El microbolsa Ensayo corneal: un modelo de angiogénesis en el ojo del ratón

El objetivo general de este procedimiento es estimular el crecimiento de los vasos sanguíneos en la córnea del ratón. Esto se logra primero haciendo pellets que contienen factor de crecimiento. El segundo paso es realizar la implantación quirúrgica de un pellet en la córnea.

Luego, los ratones se dejan durante cinco o seis días, dependiendo del factor de crecimiento para permitir el desarrollo de los vasos. El paso final es la cuantificación del área de los vasos, utilizando un microscopio de lámpara de hendidura para medir la longitud media de los vasos y la distancia alrededor de la circunferencia del ojo a la que han crecido los vasos. En última instancia, el ensayo de microbolsa corneal se utiliza como un método reproducible y fiable para el estudio de la angiogénesis in vivo.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la naturaleza técnicamente delicada del procedimiento. Los investigadores deben anticipar una práctica extensiva antes de los ensayos experimentales para garantizar la coherencia tanto en las técnicas quirúrgicas como en las de clasificación. Comience la preparación de los gránulos pesando 10 miligramos de suc fate y 60 miligramos de hidrón con una espátula estéril sin doblar y colóquelos en tubos de microcentrífuga separados.

Coloque una pieza cuadrada de malla de nailon de un centímetro en un plato estéril de 10 centímetros. Inviértelo para que la malla descanse sobre la tapa poco profunda y déjalo a un lado. A continuación, agregue 500 microlitros de etanol al hidrón y pórtice durante al menos 10 minutos.

Recupere un vial de factor de crecimiento del factor de crecimiento del congelador menos 80. El caldo debe estar en una concentración de un miligramo por mililitro. A continuación, añada la cantidad adecuada de factor de crecimiento al suc destino.

El volumen agregado debe ser de un mínimo de 20 microlitros para garantizar que el sucre se humedezca por completo, pero no debe exceder los 50 microlitros para garantizar que se pueda evaporar fácilmente. Después de agregar el vórtice del factor de crecimiento, coloque brevemente la mezcla del factor de crecimiento sucre fate en el evaporador centrífugo configurado a fuego lento durante 30 a 50 minutos, dependiendo del volumen de líquido utilizado. Al terminar, la mezcla debe estar completamente seca.

Revise la mezcla en busca de humedad residual con el extremo cónico de una espátula estéril. La mezcla debe sentirse crujiente cuando esté seca. Proceda a usar la espátula para romper la mezcla de salate.

En este punto, retire la tapa que cubre la malla de nailon para que la malla esté lista para el siguiente paso. A continuación, prepárese para añadir el hidrón cortando el extremo de una punta de pipeta de 200 microlitros. Debido a la naturaleza viscosa del hidrón, extraiga y libere 10 microlitros del hidrón antes de pipetearlo nuevamente y agregarlo al desvanecimiento suc.

Use una espátula doblada para mezclar rápidamente el hidrón y succionar el destino. Luego, reúna la mezcla a lo largo de la parte inferior de la punta de la espátula y gire el tubo mientras extiende la espátula a lo largo de la pared del tubo. La mezcla se seca rápidamente, por lo que este paso debe realizarse de manera eficiente.

Ahora, sosteniendo la malla preparada en su lugar con pinzas, extienda la mezcla del factor de crecimiento hydron suc fate sobre la malla. La mezcla debe ser una capa uniforme y rellenar los agujeros de la malla. Sumerge la espátula doblada en el tubo que contiene el hidrón y úsala para cubrir la parte superior e inferior de la malla.

Apoye la malla recubierta de lado contra el borde del plato y déjelo secar a temperatura ambiente durante 30 a 45 minutos después de que la malla se haya secado, coloque el plato de 35 milímetros que contiene la malla dentro de una placa de Petri más grande. Use un par de pinzas para separar con cuidado las fibras de la malla sobre el plato de 35 milímetros. Esta acción rompe la mezcla seca en gránulos.

Al final, golpee el plato más grande para desalojar las bolitas perdidas en el plato más pequeño. Verifique la uniformidad de los gránulos debajo de un visor. Este proceso produce aproximadamente 250 pellets.

Después de pegar la tapa, los pellets se pueden almacenar en un plato de 35 milímetros en un congelador de menos 20 grados centígrados hasta por tres meses. Después de anestesiar a un ratón con ton, coloque el ratón bajo un microscopio quirúrgico para que se vea un ojo y realice un pellizco en el dedo del pie. Para asegurar un nivel suficiente de anestesia, anestesia el ojo del ratón colocando una gota de propano en el globo ocular.

Espere de 20 a 30 segundos y frote con una gasa. Use unas pinzas de joyero número uno desafiladas y tenga cuidado de dejar piel entre las pinzas y el apoyo ocular al ojo. Es importante evitar una sujeción demasiado firme o demasiado floja.

Use un microbisturí de 30 grados para hacer una incisión de uno a dos milímetros en la córnea aproximadamente a un milímetro del limbo. La incisión debe ser lo suficientemente profunda como para penetrar más allá de la capa epitelial en el estroma medio, pero no tan profunda como para romper el ojo. Deslice un bisturí de injerto von debajo de la capa córnea en el sitio de la incisión y trabaje suavemente el bisturí y muévalo a lo largo de la incisión para ampliar el espacio.

Formando así una bolsa perpendicular a la incisión. Ayuda a mover el ratón para trabajar con la curvatura del ojo. Tenga cuidado de no empujar hacia abajo con la punta para evitar romper el ojo.

Después de mojar una pinza de joyero número cinco con propano, tome una bolita del plato y colóquela en el ojo. A continuación, humedezca el cuchillo de injerto von con propano y transfiera parte del líquido al pellet para que quede gomoso y flexible. Elimine el exceso de humedad con una gasa o un hisopo de algodón.

Ahora use el cuchillo de injerto von para empujar el pellet dentro del bolsillo debajo de la capa córnea. Una vez que todo el pellet esté dentro, pase el lado plano del cuchillo de injerto von sobre el sitio para verificar que el pellet esté seguro. En este punto, cubra el ojo con una pomada antibiótica triple y voltee el ratón para repetir la cirugía en el otro ojo.

Después de dejar pasar varios días para la neovascularización, anestesiar al ratón con tonelada. Se utiliza un microscopio de lámpara de hendidura para la clasificación. Un ocular tiene un ridículo, que son líneas dentro del ocular, que se utilizan como ayuda de medición para cuantificar la longitud de los vasos y la distancia alrededor de la circunferencia del ojo de los que han brotado los vasos.

Ahora sostenga el mouse frente al visor, colocándolo de modo que el ojo se vea en el ocular con el perdigón directamente al frente. Use el pulgar y el índice para estabilizar la cabeza de modo que la piel se apriete en la cara y el ojo quede ligeramente tostado. Coloque el eje Y de la ridiculización a lo largo del vaso limbal directamente debajo del perdigón.

Luego mida la longitud de los vasos que se ramifican hacia arriba hacia los gránulos. Registre esta medida en decenas de milímetros y designe a medida que la longitud del vaso gire el ratón o el ridículo para que la distancia alrededor del ojo a la que han brotado estos vasos se haga clara. Es más fácil pensar en el ojo como la esfera de un reloj con intervalos del uno al 12.

Designe la distancia a la que han brotado los vasos como la hora del reloj. La hora del reloj puede ser un número entero o fracciones de 0,25 y es subjetiva. Continúe haciendo mediciones de la misma manera que los otros ratones.

Si bien es posible ver el ojo de frente, la vista lateral tiende a dar la mayor cantidad de información. Sin embargo, la vista lateral solo muestra alrededor del 25% de la circunferencia, por lo que es necesario girar el mouse para obtener una imagen completa. El área del recipiente se calcula como la longitud del recipiente multiplicada por el reloj, la hora por 0,2 pi.

Este cálculo se basa en el área de un óvalo. En esta imagen, la longitud medida del recipiente es de 0,9 milímetros y la hora del reloj es de 3,25. Por lo tanto, el área del recipiente calculada es de 1,84 milímetros cuadrados.

Aquí se muestra la neovascularización corneal inducida por factores de crecimiento. La implantación de un pellet básico de FGF de 80 nanogramos en un ratón negro de seis angiogenicas bajas dio como resultado un área de vasos igual a 2,0 milímetros cuadrados. Es muy común que esta dosis haga que los vasos lleguen a la peleta y crezcan en ella.

Un perdigón básico de FGF de 20 nanogramos implantado en un ratón negro seis dio como resultado un área de vaso igual a 1,04 milímetros cuadrados. Un perdigón de VEGF de 200 nanogramos implantado en un ratón negro de seis dio como resultado un área de vaso igual a 0,71 milímetros cuadrados. El área neovascular de la córnea en seis ratones negros aumentó con el aumento de las dosis de VEGF o FGF básico.

Cuando se implantó un pellet básico de FGF de 20 nanogramos en la cepa 1 2 9 de alta angiogenia, se observó un potencial angiogénico mayor que el doble que el de los seis ratones negros. El fármaco antiangiogénico talidomida inhibió la neovascularización básica impulsada por FGF. El tratamiento resultó en una inhibición del 38% del crecimiento de los vasos en comparación con los controles que solo recibieron el pellet básico de FGF.

Los hifemas pueden dificultar o imposibilitar la graduación de la neovascularización corneal. Aquí se muestra un hifema leve en esta imagen de un hifema severo. Todo el ojo tiene un tinte rojizo y hay charcos pronunciados de sangre más cerca de la parte inferior del iris.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe relajarse y ser paciente. Cuanto más practique la técnica quirúrgica y el método de clasificación, más reproducibles y fiables serán los resultados.