Forzado de la salivación como un método para analizar la competencia de vectores de mosquitos
7 de agosto de 2018
Para el eficiente control de mosquito transmitidas por transmisión del virus, el conocimiento del potencial vector de mosquitos respectivos es de particular interés. Describimos la salivación forzada como un método para analizar la competencia vectorial de Aedes albopictus y tres taxones diferentes de Culex para la transmisión del virus Zika.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades transmitidas por mosquitos, como si una especie de mosquito es o no un vector competente para un determinado virus. La principal ventaja de este método es que se puede analizar una gran cantidad de mosquitos simultáneamente, sin el uso de animales de laboratorio como ratones. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque necesita habilidades motoras finas que solo se pueden adquirir con la práctica.
La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que los pasos clave son difíciles de aprender; Requieren experiencia en el manejo de mosquitos y virus, y también habilidades motoras finas. Para empezar, diluya el stock de virus. A continuación, mezcle la sangre humana caducada con la fructosa, el suero bovino filtrado y el caldo de virus.
Congele 140 microlitros de mezcla de harina de sangre para su posterior análisis a través de TCID50. A continuación, coloque dos gotas de 50 microlitros de la mezcla de harina de sangre en un vial de plástico y deje que los mosquitos se alimenten durante dos horas. Después de anestesiar a los mosquitos, cuente los individuos completamente hinchados y transfiéralos a un nuevo frasco que contenga una almohadilla de algodón empapada en fructosa.
Luego, mantenga los mosquitos a 27 grados centígrados y 80% de humedad durante 14 o 21 días. Reponga las almohadillas de algodón saturadas de fructosa cada 72 horas con 1,5 mililitros de fructosa. Primero, siembre 20.000 células Vero por pocillo en una placa de 96 pocillos con medio de crecimiento suplementado.
Para preparar el dispositivo de salivación, coloque una placa de vidrio cuadrada sobre el banco en un ángulo de 30 grados. Luego, adhiera cinta adhesiva de doble cara a la parte superior de la placa de vidrio. A continuación, enrolle la arcilla para modelar hasta que tenga 0,5 centímetros de diámetro y fíjela a la placa horizontalmente a un centímetro de distancia de la cinta de doble cara.
Corte las puntas del número requerido de puntas de filtro de 10 microlitros y llene cada punta con 10 microlitros de PBS. Luego, coloque las puntas sobre la arcilla para modelar y asegúrelas con una presión suave. A continuación, inmovilice a los mosquitos quitándoles las patas y las alas.
Fije los mosquitos a la cinta adhesiva sobre las puntas del filtro. Coloque suavemente la probóscide de cada mosquito en la punta de un filtro. Después de 30 minutos, retire las puntas del filtro y deseche la arcilla y la cinta adhesiva.
Transfiera la saliva recolectada a tubos de reacción que contengan 10 microlitros de PBS. Mezcle la saliva y el PBS suavemente y transfiera la mezcla a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Incubar la placa durante siete días a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Con un microscopio óptico, verifique la presencia de efecto citopático en las células. Una vez que un pocillo es positivo para el efecto citopático, use una pipeta para cosechar 140 microlitros del sobrenadante. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo de reacción.
A continuación, mezcle 140 microlitros del sobrenadante con 560 microlitros de tampón AVL e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, agregue 560 microlitros de etanol e invierta la muestra para mezclar. Utilizando este protocolo, varias especies de mosquitos fueron analizadas para detectar la infección y transmisión del virus del Zika en diversas condiciones climáticas.
En condiciones de incubación a 27 grados centígrados, todas las especies de Aedes mostraron saliva positiva para el virus del Zika. Por el contrario, ninguna de las muestras de saliva de los taxones de Culex contenía evidencia del virus. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar para 50 mosquitos en una hora si se realiza correctamente.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de salivación forzada. No olvide que trabajar con mosquitos infectados puede ser muy peligroso, por lo que siempre se deben tomar medidas de seguridad especiales para el manejo de mosquitos en condiciones BSA-3 al realizar cualquier experimento.
Visión general
Este artículo discute un método para analizar la competencia vectorial de los mosquitos, específicamente Aedes albopictus y varios taxones de Culex, para la transmisión del virus del Zika. La técnica de salivación forzada permite el análisis simultáneo de múltiples mosquitos sin el uso de animales de laboratorio.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología de vectores
- Virología
- Enfermedades transmitidas por mosquitos
Antecedentes
- Entender la competencia vectorial es crucial para controlar los virus transmitidos por mosquitos.
- La salivación forzada es un método novedoso para evaluar el potencial de transmisión de mosquitos.
- Los métodos anteriores a menudo requerían animales de laboratorio, lo cual esta técnica busca eliminar.
- Las habilidades motoras finas son esenciales para este método, necesitando práctica y experiencia.
Propósito del estudio
- Evaluar la competencia vectorial de diferentes especies de mosquitos para el virus del Zika.
- Demostrar un método que permita el análisis de alto rendimiento de la saliva de mosquitos.
- Proporcionar una guía visual para investigadores nuevos en la técnica.
Métodos utilizados
- Preparación de una mezcla de sangre para la alimentación de mosquitos.
- Técnica de salivación forzada para recolectar saliva de mosquitos.
- Métodos de cultivo celular para evaluar la presencia del virus del Zika.
- Incubación y análisis de muestras para efectos citopatógenos.
Resultados principales
- Las especies de Aedes mostraron saliva positiva para el virus del Zika bajo condiciones controladas.
- Los taxones de Culex no exhibieron evidencia del virus del Zika en su saliva.
- El método permite la prueba de hasta 50 mosquitos en una hora una vez dominada.
- Las demostraciones visuales ayudan significativamente en el aprendizaje de la técnica.
Conclusiones
- La salivación forzada es un método efectivo para estudiar la transmisión de virus transmitidos por mosquitos.
- La formación y práctica son esenciales para la implementación exitosa de la técnica.
- Se deben cumplir las medidas de seguridad al manipular mosquitos infectados.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Forced salivation assays enable high-throughput evaluation of mosquito vector competence without animal models, supporting early-stage target validation in antiviral discovery. The method provides quantitative, replication-competent virus detection from individual insects, informing go/no-go decisions for prophylactic or therapeutic candidates against arboviruses. Its scalability and reproducibility enhance predictive confidence in preclinical de-risking of transmission-blocking interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring virus transmission potential in individual disease vectors.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets through direct assessment of vector competence under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying non-competent vector species, reducing false-positive leads in arbovirus programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral screening by confirming virus susceptibility in vector models.
- Operational Value: Standardizes saliva collection and virus detection, ensuring reproducible quantitative outputs across large mosquito cohorts.
- Scalability: Facilitates platform reuse for high-throughput evaluation of transmission-blocking compounds or vaccines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing vector competence under epidemiologically relevant temperatures (18–27°C).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via consistent saliva-based virus readouts.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by establishing temperature-dependent transmission thresholds for lead candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The forced salivation method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for arbovirus-directed interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus presence in mosquito saliva as a functional readout of transmission potential.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized saliva collection and TCID50-equivalent virus detection in Vero cells.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (viral titer in saliva) enabling comparison across species, strains, and environmental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via temperature-stratified transmission data that mirrors field-relevant transmission windows.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening multiple arboviruses (e.g., ZIKV, DENV, CHIKV) across vector species without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in transmission biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across entomology and virology teams.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on empirical vector competence data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, virology, and microsurgical techniques under BSL-3 containment.
- Dependent on specialized instrumentation including salivation devices, incubators with precise humidity control, and microscopy for cytopathic effect scoring.
- Necessitates cross-team standardization of bloodmeal preparation, incubation timelines, and saliva collection intervals.
- Adaptation considerations include species-specific proboscis size, feeding behavior, and salivary gland morphology across vector models.
- Practical limitations include the need for extensive training to achieve proficiency and the method’s dependence on viable virus recovery from saliva.
