Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el metabolismo cerebral de Drosophila y cómo la proliferación excesiva de células gliales afecta la reprogramación metabólica, ya sea que la dieta o el comportamiento alteren el metabolismo. La principal ventaja de esta técnica es que los cerebros de las moscas se pueden analizar metabólicamente como un tejido entero e intacto, con resultados reproducibles obtenidos a partir de la medición de un solo cerebro a la vez. Aunque este método puede proporcionar información sobre el metabolismo del cerebro de la mosca, también se puede aplicar a otros tejidos y sistemas de modelos, como los discos imaginales y C. elegans, respectivamente.

Para preparar las restricciones de microtejidos, seleccione en el recipiente de almacenamiento una restricción de microtejidos por cerebro que se esté midiendo, más al menos tres para usar como controles de solo restricción. Usando una canasta de malla y una placa de seis pocillos, enjuague las restricciones con etanol al setenta por ciento y lávelas con agua desionizada tres veces, cada vez durante dos minutos. Realice lavados adicionales con agua si las restricciones aún desprenden olor a alcohol.

Lave las restricciones de microtejido en medios de ensayo y déjelas en la solución hasta que estén listas para su uso. Para diseccionar el cerebro de la larva de Drosophila melanogaster, seleccione las larvas del tercer estadio tardío de un vial de moscas Organ R cultivadas. Coloque la larva en el pocillo de una placa de disección limpia que contenga 500 microlitros de 1x PBS.

A continuación, lave la larva agitándola suavemente en el pozo y transfiérala a otro pozo limpio. A continuación, coloque la placa puntual bajo el microscopio de disección. Sujete la larva por su sección media con un par de pinzas mientras sujeta los ganchos de ojo con un segundo par de pinzas.

Tire suave y suavemente de la larva en direcciones opuestas con los dos juegos de pinzas. Visualice el cerebro, que generalmente permanece unido a los ganchos oculares y comúnmente tiene discos de antenas oculares unidos a él. Usando los ganchos oculares para mantener el cerebro en su lugar, retire con cuidado los tejidos adicionales.

Por último, separe los ganchos oculares del cerebro. Luego, use pinzas para transferir el cerebro diseccionado a un nuevo pozo que contenga 1x PBS. Para agregar los cerebros disecados a una placa de ensayo metabólico de 96 pocillos, primero agregue 50 microlitros de medio de ensayo a todos los pocillos, incluidos los pozos experimentales, de control, de solo restricción y de fondo.

Luego, coloque cuidadosamente un cerebro en cada pozo. Bajo el microscopio de disección, use una microsonda de aguja doblada para presionar los cerebros contra el fondo del pozo. Coloque suavemente los cerebros en el centro de las tres esferas elevadas con la sonda.

Para añadir una restricción de microtejido a la placa de ensayo metabólico de 96 pocillos, primero colóquela en el borde. Bajo un microscopio, oriéntelo con el anillo de plástico hacia abajo y la malla en la parte superior. A continuación, retire la placa del microscopio.

Use las pinzas para agarrar la sujeción por ambos lados y déjela caer suavemente en el pozo. Use una microsonda de aguja doblada para presionar la restricción hacia abajo en el pozo. Las restricciones de microtejido deben colocarse correctamente sobre el cerebro centrado en cada pocillo para que esta técnica proporcione resultados significativos.

Bajo el microscopio, verifique que el cerebro disecado se pueda ver a través de la restricción de tejido y que esté centrado en el pocillo y repita el procedimiento para todos los pocillos que se utilizarán en el ensayo. Agregue con cuidado 130 microlitros de medio de ensayo a cada uno de los pocillos experimentales, de control y de solo restricción. Verifique que los cerebros y las restricciones de microtejidos no se hayan movido mientras agrega los medios.

A continuación, añada 180 microlitros de medio de ensayo a los cuatro pocillos de las esquinas para utilizarlos como control de fondo. En este procedimiento, retire la placa de utilidad y agregue la placa de celdas sin la tapa en la misma orientación al analizador metabólico. Seleccione "Placa de celda de carga" para que el instrumento tome la placa de celda y cierre la bandeja y luego comience el ensayo.

Una vez finalizado el ensayo, retire la placa de celda expulsada y el cartucho. Con un microscopio de disección, verifique que los cerebros y las restricciones de microtejido aún estén colocados correctamente en el pocillo después de que se haya completado el ensayo y excluya cualquier pocillo con anomalías del análisis. Cuando se siguen las condiciones optimizadas, los ensayos con los cerebros de larvas y adultos dan como resultado lecturas de OCR ligeramente superiores a 150 picomoles por minuto en el sexto punto de tiempo estabilizado, aproximadamente a los 25 minutos del ensayo.

Esta tasa se mantiene durante al menos 30 minutos y hasta dos horas. El ECAR es ligeramente más bajo en los cerebros de los adultos que en los cerebros de las larvas en el sexto punto de tiempo y se mantiene durante al menos 30 minutos. Este hallazgo corresponde a un aumento de la glucólisis durante las etapas larvales para apoyar el crecimiento.

Una inyección con un inhibidor mitocondrial, como la oligomicina, reduce las lecturas de OCR para revelar la respiración dependiente de ATP y el tratamiento posterior con rotenona y antimicina A reduce el OCR para revelar el consumo de oxígeno no mitocondrial. Al intentar este procedimiento, es importante recordar centrar el cerebro y asegurarse de que la restricción del microtejido esté asegurada en su lugar antes de realizar el ensayo y durante el análisis. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR cuantitativa y el análisis de Western blot para responder preguntas adicionales sobre cómo la expresión génica contribuye al fenotipo metabólico observado.