Abstract
Эмбриональной почки из Xenopus Laevis (лягушки), предпочки, состоит из одного нефрона, и может быть использован в качестве модели для заболевания почек. Xenopus эмбрионы велики, развиваются внешне, и можно легко манипулировать с помощью микроинъекции или хирургическими процедурами. Кроме того, карты судьбы были установлены для ранних эмбрионов Xenopus. Целенаправленное микроинъекции в индивидуальную бластомере, которые в конечном счете приводят к возникновению органа или ткани интерес может быть использован для селективного гиперэкспрессией или сбить экспрессию генов в этой ограниченной области, уменьшение вторичных эффектов в остальной части развивающегося эмбриона. В этом протоколе мы опишем , как использовать установленные карты судьбы Xenopus целевой развивающийся Xenopus почки (Предпочка) через микроинъекции в конкретные бластомере 4- и 8-клеточных эмбрионов. Инъекции линиджа трассеров позволяет проверить конкретного нацеливания инъекции.После того, как зародыши развились до стадии 38 - 40, в целом монтажа иммуноокрашивания используется для визуализации pronephric развития, а также вклад целевых клеток к предпочки могут быть оценены. Тот же метод может быть адаптирован в отношении других типов тканей, в дополнение к предпочки.
Introduction
Xenopus эмбриональной почки, Предпочка, является хорошей моделью для изучения развития почек и болезней. Эмбрионы развиваются внешне, имеют большие размеры, могут быть получены в больших количествах, и легко манипулировать с помощью микроинъекции или хирургических процедур. Кроме того, гены, регулирующие развитие почек у млекопитающих и земноводных сохраняются. Млекопитающие почки прогрессировать через три этапа: Предпочка, мезонефроса и 1 вторичной почки, в то время как эмбриональные амфибии имеют Предпочка и взрослые амфибии имеют вторичной почки. Основная фильтрация единица этих форм почек является нефрон, и оба млекопитающих и земноводных требуют те же сигнальные каскады и индуктивные события пройти нефрогенеза 2, 3. Предпочка Xenopus содержит один нефрона , состоящий из проксимального, промежуточного, дистальной и соединительной трубочки, и гломусных (аналог клубочках млекопитающих) 1, 4-6 (рис 1 Xenopus делает его пригодным в качестве простой модели для изучения генов , участвующих в процессах развития почек и болезней.
Карты судьбы клеток были созданы для ранних эмбрионов Xenopus, и находятся в свободном доступе в Интернете по адресу Xenbase 7-11. Здесь мы описываем технику для микроинъекции линиджа трассеров для нацеливания развивающиеся Xenopus пронефрос, хотя и тот же метод может быть адаптирован к целевой других тканей , таких как сердце или глаз. Lineage трейсеры ярлыки (в том числе жизненно важных красителей, флуоресцентно меченных декстранов, гистохимического обнаруживаемых ферментов и мРНК, кодирующие флуоресцентные белки), которые могут быть введены в раннем бластомере, что позволяет визуализировать потомству этой клетки в процессе разработки. Этот протокол использует MEM-RFP мРНК, кодирующий мембранный целевой красный флуоресцентный белок 12, как клонального трассера. Целенаправленное микроинъекции технологийniques для отдельных бластомеров в 4- и 8-клеточных эмбрионов, описанных здесь, могут быть использованы для инъекций с Morpholinos, чтобы сбить экспрессию гена или экзогенной РНК гиперэкспрессией гена интерес. Путем введения в брюшную, вегетативного бластомере, в первую очередь Предпочка эмбриона будут направлены, в результате чего контралатеральной Предпочка в качестве контроля развития. Co-инъекция трассера проверяет, правильно бластомеров инъецируют, и показывает, какие ткани в эмбрионе возникла из введенного бластомере, проверяя адресности предпочки. Иммуноокрашивание предпочки позволяет визуализировать, как хорошо pronephric трубочки были направлены. Избыточной экспрессии и нокдаун эффекты затем может быть забит против контралатеральной стороне эмбриона, который служит в качестве контроля развития, и может быть использовано для вычисления pronephric 13 индекса. Наличие клеточной судьбы карты позволяет этому целенаправленный метод микроинъекции быть использована для целевых тканей OTHэр чем предпочки и совместной инъекции флуоресцентного индикатора позволяет направленно микроинъекции в каждой ткани, чтобы быть проверены перед проведением анализа.
Во время эмбрионального микроинъекции, температура развития должна регулироваться плотно, учитывая , что темпы развития Xenopus сильно зависит от него 14. Эмбрионы следует инкубировать при более низких температурах (14 - 16 ° С) в течение 4- и 8-клеточных инъекций, так как время развития замедляется. При 22 ° С, время разработки от стадии 1 (1) клетки к стадии 3 (4 ячейки) составляет приблизительно 2 часа, в то время как 16 время разработки ° C до стадии 3 составляет около 4 часов. Она занимает около 15 минут, чтобы перейти от 4-клеточного эмбриона к 8-элементная (стадия 4) эмбриона при 22 ° С, но занимает примерно 30 минут при 16 ° С. Аналогичным образом, при 22 ° С, это займет всего 30 минут для 8-клеточного эмбриона прогрессировать до 16-клеточного эмбриона (стадия 5). На этот раз увеличивается до 45 минут при 16 ° С.refore, полезно, чтобы замедлить скорость развития эмбрионов, чтобы дать достаточно времени для инъекций на 8-клеточной стадии, прежде чем эмбрионы прогрессировать до 16-клеточной стадии. Кроме того, температура роста можно модулировать, чтобы ускорить или замедлить развитие эмбриона, пока почки не полностью развита.
Эпидермис головастика стадии Xenopus эмбрионов является относительно прозрачным, что позволяет легко визуализации развивающихся предпочки без рассечения или очистки ткани 15. Из - за относительной прозрачности Xenopus эмбрионов, получение изображений живых клеток также возможно 16,17. Всего монтажа иммунным для визуализации Предпочка можно с установленными антителами , которые маркируют проксимальный, средний, дальний и подсоединению канальцы стадии 38 - 40 эмбрионов , которые позволяют для оценки pronephric развития после целенаправленного воздействия генной экспрессии в Xenopus эмбрионов 18-20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол был одобрен в Университете Техаса Научного центра здоровья в Центре Хьюстона для Комитета лабораторных животных медицины защиты животных, который служит в качестве институциональной помощи и использованию комитета (протокол #: HSC-AWC-13-135).
1. Выявление и отбор бластомеров для почки, ориентированных Инъекции
- Перед генерацией эмбрионов, использовать нормальный Таблица Xenopus развития 21 , чтобы понять ориентацию ранних клеточных делений в эмбрионе. В качестве альтернативы, схемы доступа ранних стадий развития Xenopus на Xenbase 11.
- Получить доступ к интерактивной карты Xenopus клеточных судеб на Xenbase 11 , чтобы выбрать , какие бластомер будут направлены для микроинъекции.
- Заметим, что одна клетка эмбриона имеет темно пигментированные животное полюс и вегетативный полюс, который является белым и yolky. Следует отметить, что защитная мембрана, известная как желтковой еnvelope, охватывает зародыш.
- Обратите внимание на то, что первое расщепление обычно происходит между левой и правой сторонами эмбриона. Эти клетки способствуют одинаково pronephric линии.
- Заметим, что второе расщепление делит дорсальной и вентральной половины эмбриона, что приводит к 4-клеточного эмбриона. Спинные клетки имеют меньшие размеры и имеют меньше пигмента , чем вентральных клеток (Фигура 2А и 3А) На рис.
- Определить вентральные бластомеры (V, большие, темные клетки) на левой и правой сторон, которые вносят больший вклад в развивающиеся почки , чем спинной (D, маленькие, светлые клетки) бластомеров (рис 2А).
- Если инъекции в 4-клеточного эмбриона, впрыснуть левую вентральной бластомера, нацеленную на левой почки (рис 3A и раздел 3).
- Третье расщепление делит пополам растительного и животного сторон, в результате чего восемь клеток эмбриона. На данный момент существует четыре животных бластомеры [левый и правый вентральный(V1) и на дорсальной (Д1)] и четыре вегетативные бластомеры [левый и правый вентральный (V2) , и дорсальный (Д2)] (Фигура 2В и 3В).
- Найдите вентральной, вегетативные бластомеры (V2). Эти бластомеры вносят больший вклад в развивающиеся почки любые другие клетки на этой стадии (рис 2В). Чтобы настроить таргетинг на левую почку 8-клеточного эмбриона, вводят в левый V2 бластомере (рис 3B и раздел 3).
- Обратите внимание на то, что четвертый и пятый расколы рассекают растительного и животного бластомеров. Два Потомство генерируются из каждого бластомера, в результате чего 16-клеточного эмбриона. Клетки были названы в честь своего предшественника. Например, V2 бластомеров от 8-клеточной стадии приводит к V2.1 и V2.2 потомством на 16-клеточной стадии (фиг.2с). Ячейка V2.2 на 16-клеточной стадии обеспечивает большинство клеток, вносящих вклад в развивающейся почке.
- Обратите внимание, шестой и седьмой расколы приводят к 32-клеточной Эмбри во. Опять же, два Потомство генерируются из каждого бластомера, которые названы после их предшественника. Так, например, V2.2 бластомеров из 16-клеточной стадии приводит к V2.2.1 и V2.2.2 на стадии 32-клеток. Существует альтернативная система присвоения имен на стадии 32-клеток, в которых клетки идентифицируют в четыре ряда, как А, В, С и D (от животного к растительно), так и в четырех колонках, как 1, 2, 3 и 4 ( от спины к брюху). Таким образом, V2.2.2 бластомеров, что способствует наиболее развивающимся предпочки, называется С3 под этой альтернативной системы именования (рис 2D).
2. Получение Эмбрионы
- Приготовьте 50 мл Dejelly раствора (2% цистеина, NaOH до рН 8,0).
- Изолировать оба семенники из одного самца лягушки в соответствии со стандартными протоколами 14. Поместите семенники в 60 мм чашке Петри заполнены 10 мл семенников решение для хранения данных (1x Марка, Modified Ringers [MMR, 0,1 М NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgSO 4, 2 мМCaCl 2, 5 мМ HEPES , рН 8, 0,1 мМ ЭДТА] 12, 1% бычий сывороточный альбумин, 50 мкг / мл гентамицина). Храните семенники при 4 ° С.
Примечание: Семенники могут храниться в течение приблизительно 7 - 10 дней при температуре 4 ° С, но эффективность удобрений будет уменьшаться, чем дольше семенники были сохранены. - Сожмите женщины лягушки , чтобы получить яйца в соответствии со стандартными протоколами 14. Сбор яйца в 100 мм чашки Петри. Слейте лишнюю воду.
- Отрежьте ¼ из семенников в то время как он находится в яичках решение для хранения данных с помощью пинцета и лезвия бритвы. Перенести кусок семенников в чашку Петри, содержащую яйца. Отрегулируйте размер участка семенников, используемого для учета размера семенника, как долго хранится семенников, и сколько яиц должны быть оплодотворены. Как правило, используют от ¼ до 1/3 свежеприготовленного расчлененным семенника, чтобы оплодотворить одну кладку яиц.
- Вырезать часть семенников на мелкие кусочки с помощью пинцета и лезвия бритвы. Добавьте достаточно 0.3x MMR+ 30 мг / мл гентамицина в чашку Петри, чтобы покрыть яйца. Вихревой MMR в блюдо перемешать.
- Подождите приблизительно 30 минут для оплодотворения иметь место при комнатной температуре. Обратите внимание, что животное полушарие (пигментированный стороне эмбриона) будет сидеть на верхней части эмбриона после эффективного оплодотворения. Затем удалите MMR из чашки Петри с помощью пипетки передачи. Добавьте достаточно Решение Dejelly на блюдо, чтобы покрыть эмбрионов.
- В течение следующих нескольких минут, осторожно встряхните блюдо с перерывами. Энергичного встряхивания блюдо в это время может вызвать дефекты оси. Желе покрытие на зародышах будет растворяться, и эмбрионы будут собираться в центре тарелки во время закрутки. После того как эмбрионы тесно соприкасаются друг с другом в центре тарелки, удалите Dejelly решение с пипетки передачи. Не оставляйте эмбрионов в Dejelly растворе в течение более 5 минут, или эмбрионы могут быть повреждены.
- Вымойте dejellied эмбрионов 3 - 5 раз в 0.3xMMR + 30 мг / мл гентамицина, осторожно поливом или пипеткой от MMR и заполнение блюдо с новым MMR. Не удаляйте все MMR из чашки, или эмбрионы могут быть повреждены.
- Удалите все неоплодотворенные яйца или кусочки семенников из чашки Петри с помощью пипетки передачи.
- Инкубируйте эмбрионов между 14 и 22 ° C.
Примечание: Эмбрионы, выращенные при более низких температурах, развиваются медленнее, чем эмбрионов, выращенных при более высоких температурах. Сроки этапов развития можно найти на Xenbase 22.- Чтобы наРынкиСупермаркеты их развития, место половина эмбрионов из одного оплодотворения в чашке Петри выдерживают при 14 ° С, а другая половина эмбрионов в чашке Петри выдерживают при 18 ° С. Это позволяет для двух наборов вливаний в 4-клеток или 8-клеточных эмбрионов из одного оплодотворения.
3. Подготовка растворов для инъекций и микроинъекции Эмбрионы
- Готовят инъекционный раствор, содержащий 0,01нг / нл мембраносвязанная красный флуоресцентный белок (MEM-RFP) мРНК 9 в то время как эмбрионы развиваются в 4-элементным или 8-клеточной стадии. Храните раствор для инъекций на льду до готовности внедрить.
- Загрузите "капиллярной трубки замены стекла в иглы съемника, с верхней части замены трубки на одной линии с верхней части корпуса иглы съемника. Установите значение тепла # 2 до 800, а значение тянуть до 650. Нажмите" 7 тянуть "кнопку, чтобы вытащить иглу. Это позволит создать 2 иглы из одного 7" стеклянной капиллярной трубки.
- Срежьте кончик иглы вытащил с парой Дюмон щипцов.
Примечание: После извлечения иглы, кончик плотно закрыта и должна быть разрезана. Чем ближе к точке иглы, что она измельчается, тем меньше диаметр кончик иглы будет. Хотя диаметр наконечника не будет влиять на объем впрыска с системой микроинъекции, используемой здесь, наконечник с большим диаметром, более вероятно, повредить зародыш. - Слип мicropipette цанговый на задней части иглы. Далее, проскользнуть большое отверстие уплотнительное кольцо на задней части иглы позади цанги.
- Заполните иглу с минеральным маслом с использованием 27 калибра иглы для подкожных инъекций, соблюдая осторожность, чтобы не получить пузырьков воздуха в игле.
- Наденьте иглу на толкатель microinjector, усаживая иглу в большое отверстие белой пластиковой прокладкой, установленной на поршень. Плунжер должен иметь маленькое уплотнительное кольцо ближе к корпусу microinjector, а затем белой спейсером, большой отверстие уплотнительного кольца и цанги. Закрепите иглу путем затягивания цангу. Аккуратно потяните иглу, чтобы убедиться, что он надежно закреплен.
- Нажмите и удерживайте кнопку "пустой" на блоке управления microinjector пока не останется два звуковых сигнала.
- Пипетка 3 мкл раствора для инъекций на кусок парафильмом. Вставьте кончик иглы в шарик инъекционного раствора на парафильмом. Нажмите и удерживайте кнопку "заполнить" на microinjector блок управления, чтобы сделать инъекции раствора в иглу.
- Заполните блюдо 60 мм Петри выстлана 500 мкм полиэфирной сетки 5% Ficoll в 0.3x MMR + 30 мг / мл гентамицина. Тщательно пипеткой 20 - 30 4-клеток или 8-клеточных эмбрионов в чашку.
- Использование цикла 14 волос, манипулировать эмбрионы так, чтобы бластомеров быть впрыскиваемого перед иглой. Чтобы настроить таргетинг на левой почки, выстраиваются в линию эмбрионов так, чтобы левая вентральные бластомеры 4-клеточных эмбрионов или слева V2 бластомеры 8-клеточных эмбрионов сталкиваются с иглой.
- Вводят 10 нл раствора для инъекций в выбранную бластомере каждого эмбриона в блюдо.
Примечание: Сетка на дне чашки Петри стабилизирует эмбрионов и предотвращает их от прокатки, что позволяет им вводить без использования петли волос для стабилизации. - Передача впрыскивается эмбрионов в лунки планшета для культуры, которые были заполнены с 5% Ficoll в 0.3x MMR + 30 мг / мл гентамицина. Выдержите впрыскивается эмбрионас при 16 ° С в течение не менее одного часа, чтобы позволить инъецированные бластомеры заживать.
- Передача зажили эмбрионов в лунки новой культуры пластины, которые были заполнены с 0.3x MMR + 30 мг / мл гентамицина на стадии 9 (до гаструляции).
- Инкубируйте эмбрионов на 14 - 22 ° С до тех пор пока не достигнет эмбрионы Stage 38 - 40 21.
4. Закрепление и Иммуноокрашивание Эмбрионы
- Приготовьте 50 мл сульфата МОПС / EGTA / магний / Формальдегид Буфер [MEMFA: 100 мМ MOPS (рН 7,4), 2 мМ EGTA, 1 мМ MgSO 4, 3,7% (об / об) формальдегида].
- С помощью пипетки передачи, положить 10 - 20 Stage 38 - 40 эмбрионов в стеклянный флакон. Добавить 10 мкл 5% бензокаин в 100% этанола во флакон и инвертировать флакона для смешивания. Подождите 10 минут, чтобы обезболить эмбрионов.
- Удалите MMR из флакона с помощью стеклянной пипетки. Если обработке нескольких ампул в то же время, Флаконы можно держать вертикально в 24-луночный культуральный планшет.
- С помощью стеклянной трубыTTE, заполнить флакон с MEMFA. Поместите флакон на трехмерной качающейся платформе в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Извлеките MEMFA из флакона с помощью стеклянной пипетки. Заполните флакон с 100% -ным метанолом. Поместите флакон на трехмерной качающейся платформе в течение 10 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг мыть еще один раз, и хранить эмбрионов в 100% -ном растворе метанола в течение ночи при -20 ° С.
- Приготовьте 1х фосфатно-солевом буферном-бычьим сывороточным альбумином-Тритон (РВТ): 1X PBS, 2 мг / мл бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Тритон Х-100.
- Готовят первичный раствор антител: 1x ПБТ с 10% козьей сывороткой с 1: 5 разбавление мышиного моноклонального антитела 4A6 (маркировать мембраны промежуточных, дистальной и соединительных трубочек 20), с 1:30 разбавлением мышиных моноклональных антител 3G8 (маркировать просвет проксимальных канальцев 20) и 1: 250 разбавлением кроличьи поликлональные антитела RFP (маркировать МЕМ-RFP Tracer). Хранить при температуре 4 ° С.
- Подготовьте SecondaРаствор Ry антитела: 1x ПБТ с 10% козьей сыворотки, 1: 500 Alexa 488 козий против мышиного IgG (концентрация запас 2 мг / мл; на этикетке 4A6 и 3G8), и 1: 500 Alexa 555 козьего анти-кроличьего IgG (акций концентрация 2 мг / мл; маркировать МЕМ-RFP Tracer). Хранить при температуре 4 ° С, охватывающих трубу в фольгу для защиты от света.
- В качестве альтернативы, собирать первичные и вторичные антитела, после окрашивания, и сохранить при 4 ° С для повторного использования в будущих экспериментах. Если антитело быть сохранены для повторного использования, добавить 0,01% азида натрия.
- Immunostain эмбрионов с использованием установленных протоколов 18.
5. Визуализация эмбрионы и анализа целевых Pronephric ткани
- Экран на иммуноокрашиванию эмбрионов, чтобы убедиться, что правильно бластомеров инъецируют при просмотре флуоресценции трейсера под флуоресцентным стереомикроскопа на 1X (для просмотра весь эмбрион) и 5X (для просмотра почек) увеличение. Место эмбрионов в стеклянной пластине с несколькими хорошо с мыLLS заполненные 1x ПБТ с помощью пипетки передачи с наконечником отрезаны. Манипулирование эмбрионов с петлей для волос. Используйте только те эмбрионы , которые имеют совместное инъецированных трассирующий , присутствующий в предпочки на левой стороне эмбриона (рис 3C, F и фиг.4С, F) для генной экспрессией или бросовой анализа.
- В качестве альтернативы, очистить эмбрионов в Clear Мюррей (2 части бензилбензоат: 1 часть бензиловый спирт) путем размещения эмбрионов в стеклянный флакон и наполнения флакона с Clear Мюррея. Визуализируйте эмбрионов с использованием стеклянного луночного планшета.
Примечание: Мюррей Clear является органический растворитель, и его следует использовать с осторожностью. Надевайте перчатки, и использовать только стеклянные флаконы и пипетки с Clear Мюррея. - Хранить эмбрионов при 4 ° С в 1x PBT в течение 2 - 3 недель. Для длительного хранения эмбрионов, обезвоживают эмбрионов промыванием два раза в 100% метаноле при комнатной температуре в течение 10 мин. Хранить эмбрионов при -20 ° С в 100% метаноле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микроинъекции 4- и 8-клеточных эмбрионов Xenopus с MEM-RFP мРНК показывают различные уровни ориентации на предпочки. На рисунке 4 показан этап 40 эмбрионов с правильными паттернов экспрессии мРНК MEM-ОПП. Эмбрионы были введены в левой вентральной бластомере (фиг.4А), и сортируют для надлежащего характера экспрессии мРНК МЕМ-RFP. Помимо выражения MEM-RFP в проксимальной, промежуточной, дистальной и присоединительные канальцев почки, правильно инъецированные эмбрионы, как ожидается, показывают, флуоресценцию в эпидермисе головы, туловища и хвоста. Они также должны показать флуоресценции в отоциста, цементной железы, проктодеум и сомитов (рис 4в). Распределение МЕМ-RFP флуоресценции в почках 8 правильно инъецированных эмбрионов определяли с помощью флуоресцентного стереомикроскопа (фиг.4В). Эмбрионы с высоким уровнем экспрессии МЕМ-RFP в эпидермисе, чтоблокировали обнаружение областей почек оценивали как "окклюзия". Выражение МЕМ-ППК было обнаружено в проксимальном отделе, промежуточные, дистальные и соединительные трубочки всех эмбрионов, которые не были забиты, как окклюзия. Стереоскоп (рис 4D-F) и конфокальной микроскопы (рис 4G-I) для проверки совместной локализации MEM-RFP и почечной ткани иммунологически с 3G8 и 4A6 были использованы. Конфокальной изображений проверена совместной локализации MEM-ЗП с проксимальной, промежуточной и дистальной соединительных канальцах почек, что свидетельствует о том, что микроинъекции MEM-ЗП в левый вентральный бластомере правильно ориентирована на почки.
Эмбрионы , инъецированные MEM-RFP мРНК на стадии 8-клеток (фиг.5А) показывают более узкий диапазон тканей , отображающих флуоресценции, что указывает , что 8-клеточные инъекции уменьшить потенциал для вторичных эффектов на почки. Как эмбрионов инжектированных в 4-клеточной стадии, EMBRYos вводили в 8-клеточной стадии шоу флуоресценции в проксимальном, промежуточные, дистальное и соединительные канальцах почек, а также сомитов и проктодеум (5С-F). В отличие от эмбрионов, инъецированных на 4-клеточной стадии, цементная железа и отоциста не помечены MEM-ЗП. Из 10 целевых правильно эмбрионов одного эмбриона показал MEM-RFP почти во всех проксимальных канальцах, и 3 показали MEM-RFP почти во всех промежуточных и дистальных канальцев почки (рис 5B). Соединительные трубочки 7 эмбрионов были частично помечены MEM-ЗП. Кроме того, почки эмбрионов инжектированных на стадии 8-клеток были легче визуализировать, и лишь один был забит, как окклюзия. Со-локализация MEM-RFP и антител маркировки почки (3G8 и 4A6) определяли с помощью стереомикроскопа (рис 5D-F), и проверяется с помощью конфокальной микроскопии (рис 5G-I). Ближняя, промежуточное соединение, дистальной и присоединительные Tubules почки метили MEM-ЗП у эмбрионов инжектированных на стадии 8 клеток, продемонстрировав, что целевой инъекция V2 бластомере этикетки почки, при отображении флуоресценции в меньшем количестве тканей, чем эмбрионов инжектированных в левой вентральной бластомере на 4-элементная сцена.
Этот анализ делает использование флуоресцентно меченый мРНК в качестве изотопного индикатора, чтобы показать, какие ткани были мишенью микроинъекции. Важно скрининга эмбрионов для локализации последовательного индикаторного перед анализом, а также любые эмбрионы , которые не отображать ожидаемую картину распределения трейсер должен быть отброшен. На рисунке 6 показан пример этапа 40 эмбриона , который был неправильно целевой мРНК MEM-RFP на этап 4-элементная. Экспрессия мРНК МЕМ-ЗП расположен на правой стороне эмбриона вместо левой стороны (6А). Кроме того, большая часть экспрессии мРНК в коже нижней части туловища и хвоста, снемного выражение в сомитов. Нет экспрессии мРНК не наблюдается в проксимальных, промежуточном, дистальной и соединительных трубок (рис 6б), подтверждая неправильное адресности почки. Таким образом, этот эмбрион не следует использовать для анализа.
Рисунок 1:. Xenopus эмбриональных почек Схема почки стадии 35 Xenopus эмбриона, показывая проксимальный, средний, дальний, и соединительные трубочки. На основе Raciti соавт. (2008) 6. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Xenopuы Эмбриональные Судьба Карты. Карты Судьба , идентифицирующие и именование бластомеры , которые способствуют развивающиеся предпочки. А) Судьба карта 4-клеточного эмбриона. Б) Судьба карта 8-клеточного эмбриона. C) Судьба карта 16-клеточного эмбриона. D) Судьба карта 32-клеточного эмбриона. Бластомерах 32-клеточного эмбриона также помечены с помощью альтернативной системы бластомер именования. Судьба карты , основанные на Муди (1987) 8, 9 и Муди и Kline (1990) 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Схема впрыска Ориентация Xenopus Предпочка Красные стрелки указывают на ячейку , чтобы ввести. A) Животное и брюшные вид 4-клеточного эмбриона показывает инъекцию левой вентральной бlastomere нацелиться на левый Предпочка. Красные стрелки указывают на левый вентральный бластомера. B) животных и брюшные вид 8-клеточного эмбриона, показывая инъекцию левого бластомере V2 целевой левый Предпочка. Красные стрелки указывают на левый V2 бластомера. AB) Изображения эмбрионов, взятых на стереоскоп при увеличении 4X. Инъекции на основе судьбы Xenopus карт , разработанный Moody (1987) 8, 9 и Муди и Kline (1990) 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Примеры Эмбрионы , ориентированных на 4-клеточной стадии иммуноокрашиванию стадия 40 эмбрионов Xenopus , показывающие целевую инъекцию в левое предпочки на стадии 4-клеток с использованием MEM-RFP мРНК в качестве изотопного индикатора. MEM-RFP этикеткиклеточные мембраны красные. А) Схематическое изображение инъекция MEM-RFP мРНК в левый вентральной бластомере 4-клеточного эмбриона. Б) локализация Тканевое МЕМ-RFP флуоресценции в почках правильно инъецированных эмбрионов. C) Стадия 40 эмбрионов вводят MEM-RFP в левой брюшной бластомере на 4-клеточной стадии. Локализация MEM-RFP отображается красным цветом, в то время как почки помечены зеленым цветом. 1X увеличение. D) Почки окрашивают 3G8 для обозначения просвете проксимальных канальцах, и 4A6 маркировать мембраны клеток в промежуточных, дистальной и соединительных канальцев. 5X увеличения. E) Расширение области через почки с указанием локализации MEM-RFP. 5X увеличения. F), Объединенное изображение, показывающее совместной локализации МЕМ-RFP трассера с почками. 5X увеличения. CF) Изображения эмбрионов, взятых с камерой Olympus DP71 на стереоскоп. G) конфокальной изображение почки второго эмбриона, окрашенном 3G8 и 4A6. H) Локализация MEM-RFP в почках и окружающих тканей. I) Merged шо изображениекрыло со-локализация MEM-RFP, 3G8 и 4A6 в почках. GI) конфокальной изображений с использованием максимальной проекции при 20Х увеличении. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 5: Примеры Эмбрионы , ориентированных на 8-клеточной стадии иммуноокрашиванию стадия 40 эмбрионов Xenopus , показывающие целевую инъекцию в левое предпочки на стадии 8-клеток с использованием MEM-RFP мРНК в качестве изотопного индикатора. MEM-RFP этикетки клеточные мембраны красного цвета. А) Схематическое изображение инъекция MEM-RFP мРНК в левый V2 бластомере из 8-клеточного эмбриона. Б) локализация Тканевое МЕМ-RFP флуоресценции в почках правильно инъецированных эмбрионов. C) Стадия 40 эмбрионов вводят MEM-RFP в левой бластомере V2 на 8-клеточной стадии. Локализация MEM-RFP показанов красном цвете, в то время как почки помечены зеленым цветом. 1X увеличение. D) Почки окрашивают 3G8 для обозначения просвете проксимальных канальцах, и 4A6 маркировать мембраны клеток в промежуточных, дистальной и соединительных канальцев. 5X увеличения. E) Расширение области через почки с указанием локализации MEM-RFP. 5X увеличения. F), Объединенное изображение, показывающее совместной локализации МЕМ-RFP трассера с почками. 5X увеличения. CF) Изображения эмбрионов, взятых с камерой Olympus DP71 на стереоскоп. G) конфокальной изображение почки второго эмбриона, окрашенном 3G8 и 4A6. H) Локализация MEM-RFP в почках и окружающих тканей. I) Объединенное изображение, показывающее совместной локализации MEM-RFP, 3G8 и 4A6 в почках. GI) конфокальной снимки , сделанные с использованием максимальной проекции при 20Х увеличении. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Пример эмбриона неправильно ориентирован на 4-клеточной стадии иммуноокрашиванию стадии 40 Xenopus эмбрионов показывает неправильную ориентацию левых предпочки на стадии 4-клеток с использованием MEM-RFP мРНК в качестве изотопного индикатора.. MEM-RFP этикетки клеточные мембраны красного цвета. А) Стадия 40 эмбрионов, показывающий неправильное распределение MEM-RFP, указывающего инъекции в некорректном бластомере. В дополнение к наличию неправильное распределение трассера, указывающего инъекции в неправильном бластомере, этот эмбрион впрыскивают на правой стороне. 1X увеличение. Б) Объединенное изображение почки, показывая отсутствие совместной локализации MEM-RFP с антителами маркировки почки (3G8, 4A6). 5X увеличения. AB) Изображения эмбриона , принятых на стереоскоп. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ориентация Предпочка развивающихся эмбрионов Xenopus опирается на выявление и введение правильного бластомера. Инъекция V2 бластомере 8-клеточных эмбрионов ориентирована на левый Предпочка 18. Это оставляет контралатеральной правильные Предпочка в качестве внутреннего контроля. Если морфолино нокдаун или РНК суперэкспрессия используется для изменения развития почек, контралатеральной правые Предпочка могут быть использованы для сравнения эффектов гена нокдаун или избыточная экспрессия на левом предпочки. В этом случае, соответствующие элементы управления, такие как несоответствующие морфолино управления или доминантной негативной конструкции РНК следует использовать в дополнение к контралатеральной внутреннего контроля для анализа результатов изменения экспрессии генов. Из - за относительной прозрачности зародыша Xenopus, дефекты в почках могут быть легко количественно с использованием нескольких методов. Например, ген нокдаун или избыточная экспрессия может быть просто количественно путем расчета индекса pronephric эмбрионовиммунологически с антителами 3G8 13, который сравнивает развитие проксимальных канальцах на инжектированных и контрольной сторонах эмбриона. В дополнение к изучению pronephric развития, этот метод может быть легко адаптирована к целевой других тканей путем выбора правильного бластомера вводить с помощью установленной судьбы карты 7-10. В дополнение к ориентации других типов тканей, этот протокол также может быть использован для изучения развития почек на разных этапах. Этот протокол посмотрел на стадии 40 эмбрионов окрашивались антителами 3G8 и 4A6, которые обнаруживают дифференцированную ткань почки. Более молодые эмбрионы могут быть иммунологически с различными антителами в почках, или подвергнуты гибридизация 5, 6, 20 в. Так , например, антитело Lim1 может обнаружить развивающиеся пронефрос 21, 22. Точно так же, Lim1, Pax8 и hnf1- бета - транскрипты может быть детектировали с гибридизация , начиная с этапа на 12.5 22-24 гибридизация может быть использован для обнаружения различных областей почек на более поздних стадиях развития. Например, зонды предназначены для выявления экспрессии nphs1, clckb, slc5a1 и atp1a1 в гломусной, дистальный и соединительные трубочки, проксимальных канальцев и всю почку, соответственно, были описаны 25, 5, 26, 27. Оценка почку через несколько этапов с использованием различных антител или анализа на месте в позволило бы для лучшего понимания того , как лечение изменяет развитие почек.
Одним из наиболее важных аспектов этого протокола является правильный выбор и идентификация бластомере для инъекций. В этом протоколе, мы опишем, как цель Предпочка путем введения левой V2 бластомера 8-клеточных эмбрионов или левой вентральной бластомера 4-клеточных эмбрионов. Если неверный бластомер впрыскивается, Предпочка не будут правильно ориентированы. Таким образом,имеет решающее значение , чтобы ознакомиться с развитием и расщепления клеток плоскостей ранних эмбрионов Xenopus до микроинъекции 28, 29. Эмбрион расщепление не всегда соответствует установленным развития диаграммы стадии, поэтому полезно только инъекционные эмбрионов , в которых ранние расколы клеток выглядят "нормальный" и надлежащее бластомер могут быть легко идентифицированы. Это позволит сократить количество эмбрионов, которые были неправильно целевых. Кроме того, он также имеет важное значение для бластомеры зародыша, чтобы быть полностью разделены на момент инъекции. Например, если разрыв между бластомеров V1 и V2 из 8-клеточного эмбриона не завершена до микроинъекции, трассировщик может распространяться в V1, а также V2. Это приведет к снижению эффективности таргетирования микроинъекции, а полученный эмбрион может показать распределение трассера, который выглядит более похож на эмбрион впрыскиваемого на стадии 4-клеток, а не на 8-клеточной стадии.
другой важной частью этого протокола является подтверждение того, что Предпочка был правильно мишенью микроинъекции. Это должно быть сделано до анализа pronephric развития, так как эмбрионы, которые не имели Предпочка правильно ориентированные может привести к искажению результирующего набора данных. Для того, чтобы убедиться в правильности адресности, проанализировать распределение примеси в каждом закачиваемой эмбриона. Вводимый (слева) стороне зародыша должен отображать подавляющее большинство флуоресцентного трейсера. Если элемент управления (правой) стороне зародыша показывает значительное количество флуоресценции, то этот зародыш должен быть отброшен. Если это происходит, то либо неправильное бластомеров инъецируют или вводят бластомеров, не выполнившие расщепляется перед инъекцией. Во-вторых, флуоресценция на нагнетаемого (слева) стороне эмбриона необходимо правильно настроить таргетинг Предпочка. Если эмбрион был введен на 8-клеточной стадии, спинных и брюшных сомитов, боковой пластины, задней кишки, проктодеум, кожа туловища и нервного гребня в стволе, как ожидается, чтобы показать гриппценции в дополнение к предпочки 6, 29. В дополнение к тканям , перечисленных для инъекций 8-клеток, эмбрионов , инъецированных на 4-клеточной стадии должны иметь более широкое распределение флуоресцентной метки в коже и сомитов, а также таргетирование цементная железа, отоциста, линзы и обонятельные плакоды. Если эмбрион не отображает правильную ориентацию ткани, она должна быть отброшена перед анализом (рисунок 5).
Целевыми инъекции, описанные в данном протоколе обеспечивают средство манипулирования генной экспрессии в желаемой ткани. Ограничение этого метода заключается в том, что, хотя эти инъекции ориентированы, они не влияют только развивающиеся почки. 4- и 8-клеточные инъекции, описанные в этой технике являются более целенаправленными, чем инъекции проведена на стадии одной клетки, где экспрессия гена будет изменяться во всем эмбрионе, и инъекции сделано на стадии двух клеток, где половина эмбрион показывает измененный ген экспрессиона. Они, однако, не предназначены только для одной ткани. Хотя инъекции в вентральные бластомеры 4-клеточных эмбрионов и бластомеров V2 8-клеточных эмбрионов изменяют экспрессию генов в предпочки, они также изменяют экспрессию генов в других тканях. Другие пораженные ткани включают кожу, сомитов, кишечника и нервного гребня. Поэтому, важно понимать, что, хотя 4- и 8-клеточные инъекции более целенаправленным, чем одно- или двухкамерные инъекций, они будут по-прежнему изменяют экспрессию гена во многих тканях. В дополнение к инъекционным эмбрионов на 4- и 8-клеточных стадий, инъекции также могут быть выполнены на этапах 2-, 16- и 32-клеток. Эмбрионы, инъецированные на стадии 2-х клеток будет иметь более широкий спектр тканей пострадавших, чем эмбрионов инжектированных на более поздних стадиях. Несмотря на то, технически более сложным, эмбрионы, инъецированные в 16- и 32-клеточных ступеней будет иметь более узкий диапазон тканей пораженных чем эмбрионов впрыскивают на стадии 4- и 8-клеток.
MEM-RFP родословная следг используется в этом протоколе для проверки правильности адресности после микроинъекции. МЕМ-ЗП мРНК маркирует клеточных мембран после того, как клетки транслируемого белка из введенной РНК. Концентрация MEM-RFP клонального трассера используемые в настоящем протоколе (0,1 нг MEM-RFP мРНК в 10 нл инъекций) должны быть изменены по мере необходимости учета смерти эмбриона и желаемой интенсивности индикаторного флуоресценции. В дополнение к изменению количества клонального трассера вводят внутривенно, а разным фамилиям Tracer, такие как родамин-декстран, квантовых точек, или гистохимического выявляемой бета-галактозидазы, могут быть использованы вместо MEM-ЗП. Lineage трассеры становятся более разбавленным, как клетки делятся, в результате чего уровни флуоресценции, чтобы уменьшить по мере развития эмбриона. Дополнительное применение этой методики заключается в совместном вводят экзогенный РНК или морфолино с клонального трассера к гиперэкспрессией или сбить экспрессию интересующего гена. Линия трассирующими используется для проверки правильности адресности предпочки, но нечтобы указать, где совместно вводили экзогенный РНК или морфолино локализуется в зародыше. Экзогенный РНК и Morpholinos не может распространяться через закачиваемой бластомере с той же скоростью, что и совместно инъецируют трассера, потенциально может привести к дочерним клеткам , которые имеют изотоп , но не экзогенной РНК или морфолино присутствует 30. На самом деле, мы обнаружили, что две различные конструкции РНК вводили в одной клетки не всегда совместно локализуются (неопубликованные данные). Таким образом, наличие примеси в клетке не обязательно указывает, что совместное впрыскивается экзогенный РНК или морфолино всегда присутствует в этой ячейке.
Этот протокол подробно процедура ориентации микроинъекции к бластомеров , которые приводят к предпочки развития Xenopus эмбрионов. Экспрессия гена часто манипулируют в Xenopus эмбрионов путем инъекции Morpholinos или экзогенной РНК, оба из которых могут предотвратить привести к ранней аномалии развития при введении в одно- илидвухкамерные эмбрионов. Эмбрионы, инъецированные в одной клеточной стадии демонстрируют нокдаун или избыточная экспрессия во всех клетках развивающегося эмбриона. Если ген необходим для правильного ранних процессов развития, эмбрион не может развиться Предпочка. Инъекции , выполненные на более поздних стадиях, таких как 8-клеточных инъекций подробно описаны здесь, может привести к эмбрионов , которые подвергаются гаструляции и в конечном итоге pronephric развития 18. Таким образом, целевые инъекции, обсуждаемые здесь могут преодолеть дефекты гаструляции, вызванные изменением экспрессии некоторых генов, что позволяет эмбрион прогрессировать через pronephric развития. В дальнейшем, этот протокол также может быть использована для целевых CRISPR конструкций до требуемых бластомеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения гранта NIDDK (K01DK092320) и финансирование запуска из отдела педиатрии в Университете штата Техас Макговерна медицинской школы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
- Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
- Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
- Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
- Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
- Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
- Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
- Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
- Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
- Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R.
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
- Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
- Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
- Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
- Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
- Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
- Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).
