Baserat på in vitro-experiment avslöjade denna studie mekanismen för krocetin vid reparation av oxidativ stressskada av kardiomyocyter genom att påverka mitofagi, där PINK1 / Parkin-signalvägen spelar en viktig roll.
Denna studie syftade till att undersöka den oxidativa stressskyddande effekten av krocetin påH2O2-medierade H9c2-myokardceller genom in vitro-experiment och ytterligare undersöka om dess mekanism är relaterad till effekten av mitofagi. Denna studie syftade också till att visa den terapeutiska effekten av safflorsyra på oxidativ stress i kardiomyocyter och undersöka om dess mekanism är relaterad till effekten av mitofagi. Här konstruerades enH2O2-baseradoxidativ stressmodell och bedömde graden av oxidativ stressskada hos kardiomyocyter genom att detektera nivåerna av laktatdehydrogenas (LDH), kreatinkinas (CK), malondialdehyd (MDA), superoxiddismutas (SOD), katalas (CAT) och glutationperoxidas (GSH Px). Reaktiva syreradikaler (ROS)-detekterande fluorescerande färgämne DCFH-DA, JC-1-färgämne och TUNEL-färgämne användes för att bedöma mitokondriella skador och apoptos. Autofagiskt flöde mättes genom transfektering av Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitophagy-relaterade proteiner detekterades sedan via western blotting och immunofluorescens. Krocetin (0,1-10 μM) kan emellertid avsevärt förbättra cellviabiliteten och minska apoptos och oxidativ stressskada orsakad avH2O2. I celler med överdriven autofagisk aktivering kan krocetin också minska autofagiflödet och uttrycket av mitofagirelaterade proteiner PINK1 och Parkin och vända överföringen av Parkin till mitokondrier. Kroketin kunde minska H2O2-medierad oxidativ stressskada och apoptos av H9c2-celler, och dess mekanism var nära relaterad till mitofagi.
Akut hjärtinfarkt (AMI) är en livshotande myokardinakros orsakad av svår och ihållande ischemi och hypoxi i kranskärlen 1,2. Perkutan koronar intervention (PCI) är en av de första linjens terapeutiska strategier för AMI och skyddar vanligtvis kardiomyocyter från ischemisk skada 3,4. Det distala myokardiet kommer att sakna blod- och syretillförsel om det inte behandlas snabbt och effektivt efter AMI, vilket leder till ischemisk nekros och ytterligare kardiovaskulära komplikationer 5,6. Att främja kardiomyocytåterhämtning och minimera irreversibel myokardskada efter att ha missat PCI-kirurgiska möjligheten har varit en forskningshotspot. Efter AMI är kardiomyocyter i ett tillstånd av ischemi och hypoxi, vilket resulterar i hämning av mitokondriell oxidativ fosforylering, reduktion av NAD + till NADPH och ökad enelektronreduktion7. Som ett resultat genererar den ofullständiga reduktionsreaktionen av syre ett överskott av reaktiva syrearter (ROS) och leder slutligen till oxidativ stressskada på kardiomyocyter8. En överdriven ackumulering av ROS utlöser lipidperoxidation, vilket ytterligare stör strukturen och funktionen hos mitokondriella membran. Resultatet är en kontinuerlig öppning av mitokondriella permeabilitetsövergångsporer och en minskning av mitokondriell membranpotential, inducerande apoptos och nekros.
Angiotensinkonverterande enzym (ACE) -hämmare, angiotensinreceptorblockerare (ARB), hämmare av β-adrenoceptorer, aldosteronantagonister och andra standardläkemedel i AMI kan bidra till att förbättra hjärtfunktionen efter hjärtinfarkt och förhindra förekomsten av maligna händelser, såsom arytmier och vänster ventrikulär remodellering9. Överlevnad och prognos efter infarkt påverkas dock kraftigt av infarktstorlek, och tillfredsställande resultat har inte uppnåtts för att minska kardiomyocytapoptos10,11. Således har utvecklingen av läkemedel för att främja kardiomyocytåterhämtning efter hjärtinfarkt blivit en brådskande fråga.
Traditionell medicin har varit en inspirationskälla för modern läkemedelsforskning i många år12,13,14,15. Traditionell kinesisk medicin (TCM) har en lång historia vid behandling av AMI, och en serie randomiserade kontrollstudier de senaste åren har bekräftat att TCM verkligen kan förbättra prognosen för patienter16,17. Enligt TCM-teorin orsakas AMI av blodstasis18,19, så läkemedel för att främja blodcirkulationen används vanligtvis för behandling av AMI i akut fas20. Bland dem tros saffran ha en kraftfull effekt på blodaktivering och stasis och används ofta vid akut behandling av AMI. Krocetin, en viktig komponent i saffran, kan spela en nyckelroll för att skydda kardiomyocyter21.
I denna studie inducerades H9c2-myokardceller avH2O2för att simulera myokardischemi / reperfusion, vilket orsakar en kardiomyocytskada av AMI, och kroketin användes som en intervention för att undersöka dess skyddande effekt mot oxidativ stressinducerad myokardskada. Mekanismen för krocetin som skyddar kardiomyocyter undersöktes ytterligare genom mitofagi. Ännu viktigare är att denna artikel ger en referens för det tekniska tillvägagångssättet för studier av mitofagi och beskriver hela experimentproceduren i detalj.
Utforskningen av effektiva ingredienser från komplexa föreningar av naturliga läkemedel genom avancerad teknik har varit en hotspot för TCM-forskning29 och kan ge laboratoriebevis för framtida läkemedelsutveckling efter verifiering. Safflor är ett representativt läkemedel vid behandling av “främjande av blodcirkulationen och minimering av blodstasis” och används ofta vid behandling av hjärtinfarkt30,31. Saffran tros ha liknande …
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av Beijing Natural Science Foundation (nr 7202119) och National Natural Science Foundation of China (nr 82274380).
0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
DMSO | Solarbio | D8371 | |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
Methanol | Aladdin | A2114057 | |
MTS assay | Promega | G3581 | |
Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
Polybrene | Beyotime | C0351 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
Tween-20 | Solarbio | T8220 |