Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

Los vectores virales se pueden utilizar para expresar proteínas fluorescentes en subconjuntos específicos de células en los tejidos. Aquí, un virus que expresa proteínas modificadas se introduce en la corteza visual primaria del cerebro realizando primero una pequeña craneotomía sobre esta área. A continuación, se introduce una micropipeta de vidrio en el cerebro y se inyecta en el cerebro un vector viral asociado a la odontología y se cierra el sitio quirúrgico.

Una vez que el animal se ha recuperado, se pueden realizar imágenes para seguir el destino de las células marcadas con fluorescencia in vivo o en secciones del cerebro. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como el marcaje con colorantes fluorescentes y las líneas de ratones transgénicos, son que puede dirigirse a tipos de células individuales y es menos costosa y requiere menos tiempo que el establecimiento de una línea transgénica. El uso de vectores virales adenoasociados está aprobado para el nivel de bioseguridad uno o BSL uno.

Aquí, se usará una bata de laboratorio y guantes de acuerdo con los procedimientos para el manejo de agentes BSL uno, comenzando por la preparación de un gabinete de bioseguridad Clase dos para Ali citando el virus. Esto preservará la actividad del virus evitando que se repita, congele y descongele. Limpie el gabinete de bioseguridad de cualquier objeto innecesario y esterilice la superficie con etanol al 70%.

Coloque un vaso de precipitados que contenga una solución de lejía al 10% en el gabinete de bioseguridad para recolectar un residuo contaminado con virus dental asociado. También se colocaron tubos estériles de 0,5 mililitros y un recipiente con hielo seco. Descongele el stock viral en hielo fuera del gabinete de bioseguridad.

Agita el virus y abre el tubo dentro del capó. Pipetea el volumen deseado en un tubo de 0,5 mililitros. Cierre el tubo y colóquelo en el hielo seco.

Para flashear, congele el virus cuando todo el virus haya sido alícuota. Deseche el tubo vacío y las puntas de pipeta en el contenedor de residuos de lejía al 10%. Retire el contenedor de residuos de la campana.

Agregue un 10% adicional de lejía. Espera de cinco a 10 minutos, luego vierte la lejía en el fregadero. Deseche todos los desechos plásticos en un contenedor de riesgo biológico.

De acuerdo con los protocolos institucionales, limpiar cualquier equipo o superficie que haya estado en contacto con el virus con lejía al 10%. Quítese y deseche los guantes. Guarde las alícuotas en un congelador a menos 80 grados centígrados.

Cubra el área quirúrgica con papel absorbente de laboratorio. La herramienta quirúrgica debe ser estéril y la cirugía debe realizarse en condiciones asépticas. Cubra el área adyacente al área quirúrgica con papel absorbente de mesa de laboratorio.

Esta zona se dedicará a cargar las micropipetas con virus. Coloque una alícuota del virus en un recipiente con hielo y deje que se descongele en el hielo mientras se realiza la cirugía, coloque un contenedor de desechos con lejía al 10% en el área dedicada al manejo de virus para desechar las puntas de pipeta u otros artículos que entren en contacto con el virus. Tire de una micropipeta de alambre de vidrio hasta un diámetro de punta de aproximadamente 20 micras.

Coloque una pequeña gota de aceite mineral en el extremo romo de la micropipeta e inserte el émbolo de alambre provisto con las micropipetas. Fije la micropipeta en la abrazadera del brazo de la microbomba. Con tijeras quirúrgicas.

Retira el pelo de la parte superior de la cabeza de un ratón anestesiado. A continuación, asegure el ratón en un estéreo ataques. Bañar la cabeza en etanol y Betadine para esterilizar la zona.

Coloque una gota de ungüento oftálmico tobradex en cada ojo para mantener los ojos húmedos durante la cirugía. Haz una incisión en la línea media de la cabeza y tira de la piel hacia atrás para exponer el cráneo con pinzas de punta fina. Retire con cuidado la facia del cráneo.

Localice el área que se va a inyectar usando coordenadas estereotáxicas y marque el cráneo con una pluma quirúrgica. Con un taladro dental con una rebaba de 1,4 milímetros, adelgace un área del cráneo, de aproximadamente dos milímetros de diámetro, hasta que el cráneo se agriete. Dividir el área adelgazada en varios segmentos a lo largo de este procedimiento.

Aplique solución salina estéril para mantener el cráneo húmedo. Realice una craneotomía extirpando suavemente los segmentos delgados del cráneo con pinzas de punta extrafina. Coloque una toallita Kim sobre la tapa del tubo de virus.

A continuación, abra el tubo para una inyección de un microlitro. Pipetear 1,5 microlitros en un pequeño trozo de paraforma. A continuación, coloque la punta de la micropipeta en la culata viral y extraiga manualmente el émbolo.

Si se experimenta dificultad para introducir el material viral en la micropipeta, la punta se puede ampliar ligeramente perforando una toallita kim con la micropipeta para romper una pequeña porción del vidrio, bajar el brazo de la microbomba sobre el émbolo hasta que se disipe una pequeña cantidad de virus de la punta de la micropipeta. Retire esta gota con un aplicador de punta de algodón y deseche el aplicador en un contenedor de residuos. Aplique una gota de aceite mineral en la punta de la micropipeta para evitar obstrucciones a medida que la micropipeta se introduce en el cerebro, el uso de las coordenadas estereotáxicas X e Y coloca la micropipeta sobre el área a inyectar.

En este experimento, las coordenadas estereotáxicas utilizadas para localizar la corteza visual primaria son 2,7 milímetros posterior al torema y 2,5 milímetros laterales a la línea media. Baje muy lentamente la micropipeta a una velocidad aproximada de un milímetro por minuto. A la profundidad deseada, introduzca los parámetros de inyección deseados en la caja del controlador de microbombas CYS micro four.

Para este experimento, se utilizará un microlitro durante 10 minutos como tasa de inyección. Inicie la inyección. Una vez finalizada la inyección.

Deje reposar la pipeta durante uno o dos minutos para evitar la afluencia de virus durante la extracción. Después de este período, muy lentamente, retire la micropipeta del cerebro, suture el cuero cabelludo y séllelo con pegamento para tejidos. Permita que el animal se recupere bajo una lámpara de calor hasta que deambule.

Luego devuélvelo a su jaula. Los experimentos de diagnóstico por imágenes se pueden realizar días o semanas después de la inyección viral. Después de la cirugía y la inyección, enjuague la micropipeta con lejía al 10% y deséchela en un recipiente para objetos punzocortantes.

Agregue un 10% adicional de lejía al contenedor de residuos. Espera de cinco a 10 minutos, luego vierte la lejía en el fregadero. Deseche los residuos en un contenedor de riesgo biológico de acuerdo con los lineamientos institucionales.

Deseche el papel de la mesa de laboratorio en un contenedor de riesgo biológico. Limpie todas las superficies e instrumentos que puedan haber estado en contacto con el virus. Con un 10% de lejía, el virus no utilizado puede congelarse.

Una vez más, hay que tener en cuenta que los repetidos ciclos de congelación causan la degradación del virus. Esta imagen muestra neuronas transducidas después de la inyección de un serotipo de virus adenoasociado doblete, trenzado. Uno. El cuerpo celular y las dendritas proximales y distales son claramente visibles en secciones fijas.

Aquí se muestra el marcaje típico de una inyección viral intracraneal en la corteza visual primaria. Observe el grado de propagación viral, así como las neuronas, la glía y los procesos marcados. La inyección del vector viral en el hipocampo también da como resultado células marcadas claramente visibles como se muestra en esta imagen, una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener mucho cuidado al bajar y aumentar el microFIT en el cerebro. No olvide que trabajar con vectores virales puede ser extremadamente peligroso. Siga siempre los procedimientos adecuados para el manejo de agentes biopeligrosos establecidos por los Centros para el Control de Enfermedades.

Consulte a la oficina de seguridad de su institución para obtener aprobación y orientación antes de realizar experimentos con virus.