Introduction
जिगर sinusoids जीव के लिए महत्वपूर्ण विभिन्न प्रतिरक्षा गतिविधियों के कई ल्युकोसैट उपप्रकार होते हैं। उदाहरण के लिए, (महाराष्ट्र) प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.) यकृत marginating भी गड्ढे कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है, की विशेषता है आकृति विज्ञान के रूप में बड़ी बारीक लिम्फोसाइटों (LGLs) और कार्यात्मक सहज साइटोटोक्सिक क्षमता के साथ ल्यूकोसाइट्स, रक्त की स्थापना के खिलाफ यकृत-प्रतिरोध सक्रिय रूप जनित ट्यूमर मेटास्टेसिस। इस के साथ साथ प्रस्तुत विधि के लक्ष्य महाराष्ट्र ल्यूकोसाइट्स के चुनिंदा कटाई, इस महत्वपूर्ण और अद्वितीय सेल आबादी (और प्रतिरक्षा डिब्बे) का अध्ययन करने के क्रम में सक्षम करने के लिए, और इन विशिष्ट कोशिकाओं पर विभिन्न जोड़तोड़ के प्रभाव (जैसे प्रतिरक्षा सक्रियण) को स्पष्ट करने के लिए है।
प्रतिरोधक क्षमता की विफलता एक विकासशील प्राथमिक ट्यूमर को खत्म करने के बावजूद, कैंसर रोगियों और पशु मॉडल में सबूत संकेत मिलता है कि प्रतिरक्षा प्रणाली को ट्यूमर कोशिकाओं, micrometastases, और throu अवशिष्ट रोग घूम नियंत्रित कर सकते हैंजीएच सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा (सीएमआई)। हालांकि, वहाँ विवो क्षमताओं में और मनुष्यों में इन विट्रो अध्ययन में और जानवरों, जो दिखाना है कि सबसे ऑटोलॉगस ट्यूमर कोशिकाओं घूम या प्लीहा ल्यूकोसाइट्स 1,2 द्वारा cytotoxicity लिए प्रतिरोधी रहे हैं में इन दोनों के बीच एक स्पष्ट विसंगति है। इस विसंगति के लिए जिम्मेदार माना जा सकता है, कम से कम हिस्से में, एक अलग ल्युकोसैट उप-जनसंख्या, अर्थात् marginating यकृत (sinusoids) ल्यूकोसाइट्स और सक्रिय एन.के. कोशिकाओं, अर्थात् गड्ढे कोशिकाओं 3 के अपने उप-जनसंख्या के vivo अस्तित्व के लिए। दरअसल, हमारी प्रयोगशाला से अप्रकाशित डेटा संकेत दिया कि F344 चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं syngeneic (MADB106), जो घूम और प्लीहा ल्यूकोसाइट्स के लिए प्रतिरोधी पाए गए, MH-एन.के. कोशिकाओं 4 से lysed थे। इस प्रकार, ट्यूमर कोशिकाओं है कि कथित तौर पर "एन.के. प्रतिरोधी" घूम ल्यूकोसाइट्स के लिए कर रहे MH-एन.के. कोशिकाओं द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। उल्लेखनीय है, चूहों में MH-एन.के. की बढ़ी गतिविधि केवल विवो प्रतिरक्षा में निम्नलिखित स्पष्ट हैउत्तेजना (जैसे पाली मैं के उपयोग के माध्यम से: सी या सीपीजी-सी) 5।
लिवर-विशिष्ट एन.के. कोशिकाओं (MH-एन.के.) sinusoidal लुमेन के अंदर स्थित हैं, endothelial कोशिकाओं और Kupffer कोशिकाओं का पालन कर। MH-एन.के. कोशिकाओं को विशेष रूप से गोलाकार घने कणिकाओं और रॉड-कोर्ड पुटिकाओं 6, जो बायोएक्टिव पदार्थों 7.8 के रूप में लाइसोसोमल एंजाइमों, और perforin और granzymes के रूप में एसिड फॉस्फेट शामिल की विशेषता है। एन.के. कोशिकाओं घूम साथ तुलना में, MH-एन.के. कोशिकाओं एक उच्च संख्या और कणिकाओं और पुटिकाओं 9-11 के आकार दिखा रहे हैं। भड़काऊ शर्तों के तहत, MH-एन.के. कोशिकाओं एन.के. कोशिकाओं घूम की तुलना में, LFA-1 12 की उच्च अभिव्यक्ति प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है। इस बढ़ाकर अभिव्यक्ति एक व्यवस्था है जिसके द्वारा MH-एन.के. कोशिकाओं एन.के. कोशिकाओं 13,14 घूम की तुलना में कुछ ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ और अधिक साइटोटोक्सिक हैं गठन हो सकता है। nterestingly, इंटरल्यूकिन (IL) -2 के साथ इन विट्रो ऊष्मायन के बाद, MH-एन.के. कोशिकाओं बढ़े हुए हो, औरउनकी संख्या और कणिकाओं के आकार में वृद्धि, जो सभी के एक समर्थक फाई लिम्फोकाइन-प्रेरित हत्यारे की LE (LAK) कोशिकाओं 15 के साथ संगत कर रहे हैं।
सक्रिय महाराष्ट्र ल्यूकोसाइट्स विशेष रूप से मानक जिगर ल्युकोसैट कटाई विधियों, जो पीस और ऊतकों की जैविक गिरावट के आधार पर कर रहे हैं के माध्यम से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। हमारे छिड़काव दृष्टिकोण यहाँ बताया मानक तरीकों की तुलना में दो प्रमुख फायदे हैं। सबसे पहले, छिड़काव दृष्टिकोण चुनिंदा महाराष्ट्र ल्यूकोसाइट्स फसल, अन्य जिगर डिब्बों से अन्य ल्यूकोसाइट्स द्वारा संक्रमण को रोकने। दूसरा, छिड़काव तकनीक बेहतर है, अखंडता, गतिविधि, और महाराष्ट्र ल्यूकोसाइट्स की शारीरिक परिवेश को बरकरार रखता विपरीत ऊतक प्रसंस्करण दृष्टिकोण है कि क्षति कोशिकाओं या उनकी आकृति विज्ञान में परिवर्तन, और ऊतकों को नुकसान के कारण, विभिन्न कारकों की रिहाई है कि स्पष्ट रूप से प्रतिरक्षा मिलाना प्रेरित गतिविधि।
लीवर कैंसर मेटास्टेसिस एक के लिए एक प्रमुख लक्ष्य अंग हैएन डी विभिन्न संक्रमण 16 के लिए। महाराष्ट्र कोशिकाओं अद्वितीय विशेषताओं के प्रदर्शन के रूप में यह इन विकृतियों के संबंध में विभिन्न शर्तों के तहत इस विशिष्ट जनसंख्या अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, यह विभिन्न BRMs द्वारा कि प्रणालीगत प्रतिरक्षा सक्रियण नोट करने के लिए योग्य है (जैसे पाली मैं: सी या सीपीजी-सी) ल्यूकोसाइट्स 5 घूम से MH-ल्यूकोसाइट्स अधिक सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है।
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Protocol
आचार कथन: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं तेल अवीव विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. चूहे प्रोटोकॉल
- तैयारी
- heparinized पीबीएस (30 इकाइयों / एमएल) समाधान तैयार फास्फेट की मिलीलीटर प्रति परिरक्षक मुक्त हेपरिन की 30 इकाइयों को जोड़कर कमरे के तापमान (आरटी) पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए बफर खारा (पीबीएस) 1x समाधान। प्रति पशु 35 मिलीलीटर की गणना।
- हवाई बुलबुले को खत्म करने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप लाइनों और तितली सुई के माध्यम से heparinized पीबीएस गुजरती हैं।
- (गुरुत्वाकर्षण (सूखा) स्थापित करने पर कम से कम 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव) कैंची की 2 जोड़े, पा धार संदंश, 2 hemostats, और दांत-ऊतक संदंश - सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित।
- लिवर और MH-ल्यूकोसाइट्स के संग्रह का छिड़काव
- 8% isoflurane की अधिक मात्रा से पशु euthanize। एहतियात के तौर पर एक isoflurane युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब जगहअपनी छाती गुहा खोलने तक चूहे सिर के चारों ओर -soaked पैड।
- श्वसन की समाप्ति पर तुरंत जिगर और हृदय जटिल बेनकाब करने के लिए पेरिटोनियल और सीने गुहाओं खोलें। इस प्रक्रिया के माध्यम से खून बह रहा से बचें।
- विशेष रूप से, पसलियों की ओर तिरछे दोनों पक्षों के लिए पेट के निचले भाग midline बिंदु पर चीरा, हानिकारक आंतरिक अंगों के बिना, और प्रगति शुरू, ऊपरी छाती गुहा के स्तर के माध्यम से उन्हें काटने।
- लगभग एक मिनट के भीतर, (~ एक 250 ग्राम जानवर से 6 मिलीग्राम) के रूप में संभव के रूप में ज्यादा रक्त इकट्ठा एक सिरिंज में सही वेंट्रिकल से।
- perfusate का संग्रह सक्षम करने के लिए एक hemostat संभव के रूप में करीब दिल के साथ दुम रग कावा दबाना।
- प्रयोगकर्ता के सही करने के लिए पशु के बाहर आंतों और जगह बाहर खींचो, बेनकाब करने के लिए पोर्टल शिरा।
- संभव के रूप में दुम के रूप में, पोर्टल नस में एक 25 जी चतुर्थ कैथेटर, एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से जुड़ा है, डालें,लेकिन प्लीहा नस को व्याख्यान चबूतरे।
- एक 25 जी तितली सुई, एक 5 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा है, अवर रग Cava में, hemostat के लिए दुम डालें।
- लगभग 3 मिलीग्राम / मिनट की गति क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप पर बारी और धीरे perfusate कि सिरिंज में खून के साथ दूषित कर रहे हैं के पहले मिलीलीटर इकट्ठा। जारी रखें जब तक perfusate रंग बदल जाता है लाल पीला (लगभग 3-5 मिलीलीटर) है। सूचना है कि जिगर का रंग हल्के भूरे रंग की दिशा बदल रही है।
- क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप को रोकने के बिना, एक 20 मिलीलीटर कटाई सिरिंज के साथ 5 मिलीलीटर सिरिंज कटाई की जगह है और जिगर perfusate छिड़काव के एक उच्च गति (अप करने के लिए 4 मिलीग्राम / मिनट) रोजगार के कम से कम 20 मिलीलीटर इकट्ठा। लगातार एकत्रित सिरिंज में perfusate प्रवाह की निगरानी, और वैक्यूम कि बहुत मजबूत है (रग कावा दीवारों के ढहने के माध्यम से सुई रोकना सकता है) से बचें।
- छिड़काव बर्खास्त जब जिगर का रंग हल्के भूरे रंग में बदल जाता है।
- ल्यूकोसाइट्स निष्कर्षण
- सतह पर तैरनेवाला aspirate
- 10 मिनट के लिए 400 XG पर 10 मिलीलीटर पीबीएस, अपकेंद्रित्र जोड़ें, और सतह पर तैरनेवाला aspirate। अध्ययन के लक्ष्यों के आधार पर, तैयारी का उपयोग करता है के रूप में, या अतिरिक्त शुद्धिकरण (जैसे, घनत्व-ढाल जुदाई) का आयोजन करेगा।
- विशेष रूप से, एक परत 50 सीसी polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में घनत्व-ढाल जुदाई मास की 4 मिलीलीटर से ज्यादा perfusate के 4 मिलीलीटर। 754 XG, आरटी पर नलियों स्पिन, तोड़ बंद के साथ 30 मिनट के लिए।
- मैनुअल pipetting द्वारा घनत्व-ढाल जुदाई-सतह पर तैरनेवाला इंटरफेस में mononuclear परतों प्राप्त करने, पीबीएस में धोने, और एक 5 मिलीलीटर ट्यूब में डालें।
2. माउस प्रोटोकॉल
- तैयारी
- फास्फेट की मिलीलीटर प्रति परिरक्षक मुक्त हेपरिन की 30 इकाइयों को जोड़कर heparinized पीबीएस (30 इकाइयों / एमएल) समाधान कमरे के तापमान (आरटी) पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार खारा बफर (पीबीएस) 1x समाधानएन। प्रति पशु 20 मिलीलीटर की गणना।
- हवाई बुलबुले को खत्म करने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप लाइनों और तितली सुई के माध्यम से heparinized पीबीएस गुजरती हैं।
- (गुरुत्वाकर्षण (सूखा) स्थापित करने पर कम से कम 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव) कैंची की 2 जोड़े, पा धार संदंश, 2 hemostats, और दांत-ऊतक संदंश - सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित।
- लिवर और MH-Leukocytes के संग्रह का छिड़काव
- 8% isoflurane की अधिक मात्रा से पशु euthanize। एहतियात के तौर पर अपनी छाती गुहा खोलने जब तक माउस सिर के चारों ओर एक isoflurane से लथपथ पैड युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब जगह है।
- एक बिस्तर पर माउस के अंगों को ठीक करें।
- यकृत और श्वसन की समाप्ति पर हृदय जटिल तुरंत बेनकाब करने के लिए पेरिटोनियल और सीने गुहाओं खोलें, डायाफ्राम बरकरार रखने के निचले पहलू (एक draining गुहा पूल छाती बनाने के लिए)। इस प्रक्रिया के माध्यम से खून बह रहा से बचें।
- विशेष रूप से, कम से कम चीरा शुरूपेट midline बिंदु, हानिकारक आंतरिक अंगों के बिना, और प्रगति तिरछे पसलियों की ओर दोनों पक्षों के लिए, ऊपरी छाती गुहा के स्तर के माध्यम से उन्हें काटने।
- प्रयोगकर्ता के सही करने के लिए पशु के बाहर आंतों और जगह युद्ध, बेनकाब करने के लिए पोर्टल शिरा।
- एक 30 जी सुई, प्लीहा नस नस करने के लिए पोर्टल व्याख्यान चबूतरे में एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से जुड़ा डालें।
- डायाफ्राम से ऊपर अवर रग Cava कट छाती गुहा से perfusate की जल निकासी और संग्रह की अनुमति है।
- लगभग 3 मिलीग्राम / मिनट की गति क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप पर बारी और धीरे perfusate कि छाती गुहा पूल से रक्त के साथ दूषित कर रहे हैं के पहले 3 मिलीलीटर इकट्ठा।
- इस perfusate त्यागें। इस तरह के एक कपड़े धोने की फिर से दोहराएँ यदि आवश्यक हो तो, खारा का उपयोग करके, और उसके बाद ही जिगर perfusate संग्रह शुरू।
- पुनः आरंभ करने के लिए 4 मिलीग्राम / मिनट की गति छिड़काव, और का उपयोग छाती गुहा से perfusate के 10 मिलीलीटर इकट्ठाएक तितली एक सिरिंज से जुड़ा है।
- छिड़काव बर्खास्त जब जिगर का रंग हल्के भूरे रंग में बदल जाता है।
- ल्यूकोसाइट्स निष्कर्षण
- अपकेंद्रित्र पर 400 x जी 10 मिनट के लिए perfusate।
- सतह पर तैरनेवाला aspirate।
- 10 मिनट के लिए 400 XG पर 10 मिलीलीटर पीबीएस, अपकेंद्रित्र जोड़ें, और सतह पर तैरनेवाला अध्ययन लक्ष्यों के आधार पर aspirate, के रूप में है तैयारी का उपयोग करें, या अतिरिक्त शुद्धिकरण (जैसे, घनत्व-ढाल जुदाई) का आयोजन करेगा।
- विशेष रूप से, परत हर 4 में एक 50 सीसी polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में घनत्व-ढाल जुदाई मास की 4 मिलीलीटर से ज्यादा perfusate की मिलीलीटर। 754 XG, आरटी पर नलियों स्पिन, तोड़ बंद के साथ 30 मिनट के लिए।
- मैनुअल pipetting द्वारा घनत्व-ढाल जुदाई-सतह पर तैरनेवाला इंटरफेस में mononuclear परतों प्राप्त करने, पीबीएस में धोने, और एक 5 मिलीलीटर ट्यूब में डालें।
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Representative Results
F344 चूहों में हम पूरे जिगर सेल की आबादी का cytotoxicity जिगर ऊतक के यांत्रिक पीस निम्नलिखित MH-एनके कोशिकाओं के cytotoxicity (मजबूर जिगर छिड़काव द्वारा जिगर sinusoids से एकत्र) की तुलना में, और ल्यूकोसाइट्स घूम की cytotoxicity करने के लिए। सभी सेल की तैयारी कम से कम 3 बार धोया गया, प्रतिरक्षाविज्ञानी assays में दिनचर्या के रूप में, और लक्ष्य सेल लाइनों के रूप में हम allogenic छुटकारा -1 या syngeneic MADB106 लक्ष्य सेल लाइनों का इस्तेमाल किया। के रूप में आंकड़े 1 में संकेत - 4, जबकि MH-एन.के. कोशिकाओं (और ~ 80% क्रमश: 100% तक) MADB106 और छुटकारा -1 लक्ष्य सेल लाइनों के खिलाफ गहरा cytotoxicity का प्रदर्शन किया, दोनों पूरे जिगर सेल की आबादी (चित्रा 1) और घूम ल्यूकोसाइट्स (आंकड़े 2 और 3) cytotoxicity की गहराई से निचले स्तर पर, और syngeneic MADB106 लक्ष्य सेल लाइन के खिलाफ लगभग कोई हत्या का प्रदर्शन किया। एक ही relative cytotoxicity के निचले स्तर पर स्पष्ट किया गया जब यंत्रवत् संसाधित यकृत भी धोने और घनत्व ढाल जुदाई (चित्रा 4), का स्तर है कि साहित्य में विशिष्ट हैं कराना पड़ा। इस प्रकार, MH-एन.के. कोशिकाओं F344 चूहों में cytotoxicity के विशिष्ट उच्च स्तर दिखा रहे हैं। FACS विश्लेषण का आयोजन किया गया था और बाद सेल उप-जनसंख्या की संरचना में गहरा मतभेद का पता चला: monocytes (CD161dim), एन.के. कोशिकाओं (CD161 उज्ज्वल), टी कोशिकाओं (CD3), बी कोशिकाओं (CD45), और NKT (CD161 और CD3) कोशिकाओं। परिपक्वता प्रोफाइल (CD11b / CD27) में मेजर मतभेद (चित्रा 5) भी अलग डिब्बों के बीच स्पष्ट थे।
चित्रा 1:। MH-डिब्बे throu से काटा पूरे लिवर सेल की आबादी का cytotoxicity (YAC -1 लक्ष्य सेल लाइन) MH-एन.के. कोशिकाओं (करने के लिए MH-एन.के. कोशिकाओं के cytotoxicity की एक तुलना,यहाँ बताया दृष्टिकोण Gh) छुटकारा -1 लक्ष्य सेल लाइन के खिलाफ गहरा साइटोटोक्सिक गतिविधि का प्रदर्शन किया है, जबकि पूरे जिगर सेल की आबादी, जिगर के यांत्रिक प्रसंस्करण के माध्यम से काटा, न्यूनतम स्तर (पी <0.05) का प्रदर्शन किया। एक्स अक्ष प्रेरक करने वाली लक्ष्य कोशिकाओं अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: leukocytes (YAC -1 लक्ष्य सेल लाइन) परिसंचारी की cytotoxicity के लिए MH-एन.के. कोशिकाओं के cytotoxicity की एक तुलना। MH-एन.के. कोशिकाओं (यहाँ बताया दृष्टिकोण के माध्यम से MH-डिब्बे से काटा), छुटकारा -1 लक्ष्य सेल लाइन के खिलाफ गहरा cytotoxicity का प्रदर्शन करते हुए घूम ल्यूकोसाइट्स cytotoxicity के न्यूनतम स्तर से प्रदर्शित(पी <0.05)। एक्स अक्ष प्रेरक करने वाली लक्ष्य कोशिकाओं अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। परिसंचारी leukocytes (MADB106 लक्ष्य सेल लाइन) MH-एन.के. कोशिकाओं (यहाँ बताया दृष्टिकोण के माध्यम से MH-डिब्बे से काटा) की cytotoxicity के लिए MH-एनके कोशिकाओं के cytotoxicity की एक तुलना, syngeneic MADB106 के खिलाफ गहरा cytotoxicity का प्रदर्शन सेल लाइन लक्ष्य है, जबकि घूम ल्यूकोसाइट्स cytotoxicity (पी <0.05) के न्यूनतम स्तर का प्रदर्शन किया। एक्स अक्ष प्रेरक करने वाली लक्ष्य कोशिकाओं अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है। कृपया यहाँ क्लिक करें टीओ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
चित्रा 4:। पूरे जिगर लिम्फोसाइटों के cytotoxicity जो धोया और घनत्व-ढाल जुदाई (YAC -1 लक्ष्य सेल लाइन) MH-एन.के. कोशिकाओं (MH- से काटा गया था के माध्यम से समृद्ध करने के लिए MH-एन.के. कोशिकाओं के cytotoxicity की एक तुलना, यहाँ बताया दृष्टिकोण के माध्यम से डिब्बे), छुटकारा -1 लक्ष्य सेल लाइन के खिलाफ गहरा cytotoxicity का प्रदर्शन किया है, जबकि पूरे जिगर लिम्फोसाइटों (मैकेनिकल प्रसंस्करण, जो धोया गया था और घनत्व-ढाल जुदाई के माध्यम से समृद्ध) के बाद, cytotoxicity के काफी निचले स्तर (प्रदर्शित करने के लिए ऊपर 30%) (पी <0.05) है कि साहित्य में विशिष्ट हैं। एक्स अक्ष प्रेरक करने वाली लक्ष्य कोशिकाओं अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है। कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5:। (CD161dim) monocytes, एन.के. कोशिकाओं: परिसंचारी mononuclear, MH-mononuclear, और पूरे लिवर mononuclear कोशिकाओं से mononuclear सेल सबसेट और एन.के. सेल सबसेट के एक तुलना FACS विश्लेषण स्पष्ट निम्नलिखित सेल उप-जनसंख्या की संरचना में अंतर पता चलता है (CD161 उज्ज्वल), टी कोशिकाओं (CD3), बी कोशिकाओं (CD45), और NKT (CD161 और CD3) कोशिकाओं के साथ ही परिपक्वता प्रोफाइल (CD11b / CD27) अलग अलग डिब्बों के बीच में मतभेद। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की।
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Discussion
जिगर छिड़काव के साथ साथ प्रस्तुत विधि एक चयनात्मक कटाई सक्षम बनाता है और यकृत ल्यूकोसाइट्स marginating की अनूठी जनसंख्या का अध्ययन। यकृत कोशिकाओं एन.के. भी गड्ढे 3 कोशिकाओं कहा जाता है, एक विशिष्ट एन.के. सेल की आबादी है कि यकृत sinusoids में रहते गठन। वे चूहों, चूहों 17 में और मनुष्यों 18,19 में पाए जाते हैं। पृथक परिधीय एन.के. कोशिकाओं की तुलना में, गड्ढे कोशिकाओं छुटकारा -1 और CC531s लक्ष्य सेल लाइनों 20 के खिलाफ उच्च cytotoxicity का प्रदर्शन किया, दिखाया गया छोटे साइटोप्लाज्मिक कणिकाओं 20 के एक उच्च संख्या, और इस तरह के LFA-1 12 के रूप में सतह एंटीजन, के एक उच्च अभिव्यक्ति के लिए है । इसके अतिरिक्त, पृथक रक्त एन.के. कोशिकाओं के विपरीत, गड्ढे कोशिकाओं एन.के. प्रतिरोधी कोशिकाओं lyse P815 कर सकते हैं। चूहे के लिए इसी प्रकार गड्ढे कोशिकाओं, मानव यकृत एन.के. कोशिकाओं एन.के. कोशिकाओं 18,19 घूम की तुलना में एन.के. के प्रति संवेदनशील K562 लक्ष्य कोशिकाओं के खिलाफ एक उच्च cytotoxicity है, और lyse एन.के. प्रतिरोधी लक्ष्य कोशिकाओं 18 को दिखाया गया। overalएल, के रूप में जिगर विशेष रूप से और विशिष्ट रूप से विभिन्न रोगों में शामिल है, प्रतिरक्षा इस अंग के भीतर अध्ययन किया जाना चाहिए, और महाराष्ट्र डिब्बे की कोशिकाओं parenchymal, Kupffer, और तारामय कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जाना चाहिए।
के रूप में परिचय में सविस्तार, हमारे छिड़काव दृष्टिकोण चुनिंदा कटाई महाराष्ट्र ल्यूकोसाइट्स में आम यांत्रिक पीस / जैविक गिरावट प्रक्रियाओं पर फायदेमंद है, और बेहतर में ईमानदारी, गतिविधि, और महाराष्ट्र ल्यूकोसाइट्स की शारीरिक वातावरण के संरक्षण। दरअसल, एनके cytotoxicity का आकलन करने, महाराष्ट्र ल्यूकोसाइट्स हमारे दृष्टिकोण के माध्यम से काटा यांत्रिक पीस प्रक्रिया के माध्यम से काटा ल्यूकोसाइट्स की तुलना में स्पष्ट रूप से अधिक एन.के. cytotoxicity, एनके कोशिकाओं के समान संख्या के बावजूद प्रदर्शन किया।
यकृत छिड़काव तकनीक जानवरों के अध्ययन में ही प्रचलित है। प्रतिरक्षा डिब्बों जीवविज्ञान का सवाल कर सकते हैं के बीच हालांकि, इस दृष्टिकोण से प्राप्त विशिष्ट अंतर्दृष्टि चिह्नित के संबंध में मतभेदअल और पूरी तरह ल्यूकोसाइट्स घूम के आधार पर टिप्पणियों के नैदानिक महत्व। जानवरों के अध्ययन है कि अलग अलग प्रतिरक्षा डिब्बों में प्रतिरक्षा सूचकांकों को मापने की डिग्री करने के लिए जो प्रचलन में प्रत्येक रोग प्रतिरोधक सूचकांक दर्शाता है या महाराष्ट्र के डिब्बे में अपने स्तर के साथ संबद्ध सलाह दे सकते। एक दिलचस्प अवलोकन चूहों में इस तकनीक का है, जहां भरकर रखा MH-एन.के. कोशिकाओं केवल पशु 21 के एक एक प्राथमिकताओं प्रतिरक्षा उत्तेजना के बाद लक्ष्य कोशिकाओं के खिलाफ महत्वपूर्ण साइटोटोक्सिक गतिविधि का प्रदर्शन करेंगे रोजगार को दर्शाता है।
तकनीक के कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं को संकेत दिया जाना चाहिए। दोनों चूहों और चूहों में, छाती गुहा व्यापक रूप से तुरंत खोला जाना चाहिए श्वसन की पूर्ण समाप्ति के बाद, और कम से कम खून बह रहा है। चूहों में, यह सिफारिश की है कि हृदय की रक्त के अधिक से अधिक राशि के छिड़काव से पहले वापस ले लिया है। चूहों में, यह दिल से वापस ले लिया खून करने के लिए सिफारिश नहीं है, क्योंकि यह पोर्टल नस में रक्त दबाव को कम करता है औरयह प्रक्रिया जारी रखने के लिए के माध्यम से यह कठिन सुई डालने के लिए बनाता है। यह सुई प्रविष्टि, आसन्न लेकिन प्लीहा नस को व्याख्यान चबूतरे वाला बनाया जाना चाहिए के रूप में एक सुनिश्चित करने के लिए कि जिगर में पोर्टल शिरा के प्रवेश द्वार के सम्मिलन से दूरी पर्याप्त के लिए सुई एक स्थिर स्थिति में होना है चाहता है और सभी की अनुमति देता है पालियों भरकर रखा करने के लिए। जबकि इसकी सतह के समानांतर है, तो पोत दीवार फटने का खतरा कम से कम है सुई पोर्टल शिरा में डाला जाना चाहिए। चूहों में, जबकि perfusate के संग्रह के लिए दुम रग कावा के लिए एक सुई डालने, यह संभव के रूप में संकीर्ण प्रवेश द्वार बिंदु बनाए रखने के लिए perfusate का एक संभावित रिसाव से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। चूहों में, यह अन्य रक्त वाहिकाओं या फेफड़ों rupturing बिना छाती गुहा के अंदर रग कावा में कटौती, अनावश्यक रक्त संक्रमण से बचने के precociously करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर के प्रमुख लाभ के भीतर और बीच, छिड़काव दर में एक स्थिर नियंत्रण हैजानवरों। यह आदेश पोर्टल शिरा का टूटना से बचने के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान एक कम प्रवाह दर को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। के रूप में जिगर perfusate की पहली मिलीलीटर रक्त के साथ दूषित कर रहे हैं, वे के रूप में दिखाया खारिज किया जाना चाहिए। पशुओं के बीच मानकीकरण को प्राप्त करने के लिए, महाराष्ट्र perfusate का संग्रह शुरू करने कसौटी हल्के भूरे रंग (बजाय एक विशिष्ट मात्रा का संग्रह) के लिए गहरे भूरे रंग से रंग संक्रमण पर आधारित है।
प्रक्रिया के संचालन के साथ, कई खराबी उत्पन्न हो सकता है, लेकिन सबसे प्रतिवर्ती हैं। सुई के माध्यम से जो पीबीएस जिगर में चढ़ाया जाता है बाहर निकल जाता है, तो यह क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप बंद, पेट के आसपास के क्षेत्र में सोख (बेहतर दृश्यता प्राप्त करने के लिए), एक से थोड़ा अधिक व्याख्यान चबूतरे स्थिति में सुई फिर से डालने की सिफारिश की है, और पंप फिर से शुरू करते हैं।
जिगर छिड़काव तकनीक वर्णित एक काफी सरल प्रक्रिया में महाराष्ट्र ल्युकोसैट आबादी का एक चयनात्मक कटाई सक्षम बनाता है। दिया हुआइस आबादी को प्रदर्शित करता है कि अन्य प्रतिरक्षा डिब्बों से ल्यूकोसाइट्स की तुलना में विशिष्ट सुविधाओं, और जीव के लिए जैविक और नैदानिक महत्व हो सकता है, हम जब संभव है, अन्य डिब्बों से ल्यूकोसाइट्स महाराष्ट्र की आबादी का प्रोफ़ाइल प्रतिबिंबित नहीं कर सकते रूप में इस विधि का उपयोग करें। इसके अतिरिक्त, के रूप में इस तकनीक का मानव में साध्य नहीं है, हम आगे पशुओं में यह रोजगार विशिष्ट घूम बायोमार्कर कि महाराष्ट्र विशेषताओं के साथ संबंध स्थापित है, खासकर जब यकृत से संबंधित प्रक्रियाओं और बीमारियों के अध्ययन को स्पष्ट करने का सुझाव देते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26 G | |
| Butterfly needle | OMG | 21 G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
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