Forzado de la salivación como un método para analizar la competencia de vectores de mosquitos

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades transmitidas por mosquitos, como si una especie de mosquito es o no un vector competente para un determinado virus. La principal ventaja de este método es que se puede analizar una gran cantidad de mosquitos simultáneamente, sin el uso de animales de laboratorio como ratones. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque necesita habilidades motoras finas que solo se pueden adquirir con la práctica.

La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que los pasos clave son difíciles de aprender; Requieren experiencia en el manejo de mosquitos y virus, y también habilidades motoras finas. Para empezar, diluya el stock de virus. A continuación, mezcle la sangre humana caducada con la fructosa, el suero bovino filtrado y el caldo de virus.

Congele 140 microlitros de mezcla de harina de sangre para su posterior análisis a través de TCID50. A continuación, coloque dos gotas de 50 microlitros de la mezcla de harina de sangre en un vial de plástico y deje que los mosquitos se alimenten durante dos horas. Después de anestesiar a los mosquitos, cuente los individuos completamente hinchados y transfiéralos a un nuevo frasco que contenga una almohadilla de algodón empapada en fructosa.

Luego, mantenga los mosquitos a 27 grados centígrados y 80% de humedad durante 14 o 21 días. Reponga las almohadillas de algodón saturadas de fructosa cada 72 horas con 1,5 mililitros de fructosa. Primero, siembre 20.000 células Vero por pocillo en una placa de 96 pocillos con medio de crecimiento suplementado.

Para preparar el dispositivo de salivación, coloque una placa de vidrio cuadrada sobre el banco en un ángulo de 30 grados. Luego, adhiera cinta adhesiva de doble cara a la parte superior de la placa de vidrio. A continuación, enrolle la arcilla para modelar hasta que tenga 0,5 centímetros de diámetro y fíjela a la placa horizontalmente a un centímetro de distancia de la cinta de doble cara.

Corte las puntas del número requerido de puntas de filtro de 10 microlitros y llene cada punta con 10 microlitros de PBS. Luego, coloque las puntas sobre la arcilla para modelar y asegúrelas con una presión suave. A continuación, inmovilice a los mosquitos quitándoles las patas y las alas.

Fije los mosquitos a la cinta adhesiva sobre las puntas del filtro. Coloque suavemente la probóscide de cada mosquito en la punta de un filtro. Después de 30 minutos, retire las puntas del filtro y deseche la arcilla y la cinta adhesiva.

Transfiera la saliva recolectada a tubos de reacción que contengan 10 microlitros de PBS. Mezcle la saliva y el PBS suavemente y transfiera la mezcla a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Incubar la placa durante siete días a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.

Con un microscopio óptico, verifique la presencia de efecto citopático en las células. Una vez que un pocillo es positivo para el efecto citopático, use una pipeta para cosechar 140 microlitros del sobrenadante. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo de reacción.

A continuación, mezcle 140 microlitros del sobrenadante con 560 microlitros de tampón AVL e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, agregue 560 microlitros de etanol e invierta la muestra para mezclar. Utilizando este protocolo, varias especies de mosquitos fueron analizadas para detectar la infección y transmisión del virus del Zika en diversas condiciones climáticas.

En condiciones de incubación a 27 grados centígrados, todas las especies de Aedes mostraron saliva positiva para el virus del Zika. Por el contrario, ninguna de las muestras de saliva de los taxones de Culex contenía evidencia del virus. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar para 50 mosquitos en una hora si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de salivación forzada. No olvide que trabajar con mosquitos infectados puede ser muy peligroso, por lo que siempre se deben tomar medidas de seguridad especiales para el manejo de mosquitos en condiciones BSA-3 al realizar cualquier experimento.