Protezione delle cellule miocardiche H9c2 dallo stress ossidativo mediante Crocetina tramite la mitofagia mediata dalla via PINK1/Parkin
Summary
Sulla base di esperimenti in vitro , questo studio ha rivelato il meccanismo della crocetina nel riparare il danno da stress ossidativo dei cardiomiociti influenzando la mitofagia, in cui la via di segnalazione PINK1 / Parkin svolge un ruolo importante.
Abstract
Questo studio mirava a esplorare l’effetto protettivo dello stress ossidativo della crocetina sulle cellule miocardiche H9c2 mediate da H 2 O2attraverso esperimenti in vitro e ad esplorare ulteriormente se il suo meccanismo è correlato all’impatto della mitofagia. Questo studio mirava anche a dimostrare l’effetto terapeutico dell’acido di cartamo sullo stress ossidativo nei cardiomiociti ed esplorare se il suo meccanismo è correlato all’effetto della mitofagia. Qui, è stato costruito un modello di stress ossidativo basato su H 2 O2e valutato il grado di danno da stress ossidativo dei cardiomiociti rilevando i livelli di lattato deidrogenasi (LDH), creatina chinasi (CK), malondialdeide (MDA), superossido dismutasi (SOD), catalasi (CAT) e glutatione perossidasi (GSH Px). Il colorante fluorescente DCFH-DA (delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), il colorante JC-1 e il colorante TUNEL sono stati impiegati per valutare il danno mitocondriale e l’apoptosi. Il flusso autofagico è stato misurato trasfettando l’adenovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Le proteine correlate alla mitofagia sono state quindi rilevate tramite western blotting e immunofluorescenza. Tuttavia, la crocetina (0,1-10 μM) potrebbe migliorare significativamente la vitalità cellulare e ridurre l’apoptosi e il danno da stress ossidativo causato da H 2 O2. Nelle cellule con eccessiva attivazione autofagica, la crocetina potrebbe anche ridurre il flusso autofagico e l’espressione delle proteine correlate alla mitofagia PINK1 e Parkin, e invertire il trasferimento di Parkin ai mitocondri. La crocetina potrebbe ridurre il danno da stress ossidativo mediato da H 2 O2e l’apoptosi delle cellule H9c2, e il suo meccanismo era strettamente correlato alla mitofagia.
Introduction
L’infarto miocardico acuto (IMA) è una necrosi miocardica pericolosa per la vita causata da ischemia grave e persistente e ipossia alle arterie coronarie 1,2. L’intervento coronarico percutaneo (PCI) è una delle strategie terapeutiche di prima linea per l’IMA e di solito protegge i cardiomiociti dal danno ischemico 3,4. Il miocardio distale mancherà di apporto di sangue e ossigeno se non trattato tempestivamente ed efficacemente dopo AMI, che porta a necrosi ischemica e ulteriori complicanze cardiovascolari 5,6. Promuovere il recupero dei cardiomiociti e ridurre al minimo il danno miocardico irreversibile dopo aver perso l’opportunità chirurgica PCI è stato un hotspot di ricerca. Dopo l’IMA, i cardiomiociti sono in uno stato di ischemia e ipossia, con conseguente inibizione della fosforilazione ossidativa mitocondriale, riduzione di NAD+ a NADPH e aumento della riduzione di singoli elettroni7. Di conseguenza, la reazione di riduzione incompleta dell’ossigeno genera un eccesso di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e alla fine porta a danni da stress ossidativo ai cardiomiociti8. Un eccessivo accumulo di ROS innesca la perossidazione lipidica, interrompendo ulteriormente la struttura e la funzione delle membrane mitocondriali. Il risultato è un’apertura continua dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale e una diminuzione del potenziale della membrana mitocondriale, inducendo apoptosi e necrosi.
Gli inibitori dell’enzima di conversione dell’angiotensina (ACE), i bloccanti del recettore dell’angiotensina (ARB), gli inibitori dei β-adrenocettori, gli antagonisti dell’aldosterone e altri farmaci standard nell’AMI possono aiutare a migliorare la funzione cardiaca dopo infarto miocardico e prevenire il verificarsi di eventi maligni, come aritmie e rimodellamento ventricolare sinistro9. Tuttavia, la sopravvivenza post-infarto e la prognosi sono fortemente influenzate dalle dimensioni dell’infarto e non sono stati raggiunti risultati soddisfacenti per ridurre l’apoptosi dei cardiomiociti10,11. Pertanto, lo sviluppo di farmaci per promuovere il recupero dei cardiomiociti dopo l’infarto miocardico è diventato un problema urgente.
La medicina tradizionale è stata fonte di ispirazione per la moderna ricerca farmaceutica per molti anni12,13,14,15. La medicina tradizionale cinese (MTC) ha una lunga storia nel trattamento dell’IMA e una serie di studi randomizzati di controllo negli ultimi anni hanno confermato che la MTC può effettivamente migliorare la prognosi dei pazienti16,17. Secondo la teoria TCM, l’AMI è causata dalla stasi del sangue18,19, quindi i farmaci per promuovere la circolazione sanguigna sono solitamente utilizzati per il trattamento dell’AMI nella fase acuta20. Tra questi, si ritiene che lo zafferano abbia un potente effetto sull’attivazione e sulla stasi del sangue ed è spesso usato nel trattamento acuto dell’AMI. La crocetina, un componente importante dello zafferano, può svolgere un ruolo chiave nella protezione dei cardiomiociti21.
In questo studio, le cellule miocardiche H9c2 sono state indotteda H 2 O2 per simulare l’ischemia/riperfusione miocardica, che causa una lesione cardiomiocitaria di AMI, e la crocetina è stata utilizzata come intervento per studiare il suo effetto protettivo contro il danno miocardico indotto da stress ossidativo. Il meccanismo della crocetina che protegge i cardiomiociti è stato ulteriormente esplorato attraverso la mitofagia. Ancora più importante, questo articolo fornisce un riferimento per l’approccio tecnico allo studio della mitofagia e descrive l’intera procedura sperimentale in dettaglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’esplorazione di ingredienti efficaci da composti complessi di droghe naturali attraverso tecnologie avanzate è stata un punto focale della ricerca TCM29 e può fornire prove di laboratorio per il futuro sviluppo di farmaci dopo la verifica. Il cartamo è un farmaco rappresentativo nel trattamento di “promuovere la circolazione sanguigna e ridurre al minimo la stasi del sangue” ed è ampiamente usato nel trattamento dell’infarto miocardico30,31<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla Beijing Natural Science Foundation (n. 7202119) e dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82274380).
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
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