Summary
Baseret på in vitro-eksperimenter afslørede denne undersøgelse crocetins mekanisme til reparation af oxidativ stressskade på kardiomyocytter ved at påvirke mitofagi, hvor PINK1 / Parkin-signalvejen spiller en vigtig rolle.
Abstract
Denne undersøgelse havde til formål at undersøge den oxidative stressbeskyttende virkning af crocetin på H2O2-medierede H9c2-myokardceller gennem in vitro-eksperimenter og yderligere undersøge, om dens mekanisme er relateret til virkningen af mitofagi. Denne undersøgelse havde også til formål at demonstrere den terapeutiske virkning af saflorsyre på oxidativ stress i kardiomyocytter og undersøge, om dens mekanisme er relateret til effekten af mitofagi. Her blev en H 2 O2-baseretoxidativ stressmodel konstrueret og vurderet graden af oxidativ stressskade af kardiomyocytter ved at detektere niveauerne af lactat dehydrogenase (LDH), kreatinkinase (CK), malondialdehyd (MDA), superoxiddismutase (SOD), katalase (CAT) og glutathionperoxidase (GSH Px). Reaktive iltarter (ROS)-detekterende fluorescerende farvestof DCFH-DA, JC-1 farvestof og TUNEL farvestof blev anvendt til at vurdere mitokondrieskader og apoptose. Autofagisk flux blev målt ved transfektering af Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitofagy-relaterede proteiner blev derefter påvist via western blotting og immunofluorescens. Crocetin (0,1-10 μM) kunne imidlertid forbedre cellelevedygtigheden betydeligt og reducere apoptose og oxidativ stressskade forårsaget afH2O2. I celler med overdreven autofagisk aktivering kunne crocetin også reducere autofagistrømmen og ekspressionen af mitofagirelaterede proteiner PINK1 og Parkin og vende overførslen af Parkin til mitokondrier. Crocetin kunne reducere H2O2-medieret oxidativ stressskade og apoptose af H9c2-celler, og dets mekanisme var tæt forbundet med mitofagi.
Introduction
Akut myokardieinfarkt (AMI) er en livstruende myokardienekrose forårsaget af alvorlig og vedvarende iskæmi og hypoxi i koronararterierne 1,2. Perkutan koronar intervention (PCI) er en af de første linje terapeutiske strategier for AMI og beskytter normalt kardiomyocytter mod iskæmisk skade 3,4. Det distale myokardium mangler blod- og iltforsyning, hvis det ikke behandles hurtigt og effektivt efter AMI, hvilket fører til iskæmisk nekrose og yderligere kardiovaskulære komplikationer 5,6. Fremme af kardiomyocytgendannelse og minimering af irreversibel myokardieskade efter at have savnet PCI-kirurgisk mulighed har været et forskningshotspot. Efter AMI er kardiomyocytter i en tilstand af iskæmi og hypoxi, hvilket resulterer i hæmning af mitokondriel oxidativ phosphorylering, reduktion af NAD+ til NADPH og øget enkeltelektronreduktion7. Som følge heraf genererer den ufuldstændige reduktionsreaktion af ilt et overskud af reaktive iltarter (ROS) og fører i sidste ende til oxidativ stressskade på kardiomyocytter8. En overdreven ophobning af ROS udløser lipidperoxidation, hvilket yderligere forstyrrer mitokondriemembranernes struktur og funktion. Resultatet er en kontinuerlig åbning af mitokondriepermeabilitetsovergangsporer og et fald i mitokondriemembranpotentiale, hvilket inducerer apoptose og nekrose.
Angiotensinkonverterende enzym (ACE) hæmmere, angiotensinreceptorblokkere (ARB'er), hæmmere af β-adrenoceptorer, aldosteronantagonister og andre standardlægemidler i AMI kan hjælpe med at forbedre hjertefunktionen efter myokardieinfarkt og forhindre forekomsten af ondartede hændelser, såsom arytmier og venstre ventrikulær remodellering9. Imidlertid påvirkes overlevelse og prognose efter infarkt stærkt af infarktstørrelse, og der er ikke opnået tilfredsstillende resultater for reduktion af kardiomyocytapoptose10,11. Således er udviklingen af lægemidler til fremme af kardiomyocytgendannelse efter myokardieinfarkt blevet et presserende problem.
Traditionel medicin har været en inspirationskilde for moderne farmaceutisk forskning i mange år12,13,14,15. Traditionel kinesisk medicin (TCM) har en lang historie i behandlingen af AMI, og en række randomiserede kontrolforsøg i de senere år har bekræftet, at TCM faktisk kan forbedre prognosen for patienter16,17. Ifølge TCM-teorien er AMI forårsaget af blodstasis18,19, så lægemidler til fremme af blodcirkulationen bruges normalt til behandling af AMI i den akutte fase20. Blandt dem menes safran at have en kraftig effekt på blodaktivering og stasis, og bruges ofte til akut behandling af AMI. Crocetin, en vigtig bestanddel af safran, kan spille en central rolle i beskyttelsen af kardiomyocytter21.
I denne undersøgelse blev H9c2 myokardceller induceret afH2O2for at simulere myokardieiskæmi/reperfusion, hvilket forårsager en kardiomyocytskade på AMI, og crocetin blev anvendt som en intervention for at undersøge dets beskyttende virkning mod oxidativ stressinduceret myokardieskade. Mekanismen for crocetin, der beskytter kardiomyocytter, blev yderligere undersøgt gennem mitofagi. Endnu vigtigere er det, at denne artikel giver en reference til den tekniske tilgang til undersøgelsen af mitofagi, og beskriver hele eksperimentproceduren i detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenterne blev udført i laboratoriet for fysiologi ved Beijing University of Chinese Medicine, Kina. Alle undersøgelsesmetoder blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og regler fra Beijing Universitet.
1. Cellekultur
- Tilsæt 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin til Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) basisk medium (med 4,5 g / L D-glucose, 4.g.g / L L-glutamin og 110 mg / L natriumpyruvat; se materialetabel) for at forberede DMEM komplet medium.
- De flydende nitrogenfrosne H9c2 myokardceller (se materialetabellen) tøs op i varmt vand ved 37 °C under hurtig og ensartet omrøring, indtil isen smelter.
- Overfør cellerne til et centrifugerør, og tilsæt fire gange volumenet af det komplette DMEM-medium. Der centrifugeres ved 358 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres med en pipette.
- Den opnåede cellesuspension fortyndes med dyrkningsmedium, blæses forsigtigt og podes cellerne i en dyrkningskolbe. Kultur i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
2. Bestemmelse af cellelevedygtighed
- Crocetin (se materialetabel) opløses i dimethylsulfoxid (DMSO) i koncentrationer på 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM og 200 mM.
- Dissocier H9c2 myokardceller med trypsin, og neutralisere derefter blandingen med DMEM komplet medium.
- Overfør cellerne til et centrifugerør og centrifuger ved 179 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og cellerne blandes i DMEM-fuldmedium ved forsigtigt at blæse.
- Tæl cellerne ved hjælp af en blodcelletælleplade22 (se materialetabel) og fortynd dem til 5 × 104 celler / ml med DMEM komplet medium.
- Opdel cellerne i ni lige store portioner. Der tilsættes DMSO (fortyndet i forholdet 1:1.000 med DMEM komplet medium) til kontrolgruppen, og der tilsættes forskellige koncentrationer af crocetin til de resterende grupper i forholdet 1:1.000.
- Frø cellerne i plader med 96 brønde ved 100 μL pr. Brønd. Supernatanten kasseres efter inkubation i 24 timer, og cellerne vaskes tre gange med PBS.
- Efter tilsætning af 100 μL DMEM basalmedium inkuberes cellerne i 4 timer, og der tilsættes 20 μL MTS (se materialetabel).
- Inkuber cellerne i yderligere 2 timer, mål absorbansen ved en bølgelængde på 490 nm, og beregn cellens levedygtighed.
BEMÆRK: Cellelevedygtighed = (OD-behandlet - OD-tom) / (OD-kontrol - OD-tom) × 100.
3. Bestemmelse af lactat dehydrogenase (LDH), kreatinkinase (CK), malondialdehyd (MDA), superoxiddismutase (SOD), glutathionperoxidase (GSH Px) og katalase (CAT)
- Frø H9c2-cellerne i en 6-brøndplade med en densitet på 1 × 105 celler. Supernatanten opsamles efter indgrebet, og LDH- og SOD-indholdet påvises i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger (se materialetabellen).
- Supernatanten opsamles og vaskes én gang med fosfatbufferet saltvand (PBS). Tilsæt cellelysatet til kulturskålen og lad det sidde på is i 20 min. Opsaml væsken fra kulturskålen i et centrifugerør.
- Registrer CK-, MDA-, GSH-Px- og CAT-niveauer i henhold til producentens anvisninger23 (se materialefortegnelse og supplerende fil 1).
- Detekter den totale proteinkoncentration af lysen ved hjælp af bicinchoninsyremetoden (BCA) for at korrigere koncentrationen af CK, MDA, GSH-Px og CAT24 (se materialetabel).
4. Bestemmelse af ROS
- Frø H9c2-cellerne i en 48-brøndplade med en densitet på 5 × 103 celler. DCFH-DA fortyndes (se materialetabel) i forholdet 1:1.000 med det serumfrie medium. Cellesupernatanten kasseres, og cellen vaskes to gange med et serumfrit medium.
- Der tilsættes 150 μL fortyndet DCFH-DA i hvert hul og inkuberes ved 37 °C i 20 minutter. Vask cellerne tre gange med et serumfrit medium og tag billeder under et fluorescensmikroskop (se materialetabel).
5. Påvisning af mitokondriemembranpotentiale
- Detekter mitokondriemembranpotentialet ved hjælp af et JC-1 mitokondriemembranpotentialeanalysesæt25 (se materialetabel). Kassér kulturmediet og vask dem en gang med serumfrit medium.
- Tilsæt JC-1 arbejdsløsning til hvert rør og bland dem godt. Inkuber ved 37 °C i 20 minutter og vask cellerne to gange med JC-1 farvningsbuffer. Tilføj komplet medium til hver brønd og tag fotografier under et fluorescensmikroskop.
6. TUNEL farvningsanalyse
- Brug et TUNEL apoptoseanalysesæt (se materialetabel) til at bestemme apoptosehastigheder26. Supernatanten kasseres, og pelletsen vaskes én gang med serumfrit medium.
- Tilsæt cellefikseringsopløsning og vask dem med PBS én gang efter inkubation ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Tilsæt 0,3% triton-100 til hver brønd og inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Cellerne vaskes med PBS to gange. Tilføj TUNEL detektionsarbejdsløsning og inkuber ved 37 °C i mørke i 60 minutter.
- Der tilsættes en forseglingstablet mod fluorescensdæmpning indeholdende 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; se materialetabel) og tag fotografier under et fluorescensmikroskop.
7. Overvågning af autofagisk strømning ved transfektion af mCherry GFP-LC3B adenovirus
- Udskift halvdelen af mediet i hver brønd med frisk medium. Tilføj Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus (mangfoldighed af infektion [MOI] på 2) til dyrkningsmediet og tilsæt 5 μg / ml polybren (se materialetabel) for at forbedre infektionseffektiviteten.
- Udskift det friske medium efter 24 timer og observer ekspressionen af det fluorescerende protein under et konfokalmikroskop.
- Dyrk cellerne med de samme betingelser som sektion 1 efter bekræftelse af vellykket virusinfektion og tag billeder under det konfokale mikroskop27.
BEMÆRK: Mere end 20% af cellerne viste grøn fluorescerende protein (GFP) fluorescens, hvilket indikerer en vellykket infektion.
8. Western blot-analyse
- Saml celler til helproteinekstraktion og lys dem (RIPA, proteasehæmmer og fosfatasehæmmer = 100:1:1; se materialetabel) på is i 30 min.
- Tilsæt 5x proteinbelastningsbuffer til proteinprøven efter proteinkvantificering og kog prøverne i 10 min.
- Elektroforese prøverne, der indeholder lige store mængder protein med natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) geler28. Overfør derefter prøverne til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner.
- PVDF-membranerne blokeres i 1 time med 5% skummetmælkspulver og inkuberes med det primære antistof (PINK1, Parkin; se materialetabel) ved 4 °C natten over og det sekundære antistof ved stuetemperatur i 1 time.
- Registrer målbåndene ved hjælp af ECL-opløsning (enhanced chemiluminescence) og kemiluminescensdetekteringssystemet. Brug Image J-software til at kvantificere båndene via densitometri28.
9. Påvisning af Parkins mitokondrietranslokation ved immunofluorescens
- Overhold colokaliseringen af Parkin med mitokondrier ved dobbelt immunofluorescensfarvning. Kassér cellesupernatanten fra hver gruppe og vask dem tre gange med PBS.
- Fastgør cellerne i 10 minutter ved stuetemperatur med 4% paraformaldehyd og tilsæt 0,1% triton-100 i PBS.
- Blok med dyrefri blokopløsning (se materialetabel) i 1 time for at forhindre ikke-specifik binding mellem proteiner og antistoffer og reducere fluorescensbaggrunden.
- Der inkuberes med et primært antistof (Parkin og Tom20; se materialetabel) ved 4 °C natten over.
- Tilsæt et fluorescerende sekundært antistof (se materialetabel) og inkuber i mørke i 1 time.
- Tilføj de DAPI-holdige antifluorescensdæmpende tabletter og tag billeder under det konfokale mikroskop.
10. Statistisk analyse
- Udfør statistisk analyse ved hjælp af graf- og analysesoftware (se materialetabel).
- Sammenlign kontinuerlige variabler mellem grupper ved hjælp af envejs ANOVA. p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkninger af crocetin på celle levedygtighed
Crocetin ved 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM og 100 μM havde en signifikant proliferativ virkning på celler, mens crocetin i koncentrationer over 200 μM signifikant hæmmede proliferation af H9c2-celler (figur 1A). Efter 4 timers behandling med 400 μMH2O2blev cellelevedygtigheden reduceret betydeligt, og crocetin kunne til en vis grad vende denne ændring (figur 1B). Da der ikke blev observeret nogen signifikant forskel mellem 10 μM og 100 μM crocetin på H2O2-induceret H9c2-cellelevedygtighed, blev 10 μM crocetin valgt som den høje koncentration, og 1 μM og 0,1 μM blev anvendt som henholdsvis middel- og lavdosisgrupper.
Virkninger af crocetin på LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px og CAT i H9c2-celler
Efter 4 timers behandling med 400 μMH2O2steg niveauerne af LDH, CK og MDA betydeligt, mens niveauerne af SOD, GSH-Px og CAT faldt. Forbehandling af 10 μM crocetin i 24 timer kan vende ovenstående ændringer og viser en tydelig dosisafhængig effekt. Som et positivt kontrollægemiddel kan coenzym Q10 kun ændre niveauerne af CK, MDA og SOD (figur 2).
Virkningen af crocetin på ROS i H9c2 kardiomyocytter
Som en blind kontrol udtrykte H9c2-kardiomyocytter næsten ingen ROS. Samtidig kan 400 μMH2O2til 4 timers behandling især øge ROS-niveauet, som til en vis grad kan vendes med 10 μM crocetin (figur 3). Fluorescensresultaterne viste, at grøn fluorescens var meget svag i den normale gruppe. Til sammenligning kunne 400 μM H 2 O2til 4 timers behandling forbedre det grønne fluorescenssignal, og denne forbedring kunne reduceres med 10 μM crocetin (figur 3).
Virkninger af crocetin på H2O2-induceret mitokondriemembranpotentiale og apoptose
JC-1-farvning viste mere rød fluorescens og mindre grøn fluorescens i den tomme kontrolgruppe. Efter 4 timers behandling med 400 μMH2O2blev der observeret mere grøn fluorescens og mindre rød fluorescens, og 10 μM crocetin kunne til en vis grad vende denne ændring (figur 4A). TUNEL-farvningsresultater viste, at apoptoserelateret signalering ikke blev påvist i blindprøvegruppen, mens den apoptoserelaterede signalering blev mærkbart forbedret efter 400 μMH2O2i 4 timers behandling, som til en vis grad kunne vendes med 10 μM crocetin (figur 4B).
Virkninger af crocetin på H2O2-induceret overdreven autofagi
H9c2-kardiomyocytter i den blinde kontrolgruppe viste ingen åbenlys autofagistrøm. Fluorescens viste udseendet af punkterede gule pletter i H9c2-kardiomyocytter forbehandlet med 400 μMH2O2i 4 timer, hvilket indikerer en åbenlys overaktivering af autofagi. Denne ændring blev imidlertid vendt efter forbehandlingen med 10 μM crocetin. I kontrolgruppen kunne Ad-mCherry GFP-LC3B-viruset kun observeres som en svag diffus gul baggrund ved fluorescens. Imidlertid blev der observeret punktgule pletter efter 400 μMH2O2i 4 timers behandling, og denne ændring blev vendt efter 10 μM crocetinforbehandlingen (figur 5).
Påvisning af crocetin på ekspression af mitofagi-relaterede proteiner
Western blot-resultater viste, at ekspressionsniveauerne for PINK1 og Parkin i kontrolgruppen var lavere. I 4 timer H 2 O2-stimulerede H9c2-kardiomyocytter steg ekspressionsniveauerne for PINK1 og Parkin, mens 10 μM crocetin-forbehandlingen kunne reducere stigningen i PINK1 og Parkin (figur 6).
Påvisning af virkningen af crocetin på translokationen af Parkin mitokondrier
Immunofluorescensresultaterne viste, at det røde fluorescenssignal, der repræsenterede Parkin i den tomme kontrolgruppe, var meget svagt; Efter 400 μM H2O2 i 4 timers behandling blev det røde fluorescenssignal imidlertid forbedret, og colokalisering med den grønne fluorescens, der repræsentererTom20, steg. Efter forbehandlingen af 10 μM crocetin blev det røde fluorescenssignal svækket, og colokalisering med det grønne fluorescenssignal blev reduceret (figur 7).
Figur 1: Påvisning af cellelevedygtighed ved MTT-assay. (A) Crocetins virkninger i forskellige koncentrationer på cellelevedygtigheden (n = 6). (B) Crocetins virkninger i forskellige koncentrationer på cellelevedygtigheden efterH202-intervention (n = 6). *p < 0,05 versus kontrolgruppen, #p < 0,05 versusH2O2behandlingsgruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Påvisning af LDH-, CK-, MDA-, SOD-, GSH-Px- og CAT-niveauer. (A) LDH-indhold i cellesupernatant (n = 6). (B) CK-niveau i cellelysat (n = 6). C) MDA-niveau i cellelysat (n = 6). D) SOD-niveau i cellesupernatant (n = 6). (E) GSH-Px-niveau i cellelysat (n = 6). F) CAT-niveau i cellelysat (n = 6). *p < 0,05 versus blank kontrolgruppe, #p < 0,05 versusH2O2behandlingsgruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: ROS bestemt af DCFH-DA. (A) DCFH-DA blev anvendt til at måle ROS-niveauer i H9c2-kardiomyocytter. ROS: grøn. B) Kvantificeringsdata for ROS. a) H9c2-kardiomyocytter uden behandling. b) H9c2-kardiomyocytter stimuleret med 400 μM H2O2 i 4 timer. c) H9c2-celler forbehandlet med 10 μM crocetin i 24 timer og derefter stimuleret med 400 μMH2O2i 4 timer. Skalabjælke = 24 μm. *p < 0,05 versus blank kontrolgruppe, #p < 0,05 versusH2O2behandlingsgruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Påvisning af mitokondriemembranpotentiale og apoptose. (A) Mitokondriemembranpotentiale blev bestemt ved JC-1-farvning. JC-1 aggregater: rød; JC-1 monomerer: grøn. (B) Apoptose blev påvist ved TUNEL-farvning i H9c2-celler. TUNEL: grøn; DAPI: blå. a) H9c2-kardiomyocytter uden behandling. b) H9c2-kardiomyocytter stimuleret med 400 μM H2O2 i 4 timer. c) H9c2-celler forbehandlet med 10 μM crocetin i 24 timer og derefter stimuleret med 400 μMH2O2i 4 timer. Skalastænger = 72 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Autofagisk flux påvist af mCherry-GFP-LC3B adenovirus. mKirsebær: rød; GFP: grøn. a) H9c2-kardiomyocytter uden behandling. b) H9c2-kardiomyocytter stimuleret med 400 μM H2O2 i 4 timer. c) H9c2-celler forbehandlet med 10 μM crocetin i 24 timer og derefter stimuleret med 400 μMH2O2i 4 timer. Skalabjælker = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Indholdet af mitofagi-relaterede proteiner blev påvist ved western blotting. (A) Repræsentativ western blot, der illustrerer PINK1 og Parkin udtryk. β-actin blev vedtaget som intern reference. (B) Relativ PINK1-ekspression (n = 3). (C) Relativ Parkin-ekspression (n = 3). *p < 0,05 versus kontrolgruppen, #p < 0,05 versusH2O2behandlingsgruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Påvisning af Parkins mitokondrietranslokation ved immunofluorescens dobbeltfarvning. Rød fluorescens-mærket Parkins protein og grøn fluorescens mærket-Tom20 protein. Parkin: rød; Tom20: grøn; DAPI: blå). a) H9c2-kardiomyocytter uden behandling. b) H9c2-kardiomyocytter stimuleret med 400 μM H2O2 i 4 timer. c) H9c2-celler forbehandlet med 10 μM crocetin i 24 timer og derefter stimuleret med 400 μMH2O2i 4 timer. Skalastænger = 24 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Arbejdsinstruktionerne for LDH-, CK-, MDA-, SOD-, GSH-Px- og CAT-assays. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udforskningen af effektive ingredienser fra komplekse forbindelser af naturlige lægemidler gennem avanceret teknologi har været et hotspot for TCM-forskning29 og kan give laboratoriebevis for fremtidig lægemiddeludvikling efter verifikation. Saflor er et repræsentativt lægemiddel til behandling af "fremme af blodcirkulationen og minimering af blodstasis" og anvendes i vid udstrækning til behandling af myokardieinfarkt30,31. Safran menes at have lignende virkninger som saflor, og dens virkning i at fremme blodcirkulationen og fjerne blodstasis er signifikant bedre end saflor31,32. Crocetin er en af de vigtigste aktive komponenter i safran33, så den blev brugt i undersøgelsen af dette eksperiment.
H2O2kan forårsage oxidativ stressskade på kardiomyocytter og simulere kardiomyocytters myokardieinfarkttilstand, som er etableret som en model for myokardieinfarkt in vitro34. I denne undersøgelse kunne en lav koncentration af crocetin fremme cellelevedygtigheden af kardiomyocytter, som kan være tæt forbundet med aktiveringen af mitokondriel energimetabolisme. Crocetin kan genoprette den nedsatte levedygtighed af kardiomyocytter induceret afH2O2og har en dosisafhængig virkning, hvilket tyder på, at crocetin kan forbedre kardiomyocytternes oxidative stressskader. I mellemtiden kan crocetin effektivt vende myokardieskader og oxidative stressindekser forårsaget afH2O2, hvilket yderligere bekræfter dets myokardiebeskyttende virkning.
Faldet i mitokondriemembranpotentiale er en af kendetegnende begivenheder i de tidlige stadier af apoptose35. JC-1 farvestoffer aggregerer på en potentielt afhængig måde inden for mitokondrierne. I den normale mitokondriematrix danner JC-1 en fluorescerende polymer i rødt. Når mitokondriemembranpotentialet kollapser, udsender JC-1 grøn fluorescens som monomerer36. TUNEL detekterer nukleare DNA-strengbrud i de sene stadier af apoptose37. Apoptotiske celler aktiverer DNA-endonukleaseenzymer, der skærer genomisk DNA mellem nukleosomer, og eksponeret 3'-OH kan detekteres med grøn fluorescerende sonde fluorescein (FITC) -mærket dUTP katalyseret af terminale deoxynukleotidyltransferaser37. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at mitokondriemembranpotentialet faldt, og apoptose af kardiomyocytter optrådte efter H2O2-modellering; Ændringerne kunne vendes af crocetin til en vis grad, hvilket tyder på, at crocetin effektivt kunne hæmme apoptose af kardiomyocytter forårsaget af oxidativ stress.
PINK1 / Parkin er en klassisk vej, der formidler mitofagi,38. PINK1 akkumuleres på den ydre mitokondriemembran efter mitokondrieskader, og Parkin rekrutteres til at ubiquitinere det ekstramitokondrie membranprotein, som binder til autofagirelaterede receptorproteiner til dannelse af autofagosomer, hvilket markerer forekomsten af mitofagi:39,40,4 1. Resultaterne viser, at proteinniveauerne af PINK1 og Parkin blev øget i kardiomyocytter efterH2O2-modellering, hvilket tyder på overdreven autofagi. Efter indgreb af crocetin blev proteinniveauerne af PINK1 og Parkin i kardiomyocytter behandlet medH2O2til en vis grad vendt, hvilket tyder på, at det kan spille en terapeutisk rolle ved at hæmme overdreven mitokondriel autofagi. I denne undersøgelse reducerede crocetin H2O2-induceret oxidativ skade og apoptose af H9c2-kardiomyocytter, og det spekuleres i, at denne effekt kan opnås ved at påvirke PINK1 / Parkin-vejen for at hæmme overdreven mitofagi.
Dette eksperiment demonstrerede interventionen af urtefrysetørret pulver på cellulær oxidativ stress og mitofagi. Brug af mCherry-GFP-LC3B adenovirus til at observere mitokondriel autofagi var et afgørende skridt i eksperimentet. Nøglen til succesen med dette trin var at øge infektionshastigheden af cellerne, og det provirale infektionsreagens polybren blev tilsat til mediet på forhånd for at øge infektionseffektiviteten meget. Dette blev opnået ved at neutralisere den elektrostatiske frastødning mellem celleoverfladen sialinsyre og viruspartiklerne, hvilket letter adsorptionen. Det er også værd at bemærke, at som en relativt sikker virus, selvom adenovirusgenomet ikke integreres i værtscellegenomet efter infektion og ikke replikerer i cellen, er det stadig potentielt biologisk farligt. Derfor anbefales det at udføre eksperimenterne under streng overholdelse af lovkrav.
Fluorescerende mærkning er en almindelig metode til påvisning af mitofagi, men på grund af dens dårlige specificitet kan andre organeller være forkert mærket og dermed forstyrre de eksperimentelle resultater41. Efterhånden som teknologiske fremskridt fortsætter, kan vi forvente udviklingen af mere præcise og pålidelige fluorescerende sonder for yderligere at udforske mekanismen for mitofagi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Beijing Natural Science Foundation (nr. 7202119) og National Natural Science Foundation of China (nr. 82274380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
- Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
- Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
- Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
- Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
- Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
- La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
- De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
- Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
- Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
- Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
- Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
- Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
- Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
- Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
- Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
- Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
- Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
- Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
- Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
- Chazotte, B.
- Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
- Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
- Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
- Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
- Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
- Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
- Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
- Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
- Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
- Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
- Gan, Z. Y., et al.
- Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M.
- Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
