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Protezione delle cellule miocardiche H9c2 dallo stress ossidativo mediante Crocetina tramite la mitofagia mediata dalla via PINK1/Parkin

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65105
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

Summary

Sulla base di esperimenti in vitro , questo studio ha rivelato il meccanismo della crocetina nel riparare il danno da stress ossidativo dei cardiomiociti influenzando la mitofagia, in cui la via di segnalazione PINK1 / Parkin svolge un ruolo importante.

Abstract

Questo studio mirava a esplorare l'effetto protettivo dello stress ossidativo della crocetina sulle cellule miocardiche H9c2 mediate da H 2 O2attraverso esperimenti in vitro e ad esplorare ulteriormente se il suo meccanismo è correlato all'impatto della mitofagia. Questo studio mirava anche a dimostrare l'effetto terapeutico dell'acido di cartamo sullo stress ossidativo nei cardiomiociti ed esplorare se il suo meccanismo è correlato all'effetto della mitofagia. Qui, è stato costruito un modello di stress ossidativo basato su H 2 O2e valutato il grado di danno da stress ossidativo dei cardiomiociti rilevando i livelli di lattato deidrogenasi (LDH), creatina chinasi (CK), malondialdeide (MDA), superossido dismutasi (SOD), catalasi (CAT) e glutatione perossidasi (GSH Px). Il colorante fluorescente DCFH-DA (delle specie reattive dell'ossigeno (ROS), il colorante JC-1 e il colorante TUNEL sono stati impiegati per valutare il danno mitocondriale e l'apoptosi. Il flusso autofagico è stato misurato trasfettando l'adenovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Le proteine correlate alla mitofagia sono state quindi rilevate tramite western blotting e immunofluorescenza. Tuttavia, la crocetina (0,1-10 μM) potrebbe migliorare significativamente la vitalità cellulare e ridurre l'apoptosi e il danno da stress ossidativo causato da H 2 O2. Nelle cellule con eccessiva attivazione autofagica, la crocetina potrebbe anche ridurre il flusso autofagico e l'espressione delle proteine correlate alla mitofagia PINK1 e Parkin, e invertire il trasferimento di Parkin ai mitocondri. La crocetina potrebbe ridurre il danno da stress ossidativo mediato da H 2 O2e l'apoptosi delle cellule H9c2, e il suo meccanismo era strettamente correlato alla mitofagia.

Introduction

L'infarto miocardico acuto (IMA) è una necrosi miocardica pericolosa per la vita causata da ischemia grave e persistente e ipossia alle arterie coronarie 1,2. L'intervento coronarico percutaneo (PCI) è una delle strategie terapeutiche di prima linea per l'IMA e di solito protegge i cardiomiociti dal danno ischemico 3,4. Il miocardio distale mancherà di apporto di sangue e ossigeno se non trattato tempestivamente ed efficacemente dopo AMI, che porta a necrosi ischemica e ulteriori complicanze cardiovascolari 5,6. Promuovere il recupero dei cardiomiociti e ridurre al minimo il danno miocardico irreversibile dopo aver perso l'opportunità chirurgica PCI è stato un hotspot di ricerca. Dopo l'IMA, i cardiomiociti sono in uno stato di ischemia e ipossia, con conseguente inibizione della fosforilazione ossidativa mitocondriale, riduzione di NAD+ a NADPH e aumento della riduzione di singoli elettroni7. Di conseguenza, la reazione di riduzione incompleta dell'ossigeno genera un eccesso di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e alla fine porta a danni da stress ossidativo ai cardiomiociti8. Un eccessivo accumulo di ROS innesca la perossidazione lipidica, interrompendo ulteriormente la struttura e la funzione delle membrane mitocondriali. Il risultato è un'apertura continua dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale e una diminuzione del potenziale della membrana mitocondriale, inducendo apoptosi e necrosi.

Gli inibitori dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE), i bloccanti del recettore dell'angiotensina (ARB), gli inibitori dei β-adrenocettori, gli antagonisti dell'aldosterone e altri farmaci standard nell'AMI possono aiutare a migliorare la funzione cardiaca dopo infarto miocardico e prevenire il verificarsi di eventi maligni, come aritmie e rimodellamento ventricolare sinistro9. Tuttavia, la sopravvivenza post-infarto e la prognosi sono fortemente influenzate dalle dimensioni dell'infarto e non sono stati raggiunti risultati soddisfacenti per ridurre l'apoptosi dei cardiomiociti10,11. Pertanto, lo sviluppo di farmaci per promuovere il recupero dei cardiomiociti dopo l'infarto miocardico è diventato un problema urgente.

La medicina tradizionale è stata fonte di ispirazione per la moderna ricerca farmaceutica per molti anni12,13,14,15. La medicina tradizionale cinese (MTC) ha una lunga storia nel trattamento dell'IMA e una serie di studi randomizzati di controllo negli ultimi anni hanno confermato che la MTC può effettivamente migliorare la prognosi dei pazienti16,17. Secondo la teoria TCM, l'AMI è causata dalla stasi del sangue18,19, quindi i farmaci per promuovere la circolazione sanguigna sono solitamente utilizzati per il trattamento dell'AMI nella fase acuta20. Tra questi, si ritiene che lo zafferano abbia un potente effetto sull'attivazione e sulla stasi del sangue ed è spesso usato nel trattamento acuto dell'AMI. La crocetina, un componente importante dello zafferano, può svolgere un ruolo chiave nella protezione dei cardiomiociti21.

In questo studio, le cellule miocardiche H9c2 sono state indotteda H 2 O2 per simulare l'ischemia/riperfusione miocardica, che causa una lesione cardiomiocitaria di AMI, e la crocetina è stata utilizzata come intervento per studiare il suo effetto protettivo contro il danno miocardico indotto da stress ossidativo. Il meccanismo della crocetina che protegge i cardiomiociti è stato ulteriormente esplorato attraverso la mitofagia. Ancora più importante, questo articolo fornisce un riferimento per l'approccio tecnico allo studio della mitofagia e descrive l'intera procedura sperimentale in dettaglio.

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Protocol

Gli esperimenti sono stati eseguiti nel Laboratorio di Fisiologia presso l'Università di Medicina Cinese di Pechino, in Cina. Tutti i metodi di studio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti dell'Università di Pechino.

1. Coltura cellulare

  1. Aggiungere il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina/streptomicina al terreno di base modificato Eagle medium (DMEM) di Dulbecco (con 4,5 g/L di D-glucosio, 4,g.g/L di L-glutammina e 110 mg/L di piruvato di sodio; vedere la Tabella dei materiali) per preparare il terreno completo DMEM.
  2. Scongelare le cellule miocardiche H9c2 congelate con azoto liquido (vedi Tabella dei materiali) in acqua calda a 37 °C con una rapida e uniforme agitazione fino a quando il ghiaccio si scioglie.
  3. Trasferire le celle in una provetta da centrifuga e aggiungere quattro volte il volume del mezzo completo DMEM. Centrifugare a 358 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante con una pipetta.
  4. Diluire la sospensione cellulare ottenuta con terreno di coltura, soffiare delicatamente e inoculare le cellule in un matraccio di coltura. Coltura in incubatrice a 37 °C con 5% di CO2.

2. Determinazione della vitalità cellulare

  1. Sciogliere la crocetina (vedere la tabella dei materiali) in dimetilsolfossido (DMSO) a concentrazioni di 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM e 200 mM.
  2. Dissociare le cellule miocardiche H9c2 mediante tripsina, quindi neutralizzare la miscela con DMEM mezzo completo.
  3. Trasferire le celle in una provetta da centrifuga e centrifugare a 179 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e mescolare le cellule nel mezzo completo DMEM soffiando delicatamente.
  4. Contare le cellule usando una piastra di conteggio delle cellule del sangue22 (vedere Tabella dei materiali) e diluirle a 5 × 104 cellule / ml con DMEM mezzo completo.
  5. Dividere le celle in nove parti uguali. Aggiungere DMSO (diluito in un rapporto 1:1.000 con DMEM mezzo completo) al gruppo di controllo e aggiungere diverse concentrazioni di crocetina ai gruppi rimanenti con un rapporto di 1:1.000.
  6. Seminare le cellule in piastre da 96 pozzetti a 100 μL per pozzetto. Scartare il surnatante dopo l'incubazione per 24 ore e lavare le cellule tre volte con PBS.
  7. Dopo aver aggiunto 100 μL di terreno basale DMEM, incubare le cellule per 4 ore e aggiungere 20 μL di MTS (vedere Tabella dei materiali).
  8. Incubare le cellule per altre 2 ore, misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 490 nm e calcolare la vitalità cellulare.
    NOTA: Vitalità cellulare = (OD trattato - OD vuoto) / (Controllo OD - OD vuoto) × 100.

3. Determinazione della lattato deidrogenasi (LDH), creatina chinasi (CK), malondialdeide (MDA), superossido dismutasi (SOD), glutatione perossidasi (GSH Px) e catalasi (CAT)

  1. Seminare le cellule H9c2 in una piastra a 6 pozzetti ad una densità di 1 × 105 celle. Raccogliere il surnatante dopo l'intervento e rilevare i livelli di LDH e SOD, secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
  2. Raccogliere il surnatante e lavarlo con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) una volta. Aggiungere il lisato cellulare al piatto di coltura e lasciarlo riposare sul ghiaccio per 20 minuti. Raccogliere il liquido dal piatto di coltura in una provetta da centrifuga.
  3. Rilevare i livelli di CK, MDA, GSH-Px e CAT secondo le istruzioni del produttore23 (vedere la tabella dei materiali e il file supplementare 1).
  4. Rilevare la concentrazione proteica totale della lisi con il metodo dell'acido bicinconinico (BCA) per correggere la concentrazione di CK, MDA, GSH-Px e CAT24 (vedere Tabella dei materiali).

4. Determinazione del ROS

  1. Seminare le cellule H9c2 in una piastra da 48 pozzetti ad una densità di 5 × 103 celle. Diluire DCFH-DA (vedere la tabella dei materiali) in rapporto 1:1.000 con il mezzo privo di siero. Scartare il surnatante cellulare e lavare la cellula due volte con un mezzo privo di siero.
  2. Aggiungere 150 μL di DCFH-DA diluito in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 20 minuti. Lavare le cellule tre volte con un mezzo privo di siero e acquisire immagini al microscopio a fluorescenza (vedere Tabella dei materiali).

5. Rilevazione del potenziale di membrana mitocondriale

  1. Rilevare il potenziale di membrana mitocondriale utilizzando un kit di analisi del potenziale di membrana mitocondriale JC-125 (vedere Tabella dei materiali). Scartare il terreno di coltura e lavarli una volta con terreno privo di siero.
  2. Aggiungere la soluzione di lavoro JC-1 a ciascun tubo e mescolarli bene. Incubare a 37 °C per 20 minuti e lavare le cellule due volte con tampone colorante JC-1. Aggiungi un mezzo completo a ciascun pozzetto e cattura fotografie al microscopio a fluorescenza.

6. Saggio di colorazione TUNEL

  1. Utilizzare un kit di analisi dell'apoptosi TUNEL (vedi Tabella dei materiali) per determinare i tassi di apoptosi26. Scartare il surnatante e lavare il pellet una volta con un mezzo privo di siero.
  2. Aggiungere la soluzione di fissazione cellulare e lavarli con PBS una volta dopo l'incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti.
  3. Aggiungere lo 0,3% di tritone-100 a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Lavare le celle con PBS due volte. Aggiungere la soluzione di lavoro di rilevamento TUNEL e incubare a 37 °C al buio per 60 minuti.
  4. Aggiungere una compressa sigillante di tempra antifluorescenza contenente 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; vedere Tabella dei materiali) e scattare fotografie al microscopio a fluorescenza.

7. Monitoraggio del flusso autofagico mediante trasfezione dell'adenovirus mCherry GFP-LC3B

  1. Sostituire metà del mezzo in ciascun pozzetto con terreno fresco. Aggiungere l'adenovirus Ad-mCherry GFP-LC3B (molteplicità di infezione [MOI] di 2) al terreno di coltura e aggiungere 5 μg/ml di polibrene (vedere Tabella dei materiali) per migliorare l'efficienza dell'infezione.
  2. Sostituire il mezzo fresco dopo 24 ore e osservare l'espressione della proteina fluorescente al microscopio confocale.
  3. Coltivare le cellule con le stesse condizioni della sezione 1 dopo aver confermato il successo dell'infezione virale e acquisire immagini al microscopio confocale27.
    NOTA: Più del 20% delle cellule ha mostrato fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP), indicando un'infezione riuscita.

8. Analisi Western blot

  1. Raccogliere le cellule per l'estrazione di proteine intere e lizzarle (RIPA, inibitore della proteasi e inibitore della fosfatasi = 100: 1: 1; vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio per 30 minuti.
  2. Aggiungere 5x tampone di carico proteico al campione proteico dopo la quantificazione delle proteine e far bollire i campioni per 10 minuti.
  3. Elettroforese i campioni che contengono quantità uguali di proteine con gel di elettroforesi su gel di sodio dodecil-solfato poliacrilammide (SDS-PAGE)28. Quindi, trasferire i campioni su membrane di difluoruro di polivinilidene (PVDF).
  4. Bloccare le membrane PVDF per 1 ora con latte scremato in polvere al 5% e incubare con l'anticorpo primario (PINK1, Parkin; vedi tabella dei materiali) a 4 °C durante la notte e l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora.
  5. Rileva le bande target utilizzando la soluzione di chemiluminescenza avanzata (ECL) e il sistema di rilevamento della chemiluminescenza. Utilizzare il software Image J per quantificare le bande tramite densitometria28.

9. Rilevazione della traslocazione mitocondriale di Parkin mediante immunofluorescenza

  1. Osservare la colocalizzazione del Parkin con i mitocondri mediante doppia colorazione a immunofluorescenza. Scartare il surnatante cellulare da ciascun gruppo e lavarli tre volte con PBS.
  2. Fissare le celle per 10 minuti a temperatura ambiente con paraformaldeide al 4% e aggiungere lo 0,1% di tritone-100 in PBS.
  3. Bloccare con una soluzione a blocchi senza animali (vedi Tabella dei materiali) per 1 ora per evitare il legame non specifico tra proteine e anticorpi e ridurre il fondo di fluorescenza.
  4. Incubare con un anticorpo primario (Parkin e Tom20; vedere Tabella dei materiali) a 4 °C durante la notte.
  5. Aggiungere un anticorpo secondario fluorescente (vedere Tabella dei materiali) e incubare al buio per 1 ora.
  6. Aggiungere le compresse di tempra antifluorescenza contenenti DAPI e acquisire immagini al microscopio confocale.

10. Analisi statistica

  1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software di grafica e analisi (vedi Tabella dei materiali).
  2. Confronta le variabili continue tra i gruppi utilizzando ANOVA unidirezionale. p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Representative Results

Effetti della crocetina sulla vitalità cellulare
La crocetina a 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM e 100 μM ha avuto un significativo effetto proliferativo sulle cellule, mentre la crocetina a concentrazioni superiori a 200 μM ha inibito significativamente la proliferazione delle cellule H9c2 (Figura 1A). Dopo 4 ore di trattamento con 400 μM H 2 O2, la vitalità cellulare è stata ridotta considerevolmente e la crocetina ha potuto invertire questo cambiamento in una certa misura (Figura 1B). Poiché non è stata osservata alcuna differenza significativa tra 10 μM e 100 μM di crocetina sulla vitalità cellulare H9c2 indotta da H 2 O2, è stata scelta la crocetina 10 μM come alta concentrazione e 1 μM e 0,1 μM sono stati utilizzati rispettivamente come gruppi a dose media e bassa.

Effetti della crocetina su LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px e CAT nelle cellule H9c2
Dopo 4 ore di trattamento con 400 μM H 2 O2, i livelli di LDH, CK e MDA sono aumentati sensibilmente, mentre i livelli di SOD, GSH-Px e CAT sono diminuiti. Il pretrattamento di 10 μM di crocetina per 24 ore può invertire i cambiamenti di cui sopra e mostra un evidente effetto dose-dipendente. Come farmaco di controllo positivo, il coenzima Q10 può solo modificare i livelli di CK, MDA e SOD (Figura 2).

L'effetto della crocetina sui ROS nei cardiomiociti H9c2
Come controllo in bianco, i cardiomiociti H9c2 non esprimevano quasi nessun ROS. Allo stesso tempo, 400 μM H 2 O2per 4 ore di trattamento potrebbero aumentare notevolmente il livello di ROS, che può essere invertito da 10 μM di crocetina in una certa misura (Figura 3). I risultati della fluorescenza hanno mostrato che la fluorescenza verde era molto debole nel gruppo normale. In confronto, 400 μM H2 O2 per il trattamento di 4 ore potrebbero migliorare il segnale di fluorescenza verde e questo aumento potrebbe essere ridotto di 10 μM di crocetina (Figura 3).

Effetti della crocetina sul potenziale di membranamitocondriale indotta da H 2 O2 e sull'apoptosi
La colorazione JC-1 ha mostrato più fluorescenza rossa e meno fluorescenza verde nel gruppo di controllo bianco. Dopo 4 ore di trattamento di 400 μM H 2 O2, sono state osservate più fluorescenza verde e meno fluorescenza rossa e 10 μM di crocetina potrebbero invertire questo cambiamento in una certa misura (Figura 4A). I risultati della colorazione TUNEL hanno mostrato che la segnalazione correlata all'apoptosi non è stata rilevata nel gruppo di controllo in bianco, mentre la segnalazione correlata all'apoptosi è stata sensibilmentemigliorata dopo 400 μM H 2 O2 per 4 ore di trattamento, che potrebbe essere invertita da 10 μM crocetina in una certa misura (Figura 4B).

Effetti della crocetina sull'eccessiva autofagia indotta da H 2 O2
I cardiomiociti H9c2 nel gruppo di controllo in bianco non hanno mostrato alcun flusso autofagico evidente. La fluorescenza ha mostrato la comparsa di macchie gialle puntate nei cardiomiociti H9c2 pretrattati con 400 μM H 2 O2per 4 ore, indicando un'evidente iper-attivazione dell'autofagia. Tuttavia, questo cambiamento è stato invertito dopo il pretrattamento con crocetina da 10 μM. Nel gruppo di controllo, il virus Ad-mCherry GFP-LC3B poteva essere osservato solo come un debole sfondo giallo diffuso per fluorescenza. Tuttavia, sono state osservate macchie gialle puntate dopo 400 μM H2 O2 per 4 ore di trattamento, e questo cambiamento è stato invertito dopo il pretrattamento con crocetina da 10 μM (Figura 5).

Rilevazione della crocetina sull'espressione di proteine correlate alla mitofagia
I risultati di Western blot hanno mostrato che nel gruppo di controllo, i livelli di espressione di PINK1 e Parkin erano più bassi. Nei cardiomiociti H9c2 4 h H 2 O2-stimolati, i livelli di espressione di PINK1 e Parkin sono aumentati, mentre il pretrattamento con crocetina da 10 μM potrebbe ridurre l'aumento di PINK1 e Parkin (Figura 6).

Rilevazione dell'effetto della crocetina sulla traslocazione dei mitocondri Parkin
I risultati dell'immunofluorescenza hanno mostrato che il segnale di fluorescenza rosso che rappresenta Parkin nel gruppo di controllo in bianco era molto debole; tuttavia, dopo 400 μM H 2 O2per 4 ore di trattamento, il segnale di fluorescenza rossa è stato migliorato e la colocalizzazione con la fluorescenza verde che rappresenta Tom20 è aumentata. Dopo il pretrattamento della crocetina da 10 μM, il segnale di fluorescenza rossa è stato indebolito e la colocalizzazione con il segnale di fluorescenza verde è stata ridotta (Figura 7).

Figure 1
Figura 1: Rilevazione della vitalità cellulare mediante il saggio MTT. (A) Effetti della crocetina a diverse concentrazioni sulla vitalità cellulare (n = 6). (B) Effetti della crocetina a diverse concentrazioni sulla vitalità cellulare dopo l'intervento diH 2 02 (n = 6). *p < 0,05 rispetto al gruppo di controllo, #p < 0,05 rispetto al gruppo di trattamento H 2 O2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rilevamento dei livelli di LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px e CAT. (A) Livello di LDH nel surnatante cellulare (n = 6). (B) Livello di CK nel lisato cellulare (n = 6). (C) Livello di MDA nel lisato cellulare (n = 6). (D) Livello di SOD nel surnatante cellulare (n = 6). (E) Livello di GSH-Px nel lisato cellulare (n = 6). (F) Livello di CAT nel lisato cellulare (n = 6). *p < 0,05 rispetto al gruppo di controllo vuoto, #p < 0,05 rispetto al gruppo di trattamento H 2 O2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: ROS determinato da DCFH-DA. (A) DCFH-DA è stato utilizzato per misurare i livelli di ROS nei cardiomiociti H9c2. ROS: verde. (B) Dati di quantificazione dei ROS. a) cardiomiociti H9c2 senza trattamento. b) cardiomiociti H9c2 stimolati con 400 μM H 2 O 2 per 4 ore. c) cellule H9c2 pretrattate con 10 μM di crocetina per 24 ore e quindi stimolate con 400 μM H 2 O 2per 4 ore. Barra di scala = 24 μm. *p < 0,05 rispetto al gruppo di controllo vuoto, #p < 0,05 rispetto al gruppo di trattamento H 2 O2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Rilevazione del potenziale di membrana mitocondriale e dell'apoptosi. (A) Il potenziale della membrana mitocondriale è stato determinato mediante colorazione JC-1. JC-1 aggregati: rosso; Monomeri JC-1: verdi. (B) L'apoptosi è stata rilevata mediante colorazione TUNEL nelle cellule H9c2. TUNEL: verde; DAPI: blu. a) cardiomiociti H9c2 senza trattamento. b) cardiomiociti H9c2 stimolati con 400 μM H 2 O 2 per 4 ore. c) cellule H9c2 pretrattate con 10 μM di crocetina per 24 ore e quindi stimolate con 400 μM H 2 O 2per 4 ore. Barre di scala = 72 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Flusso autofagico rilevato dall'adenovirus mCherry-GFP-LC3B. mCherry: rosso; GFP: verde. a) cardiomiociti H9c2 senza trattamento. b) cardiomiociti H9c2 stimolati con 400 μM H 2 O 2 per 4 ore. c) cellule H9c2 pretrattate con 10 μM di crocetina per 24 ore e quindi stimolate con 400 μM H 2 O 2per 4 ore. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Il contenuto di proteine correlate alla mitofagia è stato rilevato mediante western blotting. (A) Macchia occidentale rappresentativa che illustra l'espressione di PINK1 e Parkin. β-actina è stata adottata come riferimento interno. (B) Espressione relativa PINK1 (n = 3). (C) Espressione relativa di Parkin (n = 3). * p < 0,05 rispetto al gruppo di controllo, #p < 0,05 rispetto al gruppo di trattamento H 2 O2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Rilevazione della traslocazione mitocondriale di Parkin mediante doppia colorazione a immunofluorescenza. Proteina di Parkin marcata con fluorescenza rossa e proteina Tom20 marcata con fluorescenza verde. Parkin: rosso; Tom20: verde; DAPI: blu). a) cardiomiociti H9c2 senza trattamento. b) cardiomiociti H9c2 stimolati con 400 μM H 2 O 2 per 4 ore. c) cellule H9c2 pretrattate con 10 μM di crocetina per 24 ore e quindi stimolate con 400 μM H 2 O 2per 4 ore. Barre di scala = 24 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: Le istruzioni di lavoro dei saggi LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px e CAT. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

L'esplorazione di ingredienti efficaci da composti complessi di droghe naturali attraverso tecnologie avanzate è stata un punto focale della ricerca TCM29 e può fornire prove di laboratorio per il futuro sviluppo di farmaci dopo la verifica. Il cartamo è un farmaco rappresentativo nel trattamento di "promuovere la circolazione sanguigna e ridurre al minimo la stasi del sangue" ed è ampiamente usato nel trattamento dell'infarto miocardico30,31. Si ritiene che lo zafferano abbia effetti simili al cartamo, e il suo effetto nel promuovere la circolazione sanguigna e rimuovere la stasi del sangue è significativamente migliore del cartamo31,32. La crocetina è uno dei principali componenti attivi dello zafferano33, quindi è stata utilizzata nello studio di questo esperimento.

H2 O2 può causare lesioni da stress ossidativo dei cardiomiociti e simulare lo stato di infarto miocardico dei cardiomiociti, che è stabilito come modello di infarto miocardico in vitro34. In questo studio, una bassa concentrazione di crocetina potrebbe promuovere la vitalità cellulare dei cardiomiociti, che può essere strettamente correlata all'attivazione del metabolismo energetico mitocondriale. La crocetina può ripristinare la diminuita vitalità dei cardiomiociti indotta da H2 O2 e ha un effetto dose-dipendente, suggerendo che la crocetina può migliorare il danno da stress ossidativo dei cardiomiociti. Nel frattempo, la crocetina può invertire efficacemente il danno miocardico e gli indici di stress ossidativo causati da H 2 O2, confermando ulteriormente il suo effetto protettivo miocardico.

Il declino del potenziale della membrana mitocondriale è uno degli eventi caratteristici nelle prime fasi dell'apoptosi35. I coloranti JC-1 si aggregano in modo potenzialmente dipendente all'interno dei mitocondri. Nella normale matrice mitocondriale, JC-1 forma un polimero fluorescente in rosso. Quando il potenziale della membrana mitocondriale collassa, JC-1 emette fluorescenza verde come monomeri36. TUNEL rileva rotture di filamenti di DNA nucleare nelle ultime fasi dell'apoptosi37. Le cellule apoptotiche attivano gli enzimi endonucleasi del DNA che tagliano il DNA genomico tra i nucleosomi e il 3'-OH esposto può essere rilevato con dUTP marcato con fluoresceina fluorescente verde (FITC) catalizzato da deossinucleotidil transferasi terminale37. I risultati di questo studio mostrano che il potenziale della membrana mitocondriale è diminuito e l'apoptosi dei cardiomiociti è comparsa dopo la modellazione H 2 O2; I cambiamenti potrebbero essere invertiti dalla crocetina in una certa misura, suggerendo che la crocetina potrebbe inibire efficacemente l'apoptosi dei cardiomiociti causata dallo stress ossidativo.

PINK1/Parkin è un percorso classico che media la mitofagia38. PINK1 si accumula sulla membrana mitocondriale esterna dopo il danno mitocondriale e Parkin viene reclutato per ubiquitinare la proteina della membrana extramitocondriale, che si lega alle proteine recettoriali correlate all'autofagia per formare autofagosomi, segnando l'insorgenza di mitofagia39,40,4 1. I risultati mostrano che i livelli proteici di PINK1 e Parkin sono aumentati nei cardiomiociti dopo la modellazioneH 2 O2, suggerendo un'eccessiva autofagia. Dopo l'intervento di crocetina, i livelli proteici di PINK1 e Parkin nei cardiomiociti trattati con H 2O2 sono stati invertiti in una certa misura, suggerendo che potrebbe svolgere un ruolo terapeutico inibendo l'eccessiva autofagia mitocondriale. In questo studio, la crocetina ha ridotto il danno ossidativo indotto da H 2 O2e l'apoptosi dei cardiomiociti H9c2, e si ipotizza che questo effetto potrebbe essere ottenuto influenzando la via PINK1 / Parkin per inibire l'eccessiva mitofagia.

Questo esperimento ha dimostrato l'intervento di polvere liofilizzata a base di erbe sullo stress ossidativo cellulare e sulla mitofagia. L'uso dell'adenovirus mCherry-GFP-LC3B per osservare l'autofagia mitocondriale è stato un passo cruciale nell'esperimento. La chiave del successo di questo passaggio è stata quella di aumentare il tasso di infezione delle cellule e il reagente di infezione provirale polybrene è stato aggiunto al mezzo in anticipo per aumentare notevolmente l'efficienza dell'infezione. Ciò è stato ottenuto neutralizzando la repulsione elettrostatica tra l'acido sialico della superficie cellulare e le particelle virali, facilitando così l'adsorbimento. Vale anche la pena notare che, come virus relativamente sicuro, sebbene il genoma dell'adenovirus non si integri nel genoma della cellula ospite dopo l'infezione e non si replichi nella cellula, è ancora potenzialmente biologicamente pericoloso. Pertanto, si raccomanda di condurre gli esperimenti nel rigoroso rispetto dei requisiti normativi.

L'etichettatura fluorescente è un metodo comune per rilevare la mitofagia, ma a causa della sua scarsa specificità, altri organelli possono essere etichettati in modo errato e quindi interferire con i risultati sperimentali41. Man mano che i progressi tecnologici continuano, possiamo aspettarci lo sviluppo di sonde fluorescenti più precise e affidabili per esplorare ulteriormente il meccanismo della mitofagia.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dalla Beijing Natural Science Foundation (n. 7202119) e dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82274380).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin Gibco 2323363
1% Penicillin-streptomycin Sigma V900929
5x protein loading buffer Beijing Pulilai Gene Technology B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus Beyotime C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0513
Animal-free blocking solution CST 15019s
Anti-Parkin antibody Santa Cruz sc-32282
Anti-PINK1 antibody ABclonal A11435
Anti-TOM20 antibody ABclonal A19403
Anti-β-actin  antibody ABclonal AC026
BCA protein assay kit KeyGEN Biotech KGP902
Blood cell counting plate Servicebio WG607
CAT assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A007-1-1
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
CK assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10) Macklin C6129
Crocetin Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9557
DCFH-DA Beyotime S0033S
DMSO Solarbio D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution NCM Biotech P10100
Fetal bovine serum (FBS) Corning-Cellgro 35-081-CV
GraphPad Prism 7.0  https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A005-1-2
H9c2 myocardial cells Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit LABLEAD J22202
LDH assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A020-2-2
MDA assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A003-2-2
Methanol Aladdin A2114057
MTS assay Promega G3581
Perhydrol G-clone CS7730
Phosphatase inhibitor CWBIO CW2383
Polybrene Beyotime C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer Solarbio R0010
SDS-PAGE gels Shanghai Epizyme Biomedical Technology PG112
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder Servicebio G2017-1L
SOD assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A001-2-2
Tris-buffered saline powder Servicebio G0001-2L
Triton X-100 Sigma SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit Beyotime C1086
Tween-20 Solarbio T8220

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Medicina Numero 195 crocetina cellule miocardiche H9c2 stress ossidativo via PINK1/Parkin mitofagia
Protezione delle cellule miocardiche H9c2 dallo stress ossidativo mediante Crocetina <em>tramite</em> la mitofagia mediata dalla via PINK1/Parkin
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