Administración de anticuerpos en el cerebro mediante ultrasonido de barrido enfocado

Aquí se presenta un protocolo para abrir transitoriamente la barrera hematoencefálica (BBB) ya sea focalmente o en todo el cerebro de un ratón para administrar anticuerpos marcados fluorescentemente y activar la microglía. También se presenta un método para detectar la administración de anticuerpos y la activación de la microglía por histología.

Solo una pequeña fracción de los anticuerpos terapéuticos son absorbidos por el cerebro. Con nuestro método, los anticuerpos se administran en el cerebro mediante la apertura transitoria de la barrera hematoencefálica. Esta técnica nos permite administrar anticuerpos en el cerebro del ratón de una manera no invasiva.

Para realizar el control de calidad de las microburbujas utilizando un contador de células, retire la solución de microburbujas del amalgamador y use una aguja de calibre 19 para perforar el tabique del vial de solución de microburbujas. Utilice una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 19 para diluir 100 microlitros de microburbujas en cinco mililitros de solución de flujo filtrada y pipetee 100 microlitros de la solución de microburbujas diluida en 10 mililitros de solución de flujo filtrada en una cubeta. Bloquee la cubeta en su lugar en la plataforma del contador de celdas y asegúrese de que se utilizará una apertura de 30 micras para la adquisición de la muestra.

En el software, cargue el método de funcionamiento estándar y seleccione editar el método de funcionamiento estándar y la concentración. Introduzca 5.000 veces para la dilución y haga clic en aplicar y Aceptar. Haga clic en editar información para seleccionar un nombre de archivo adecuado. Seleccione Vista previa y verifique que la concentración de la muestra de microburbujas sea inferior al 10%Seleccione iniciar y Aceptar para comenzar la adquisición de la muestra.

Después de la medición, enjuague la abertura del contador de celdas con una solución de flujo filtrada. Sonicar la cubeta de solución diluida de microburbujas durante 30 segundos en un baño de agua. Mida la solución de microburbujas sonicadas como se muestra y haga clic en editar información para etiquetar los datos como en blanco.

Después de medir el blanco, reste la lectura final de la lectura inicial para excluir cualquier partícula que no sea microburbujas. Para etiquetar las secciones con anticuerpo IgG fluorescente anti-ratón, etiquete un miligramo de anticuerpo IgG de ratón con Alexa Flour 647 en tampón de bicarbonato de sodio 0,1 molar de acuerdo con las instrucciones del fabricante durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, cargue la solución de anticuerpos marcados con fluorescencia en una columna de centrifugación y purifique el anticuerpo por centrifugación.

A continuación, utilice un espectrofotómetro para medir la concentración de proteínas. Para configurar el sistema de ultrasonido de barrido enfocado, agregue un espacio de cinco milímetros al bolo de agua para colocar el foco de ultrasonido nueve milímetros por debajo de la parte inferior del bolo de agua. Llene el bolo de agua con aproximadamente 300 mililitros de agua desionizada desgasificada y coloque la matriz anular en el bolo de agua lleno.

Utilice un espejo dental para comprobar que no haya burbujas de aire en la superficie e inicie el software de la aplicación. En el menú de forma de onda, seleccione establecer el ciclo de trabajo de la forma de onda y establezca la frecuencia de repetición de pulsos en 10 hercios, el ciclo de trabajo en 10%, el enfoque en 80 milímetros, la frecuencia central en un megahercio, la amplitud en 0,65 megapascales y el índice mecánico en 0,65. Presione establecer para definir la forma de onda y almacenar la forma de onda en la memoria.

Después de seleccionar el plan de tratamiento, abra la pestaña de escaneo en la ventana del controlador de movimiento e introduzca los valores de inicio, parada e incremento para el movimiento en la dimensión X y los valores de inicio, parada e incremento para el movimiento en la dirección Y. Para definir las acciones para los sitios de tratamiento, haga clic en evento y abra la ventana de edición de scripts. Seleccione una lista de acciones que se ejecutarán en el orden seleccionado en cada sitio de tratamiento y establezca el tipo de movimiento en cuadrícula ráster.

En la pestaña de eventos, seleccione agregar acciones y mueva las acciones de movimiento ARB de inicio sincrónico de ARB de activación de inicio y detención de ARB al panel de scripts. A continuación, haga clic en acción de espera y seleccione un tiempo de espera de 6.000 milisegundos. Para preparar a un animal para el análisis, después de confirmar una falta de respuesta al pellizco de los dedos del pie en un ratón anestesiado, use un marcador permanente para etiquetar el centro de la cabeza, luego pegue una envoltura de plástico en el fondo de un bote de pesaje pequeño con el corte inferior y llene el bote de pesaje con gel de ultrasonido.

Para un tratamiento de ultrasonido focalizado, invierta el frasco de microburbujas y cargue suavemente un microlitro de la solución por gramo del peso corporal del ratón en una jeringa de insulina de calibre 29. Agregue 100 microlitros de anticuerpo marcado con fluorescencia a la jeringa e invierta y haga rodar suavemente la jeringa entre el pulgar y el dedo índice para mezclar el anticuerpo y las microburbujas dentro de la jeringa. Inyecte retroorbitalmente con cuidado y lentamente 150 microlitros de la solución de microburbujas y anticuerpos en el ratón y programe un temporizador durante dos minutos.

Aplique ungüento oftálmico, luego coloque el mouse en el soporte de la cabeza y fije su nariz en el soporte. Coloque el pequeño bote de pesaje lleno de gel de ultrasonido en la parte superior de la cabeza y baje el bolo de agua hasta que se asiente sobre el gel de ultrasonido dentro del bote de pesaje. A continuación, utilice el joystick para alinear visualmente el enfoque del transductor en el centro de la cabeza.

Cuando el temporizador se apague, en la pestaña de movimiento del software, seleccione restablecer origen y seleccione un escaneo completo. Una vez finalizado el tratamiento, aplique ungüento oftálmico en los ojos del animal y coloque al ratón en una cámara de recuperación calentada. Aquí se muestran los resultados representativos de las mediciones del contador de cultivo del tamaño y la concentración que se pueden obtener cuando las microburbujas se producen correctamente.

La absorción de anticuerpos por el cerebro se puede visualizar fácilmente en todo el cerebro o en secciones de tejido utilizando un escáner infrarrojo o una microscopía fluorescente de las secciones. Como se demuestra en estas imágenes, la tinción representativa de los marcadores de microglía se puede utilizar para determinar si la microglía se vuelve más fagocítica después de la administración del anticuerpo. Es importante garantizar el bienestar y la seguridad de los animales, especialmente cuando se realizan las inyecciones retroorbitales y se aplica el transductor por encima de las cabezas de los ratones.

Este método permite la aplicación de varios patrones de escaneo para dirigirse a diferentes regiones del cerebro, como el hipocampo, la corteza o los hemisferios cerebrales individuales. Esta técnica se puede utilizar para desarrollar nuevas terapias y fármacos que penetren en la barrera hematoencefálica y para estudiar el mecanismo de formación y apertura de la barrera hematoencefálica.