreiem Medium.
- Fügen Sie Zellfixierlösung hinzu und waschen Sie sie einmal mit PBS, nachdem sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden.
- 0,3 % Triton-100 in jede Vertiefung geben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. TUNEL-Detektionsarbeitslösung zugeben und bei 37 °C im Dunkeln 60 min inkubieren.
- Fügen Sie eine Anti-Fluoreszenz-Löschversiegelungstablette hinzu, die 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; siehe Materialtabelle) enthält, und nehmen Sie Fotos unter einem Fluoreszenzmikroskop auf.
7. Überwachung des autophagischen Flusses durch Transfektion des Adenovirus mCherry GFP-LC3B
- Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums in jeder Vertiefung durch frisches Medium. Ad-mCherry GFP-LC3B Adenovirus (Multiplizität der Infektion [MOI] von 2) in das Nährmedium geben und 5 μg/ml Polybren (siehe Materialtabelle) zugeben, um die Infektionseffizienz zu verbessern.
- Ersetzen Sie das frische Medium nach 24 h und beobachten Sie die Expression des fluoreszierenden Proteins unter einem konfokalen Mikroskop.
- Kultur der Zellen unter den gleichen Bedingungen wie in Abschnitt 1 nach Bestätigung der erfolgreichen Virusinfektion und Aufnahme von Bildern unter dem konfokalen Mikroskop27.
HINWEIS: Mehr als 20 % der Zellen zeigten eine Fluoreszenz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), was auf eine erfolgreiche Infektion hinweist.
8. Western-Blot-Analyse
- Sammeln Sie Zellen für die Extraktion des gesamten Proteins und lysieren Sie sie (RIPA, Proteasehemmer und Phosphatase-Inhibitor = 100:1:1; siehe Materialtabelle) 30 Minuten lang auf Eis.
- Fügen Sie der Proteinprobe nach der Proteinquantifizierung 5x Proteinbeladungspuffer hinzu und kochen Sie die Proben 10 Minuten lang.
- Elektrophoresieren Sie die Proben, die gleiche Mengen an Protein enthalten, mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gelelektrophoresegelen (SDS-PAGE)28. Anschließend werden die Proben auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen übertragen.
- Die PVDF-Membranen werden für 1 h mit 5%igem Magermilchpulver blockiert und mit dem Primärantikörper (PINK1, Parkin; siehe Materialtabelle) bei 4 °C über Nacht und dem Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert.
- Erkennen Sie die Zielbanden mit der verbesserten Chemilumineszenzlösung (ECL) und dem Chemilumineszenz-Detektionssystem. Verwenden Sie die Software Image J, um die Banden über die Densitometrie28 zu quantifizieren.
9. Nachweis der mitochondrialen Translokation von Parkin durch Immunfluoreszenz
- Beobachten Sie die Kolokalisation von Parkin mit Mitochondrien durch doppelte Immunfluoreszenzfärbung. Entsorgen Sie den Zellüberstand aus jeder Gruppe und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
- Fixieren Sie die Zellen für 10 min bei Raumtemperatur mit 4% Paraformaldehyd und fügen Sie 0,1% Triton-100 in PBS hinzu.
- Blockieren Sie mit tierversuchsfreier Blocklösung (siehe Materialtabelle) für 1 h, um eine unspezifische Bindung zwischen Proteinen und Antikörpern zu verhindern und den Fluoreszenzhintergrund zu reduzieren.
- Mit einem Primärantikörper (Parkin und Tom20; siehe Materialtabelle) bei 4 °C über Nacht inkubieren.
- Einen fluoreszierenden Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) zugeben und 1 h im Dunkeln inkubieren.
- Fügen Sie die DAPI-haltigen Anti-Fluoreszenz-Löschtabletten hinzu und nehmen Sie Bilder unter dem konfokalen Mikroskop auf.
10. Statistische Analyse
- Führen Sie statistische Analysen mit Hilfe von Grafik- und Analysesoftware durch (siehe Materialtabelle).
- Vergleichen Sie kontinuierliche Variablen zwischen Gruppen mithilfe der einfaktoriellen ANOVA. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
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Representative Results
Auswirkungen von Crocetin auf die Lebensfähigkeit der Zellen
Crocetin in 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM und 100 μM hatte eine signifikante proliferative Wirkung auf die Zellen, während Crocetin in Konzentrationen über 200 μM die Proliferation von H9c2-Zellen signifikant hemmte (Abbildung 1A). Nach 4 h Behandlung mit 400 μMH2O2war die Zellviabilität deutlich reduziert, und Crocetin konnte diese Veränderung bis zu einem gewissen Grad rückgängig machen (Abbildung 1B). Da kein signifikanter Unterschied zwischen 10 μM und 100 μM Crocetin in Bezug auf die H2O2-induzierte H9c2-Zellviabilität beobachtet wurde, wurden 10 μM Crocetin als hohe Konzentration und 1 μM und 0,1 μM als mittlere bzw. niedrige Dosisgruppen verwendet.
Wirkungen von Crocetin auf LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px und CAT in H9c2-Zellen
Nach 4-stündiger Behandlung mit 400 μMH2O2stiegen die LDH-, CK- und MDA-Spiegel merklich an, während die Spiegel von SOD, GSH-Px und CAT abnahmen. Die Vorbehandlung mit 10 μM Crocetin für 24 h kann die oben genannten Veränderungen rückgängig machen und zeigt einen offensichtlichen dosisabhängigen Effekt. Als Positivkontrollmedikament kann Coenzym Q10 nur die Spiegel von CK, MDA und SOD verändern (Abbildung 2).
Die Wirkung von Crocetin auf ROS in H9c2-Kardiomyozyten
Als Blindkontrolle exprimierten H9c2-Kardiomyozyten fast kein ROS. Gleichzeitig könnten 400 μMH2O2für eine 4-stündige Behandlung den ROS-Spiegel deutlich erhöhen, der durch 10 μM Crocetin bis zu einem gewissen Grad rückgängig gemacht werden kann (Abbildung 3). Die Fluoreszenzergebnisse zeigten, dass die grüne Fluoreszenz in der Normalgruppe sehr schwach war. Im Vergleich dazu konnten 400 μM H2 O2 für eine 4-stündige Behandlung das grüne Fluoreszenzsignal verstärken, und diese Verbesserung konnte um 10 μM Crocetin reduziert werden (Abbildung 3).
Wirkungen von Crocetin auf das H2O2-induzierte mitochondriale Membranpotential und die Apoptose
Die JC-1-Färbung zeigte mehr rote Fluoreszenz und weniger grüne Fluoreszenz in der Blindkontrollgruppe. Nach 4-stündiger Behandlung mit 400 μMH2O2wurde mehr grüne Fluoreszenz und weniger rote Fluoreszenz beobachtet, und 10 μM Crocetin konnten diese Veränderung bis zu einem gewissen Grad umkehren (Abbildung 4A). Die TUNEL-Färbeergebnisse zeigten, dass in der Blindkontrollgruppe keine Apoptose-bezogene Signaltransduktion nachgewiesen wurde, während die Apoptose-bezogene Signaltransduktion nach 400 μMH2O2für 4 h Behandlung deutlich verstärkt war, was durch 10 μM Crocetin bis zu einem gewissen Grad rückgängig gemacht werden konnte (Abbildung 4B).
Wirkungen von Crocetin auf H2O2-induzierte exzessive Autophagie
H9c2-Kardiomyozyten in der Blind-Kontrollgruppe zeigten keinen offensichtlichen Autophagiefluss. Die Fluoreszenz zeigte das Auftreten von punktförmigen gelben Flecken in H9c2-Kardiomyozyten, die 4 h lang mit 400 μMH2O2vorbehandelt wurden, was auf eine offensichtliche Überaktivierung der Autophagie hindeutet. Diese Veränderung wurde jedoch nach der 10 μM Crocetin-Vorbehandlung rückgängig gemacht. In der Kontrollgruppe konnte das Ad-mCherry GFP-LC3B-Virus nur als schwacher diffuser gelber Hintergrund durch Fluoreszenz beobachtet werden. Allerdings wurden nach 400 μMH2O2für 4 h Behandlung punktförmige gelbe Flecken beobachtet, und diese Veränderung wurde nach der 10 μM Crocetin-Vorbehandlung rückgängig gemacht (Abbildung 5).
Nachweis von Crocetin bei der Expression von Mitophagie-verwandten Proteinen
Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass in der Kontrollgruppe die Expressionsniveaus von PINK1 und Parkin niedriger waren. In 4 h H2 O 2-stimulierten H9c2-Kardiomyozyten stiegen die Expressionsniveaus von PINK1 und Parkin an, während die 10 μM Crocetin-Vorbehandlung den Anstieg von PINK1 und Parkin reduzieren konnte (Abbildung 6).
Nachweis der Wirkung von Crocetin auf die Translokation von Parkin-Mitochondrien
Die Immunfluoreszenzergebnisse zeigten, dass das rote Fluoreszenzsignal, das Parkin in der Blindkontrollgruppe repräsentierte, sehr schwach war; Nach 400 μM H2O2 für 4 h Behandlung war das rote Fluoreszenzsignal jedoch verstärkt und die Kolokalisation mit der grünen Fluoreszenz, dieTom20repräsentierte, nahm zu. Nach der Vorbehandlung mit 10 μM Crocetin wurde das rote Fluoreszenzsignal abgeschwächt und die Kolokalisation mit dem grünen Fluoreszenzsignal verringert (Abbildung 7).
Abbildung 1: Nachweis der Zellviabilität durch den MTT-Assay. (A) Auswirkungen von Crocetin in verschiedenen Konzentrationen auf die Zellviabilität (n = 6). (B) Auswirkungen von Crocetin in unterschiedlichen Konzentrationen auf die Zellviabilität nachH 2 02 Intervention (n = 6). *p < 0,05 gegenüber der Kontrollgruppe, #p < 0,05 gegenüber der H2O2-Behandlungsgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Nachweis von LDH-, CK-, MDA-, SOD-, GSH-Px- und CAT-Spiegeln. (A) LDH-Spiegel im Zellüberstand (n = 6). (B) CK-Spiegel im Zelllysat (n = 6). (C) MDA-Gehalt im Zelllysat (n = 6). (D) SOD-Gehalt im Zellüberstand (n = 6). (E) GSH-Px-Gehalt im Zelllysat (n = 6). (F) CAT-Gehalt im Zelllysat (n = 6). *p < 0,05 im Vergleich zur Blind-Kontrollgruppe, #p < 0,05 im Vergleich zur H2-O2-Behandlungsgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: ROS, bestimmt durch DCFH-DA. (A) DCFH-DA wurde zur Messung des ROS-Spiegels in H9c2-Kardiomyozyten verwendet. ROS: grün. (B) Quantifizierungsdaten von ROS. (a) H9c2-Kardiomyozyten ohne Behandlung. (b) H9c2-Kardiomyozyten, die mit 400 μM H2O2 für 4 h stimuliert wurden. (c) H9c2-Zellen, die 24 h lang mit 10 μM Crocetin vorbehandelt und dann 4 h lang mit 400 μMH2O2stimuliertwurden. Maßstabsbalken = 24 μm. *p < 0,05 gegenüber der Blind-Kontrollgruppe, #p < 0,05 gegenüber der H2-O2-Behandlungsgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Nachweis des mitochondrialen Membranpotentials und der Apoptose. (A) Das mitochondriale Membranpotential wurde durch JC-1-Färbung bestimmt. JC-1 Aggregate: rot; JC-1-Monomere: grün. (B) Apoptose wurde durch TUNEL-Färbung in H9c2-Zellen nachgewiesen. TUNEL: grün; DAPI: blau. (a) H9c2-Kardiomyozyten ohne Behandlung. (b) H9c2-Kardiomyozyten, die mit 400 μM H2O2 für 4 h stimuliert wurden. (c) H9c2-Zellen, die 24 h lang mit 10 μM Crocetin vorbehandelt und dann 4 h lang mit 400 μMH2O2stimuliertwurden. Maßstabsbalken = 72 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Autophagischer Fluss, nachgewiesen durch mCherry-GFP-LC3B-Adenovirus. mCherry: rot; GFP: grün. (a) H9c2-Kardiomyozyten ohne Behandlung. (b) H9c2-Kardiomyozyten, die mit 400 μM H2O2 für 4 h stimuliert wurden. (c) H9c2-Zellen, die 24 h lang mit 10 μM Crocetin vorbehandelt und dann 4 h lang mit 400 μMH2O2stimuliertwurden. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Der Gehalt an Mitophagie-verwandten Proteinen wurde mittels Western Blot nachgewiesen. (A) Repräsentativer Western-Blot, der die Expression von PINK1 und Parkin veranschaulicht. β-Aktin wurde als interne Referenz übernommen. (B) Relative PINK1-Expression (n = 3). (C) Relativer Parkin-Ausdruck (n = 3). *p < 0,05 gegenüber der Kontrollgruppe, #p < 0,05 gegenüber der H2O2-Behandlungsgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Nachweis der mitochondrialen Translokation von Parkin durch Immunfluoreszenz-Doppelfärbung. Rot fluoreszenzmarkiertes Parkin-Protein und grün fluoreszenzmarkiertes Tom20-Protein. Parkin: rot; Tom20: grün; DAPI: blau). (a) H9c2-Kardiomyozyten ohne Behandlung. (b) H9c2-Kardiomyozyten, die mit 400 μM H2O2 für 4 h stimuliert wurden. (c) H9c2-Zellen, die 24 h lang mit 10 μM Crocetin vorbehandelt und dann 4 h lang mit 400 μMH2O2stimuliertwurden. Maßstabsbalken = 24 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Datei 1: Die Arbeitsanweisungen von LDH-, CK-, MDA-, SOD-, GSH-Px- und CAT-Assays. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Erforschung wirksamer Inhaltsstoffe aus komplexen Verbindungen natürlicher Arzneimittel durch fortschrittliche Technologie ist ein Hotspot der TCM-Forschung29 und kann nach der Verifizierung Laborbeweise für die zukünftige Arzneimittelentwicklung liefern. Distel ist ein repräsentatives Medikament bei der Behandlung von "Förderung der Durchblutung und Minimierung von Blutstau" und wird häufig bei der Behandlung von Myokardinfarkt eingesetzt30,31. Es wird angenommen, dass Safran ähnliche Wirkungen wie Färberdistel hat, und seine Wirkung bei der Förderung der Durchblutung und der Beseitigung von Blutstau ist deutlich besser als bei Färberdistel31,32. Crocetin ist einer der Hauptwirkstoffe von Safran33 und wurde daher in der Studie dieses Experiments verwendet.
H2O2kann eine oxidative Stressschädigung von Kardiomyozyten verursachen und den Myokardinfarktzustand von Kardiomyozyten simulieren, der als Modell des Myokardinfarkts in vitro etabliert ist 34. In dieser Studie könnte eine niedrige Konzentration von Crocetin die Zelllebensfähigkeit von Kardiomyozyten fördern, was eng mit der Aktivierung des mitochondrialen Energiestoffwechsels zusammenhängt. Crocetin kann die durchH2O2induzierte verminderte Lebensfähigkeit von Kardiomyozyten wiederherstellen und hat eine dosisabhängige Wirkung, was darauf hindeutet, dass Crocetin die oxidativen Stressschäden von Kardiomyozyten verbessern kann. In der Zwischenzeit kann Crocetin myokardiale Schäden und oxidative Stressindizes, die durchH2O2verursacht werden, wirksam umkehren, was seine myokardiale Schutzwirkung weiter bestätigt.
Die Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials ist eines der charakteristischen Ereignisse in den frühen Stadien der Apoptose35. JC-1-Farbstoffe aggregieren potentialabhängig in den Mitochondrien. In der normalen mitochondrialen Matrix bildet JC-1 ein fluoreszierendes Polymer in Rot. Wenn das mitochondriale Membranpotential kollabiert, emittiert JC-1 grüne Fluoreszenz als Monomere36. TUNEL detektiert nukleäre DNA-Strangbrüche in den späten Stadien der Apoptose37. Apoptotische Zellen aktivieren DNA-Endonuklease-Enzyme, die genomische DNA zwischen Nukleosomen schneiden, und exponierte 3'-OH können mit grün fluoreszierendem Sondenfluorescein (FITC)-markiertem dUTP nachgewiesen werden, das durch terminale Desoxynukleotidyltransferasen katalysiert wird37. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass das mitochondriale Membranpotential abnahm und die Apoptose von Kardiomyozyten nach H2O2-Modellierung auftrat; Die Veränderungen konnten durch Crocetin bis zu einem gewissen Grad rückgängig gemacht werden, was darauf hindeutet, dass Crocetin die Apoptose von Kardiomyozyten, die durch oxidativen Stress verursacht wird, effektiv hemmen könnte.
PINK1/Parkin ist ein klassischer Signalweg, der die Mitophagievermittelt 38. PINK1 reichert sich nach einer mitochondrialen Schädigung auf der äußeren mitochondrialen Membran an, und Parkin wird rekrutiert, um das extramitochondriale Membranprotein zu ubiquitinieren, das an Autophagie-bezogene Rezeptorproteine bindet, um Autophagosomen zu bilden, was das Auftreten von Mitophagie markiert39,40,4 1. Die Ergebnisse zeigen, dass die Proteinspiegel von PINK1 und Parkin in Kardiomyozyten nachH2O2-Modellierungerhöht waren, was auf eine übermäßige Autophagie hindeutet. Nach der Intervention von Crocetin waren die Proteinspiegel von PINK1 und Parkin in Kardiomyozyten, die mitH2O2behandelt wurden, bis zu einem gewissen Grad umgekehrt, was darauf hindeutet, dass es eine therapeutische Rolle spielen könnte, indem es eine übermäßige mitochondriale Autophagie hemmt. In dieser Studie reduzierte Crocetin dieH2O2-induzierte oxidative Schädigung und die Apoptose von H9c2-Kardiomyozyten, und es wird spekuliert, dass dieser Effekt durch die Beeinflussung des PINK1/Parkin-Signalwegs erreicht werden könnte, um eine übermäßige Mitophagie zu hemmen.
Dieses Experiment demonstrierte die Intervention von pflanzlichem lyophilisiertem Pulver auf zellulären oxidativen Stress und Mitophagie. Die Verwendung des mCherry-GFP-LC3B-Adenovirus zur Beobachtung der mitochondrialen Autophagie war ein entscheidender Schritt in dem Experiment. Der Schlüssel zum Erfolg dieses Schritts bestand darin, die Infektionsrate der Zellen zu erhöhen, und das provirale Infektionsreagenz Polybrene wurde dem Medium im Voraus zugesetzt, um die Infektionseffizienz erheblich zu erhöhen. Dies wurde erreicht, indem die elektrostatische Abstoßung zwischen der Sialinsäure auf der Zelloberfläche und den Viruspartikeln neutralisiert und so die Adsorption erleichtert wurde. Es ist auch erwähnenswert, dass das Adenovirus-Genom als relativ sicheres Virus zwar nach der Infektion nicht in das Genom der Wirtszelle integriert und sich nicht in der Zelle repliziert, aber dennoch potenziell biologisch gefährlich ist. Daher wird empfohlen, die Experimente unter strikter Einhaltung der regulatorischen Vorgaben durchzuführen.
Die Fluoreszenzmarkierung ist eine gängige Methode zum Nachweis von Mitophagie, aber aufgrund ihrer geringen Spezifität können andere Organellen falsch markiert sein und somit die experimentellen Ergebnisse beeinträchtigen41. Mit dem fortschreitenden technologischen Fortschritt können wir mit der Entwicklung präziserer und zuverlässigerer Fluoreszenzsonden rechnen, um den Mechanismus der Mitophagie weiter zu erforschen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Beijing Natural Science Foundation (Nr. 7202119) und der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82274380) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
References
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