Introduction
Los sinusoides hepáticos contienen numerosos subtipos de leucocitos de diversas actividades inmunes críticos para el organismo. Por ejemplo, las células marginando hepática (MH) asesinas naturales (NK), también conocidas como células de pozo, se caracterizan morfológicamente como linfocitos granulares grandes (LGLs) y funcionalmente como leucocitos con capacidad citotóxica espontánea, lo que permite hepática resistencia contra el establecimiento de sangre metástasis tumorales Borne. El objetivo del método presentado en este documento es para permitir la recolección selectiva de leucocitos MH, con el fin de estudiar esta población celular importante y única (y el compartimento inmune), y para dilucidar el impacto de diversas manipulaciones (por ejemplo, la activación inmune) en estas células específicas.
A pesar del fracaso de la inmunidad para eliminar un tumor primario en desarrollo, la evidencia en pacientes con cáncer y en modelos animales indican que el sistema inmune puede controlar las células tumorales, las micrometástasis, y la enfermedad residual throu circulantela inmunidad mediada por células GH (CMI). Sin embargo, existe una inconsistencia aparente entre estos en capacidades in vivo y en estudios in vitro en seres humanos y en animales, que demuestran que la mayoría de las células tumorales autólogas son resistentes a la citotoxicidad mediante la circulación o leucocitos esplénicos 1,2. Esta inconsistencia se puede atribuir, al menos en parte, a la existencia in vivo de una subpoblación de leucocitos distinto, a saber, los (sinusoides) leucocitos marginando-hepática y su subpoblación de células NK activadas, es decir, células de pozo 3. De hecho, datos no publicados de nuestro laboratorio indican que en las ratas F344 células tumorales singénicas (MADB106), que se encontró resistente a circulantes y esplénicas leucocitos, fueron lisadas por células NK MH-4. Así, las células tumorales que son supuestamente "NK-resistente" a los leucocitos circulantes pueden ser controlados por las células MH-NK. Digno de mención, en ratones la actividad mejorada de MH-NK es evidente sólo después in vivo inmuneestimulación (por ejemplo, mediante el uso de Poly I: C o CpG-C) 5.
Las células NK específicos del hígado (MH-NK) están situados dentro de la luz sinusoidales, la adhesión a las células endoteliales y células de Kupffer. Células MH-NK se caracterizan exclusivamente por gránulos densos esféricas y vesículas de varilla de núcleo 6, que contienen fosfatasa ácida como enzimas lisosomales y perforina y granzimas como sustancias bioactivas 7,8. En comparación con las células NK circulantes, las células MH-NK exhiben un mayor número y tamaño de los gránulos y vesículas 9-11. Bajo condiciones inflamatorias, se demostró que las células MH-NK a exhibir una mayor expresión de LFA-1 12, en comparación con las células NK circulantes. Esta expresión potenciada puede constituir un mecanismo por el cual las células MH-NK son más citotóxicos contra ciertas células tumorales que las células NK 13,14 circulante. nterestingly, después de la incubación in vitro con interleuquina (IL) -2, las células MH-NK se agrandan, ysu número y tamaño de los gránulos aumentan, todos los cuales son consistentes con una células pro fi l de killer activadas por linfoquinas (LAK) 15.
leucocitos MH activos no se pueden obtener exclusivamente a través de los métodos de cosecha de leucocitos hígado estándar, que se basan en la molienda y la degradación biológica de los tejidos. Nuestro enfoque de perfusión descrito en este documento tiene dos ventajas importantes en comparación con los enfoques estándar. En primer lugar, el enfoque de perfusión cosecha selectivamente leucocitos MH, la prevención de la contaminación por otros leucocitos de otros compartimentos del hígado. En segundo lugar, la técnica de perfusión mejor preserva la integridad, la actividad, y el medio fisiológico de los leucocitos MH, a diferencia del procesamiento de tejido se aproxima que dañan las células o alterar su morfología, y debido a daños en los tejidos, inducir la liberación de diversos factores que marcadamente modular inmune actividad.
El hígado es el principal órgano diana para la metástasis del cáncer dend para diversas infecciones 16. A medida que las células MH poseen características singulares que es importante estudiar esta población específica en diversas condiciones con respecto a estas patologías. Por ejemplo, es digno de destacar que la activación inmune sistémica por varios BRM (por ejemplo, poli I: C o C-CpG) se han demostrado para activar MH-leucocitos más de 5 leucocitos circulantes.
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Protocol
Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Tel-Aviv.
Protocolo 1. Las ratas
- Preparativos
- Preparar la solución heparinizada PBS (30 unidades / ml) para ser usado a temperatura ambiente (RT) mediante la adición de 30 unidades de heparina libre de conservantes por ml de solución salina tamponada con fosfato 1x solución (PBS). Calcula 35 ml por animal.
- Pase heparinizada PBS a través de las líneas de bomba peristáltica y las agujas de mariposa para eliminar burbujas de aire.
- Esterilizar instrumentos quirúrgicos - 2 pares de tijeras, fórceps-afiladas embotado, 2 pinzas hemostáticas, y fórceps de dientes de tejido (autoclave a 121 ° C durante al menos 30 min en el establecimiento de la gravedad (en seco)).
- Perfusión del hígado y percepción de MH-leucocitos
- La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Como medida de precaución, colocar un tubo de 50 ml que contiene un isofluranoalmohadilla -soaked alrededor de la cabeza de la rata hasta la apertura de su cavidad torácica.
- Abrir las cavidades peritoneales y el pecho para exponer el hígado y el complejo cardiopulmonar inmediatamente tras el cese de la respiración. Evitar el sangrado a través de este proceso.
- En concreto, iniciar la incisión en el punto de la línea media abdominal inferior, sin dañar los órganos internos, y el progreso de ambos lados en diagonal hacia las costillas, cortando a través de ellos a los niveles superiores en la cavidad torácica.
- Dentro de aproximadamente un minuto, recoger la mayor cantidad de sangre posible (~ 6 ml de un animal de 250 g) del ventrículo derecho en una jeringa.
- Abrazadera de la vena cava caudal con una pinza hemostática lo más cerca posible al corazón, para permitir la recogida del líquido de perfusión.
- Tire de los intestinos y el lugar fuera del animal a la derecha del experimentador, para exponer la vena porta.
- Insertar un catéter 25 G IV, conectado a una bomba peristáltica, en la vena porta, como caudal como sea posible,pero rostral a la vena esplénica.
- Inserte una aguja G 25 de la mariposa, conectada a una jeringa de 5 ml, en la vena cava inferior, caudal a la pinza hemostática.
- Encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente 3 ml / min y recoger suavemente los primeros ml de perfundido que están contaminados con sangre en la jeringa. Continuar hasta que el color es perfundido se pone pálido rojo (aproximadamente 3-5 ml). Observe que el color del hígado está cambiando hacia marrón claro.
- Sin detener la bomba peristáltica, sustituir la jeringa de recolección 5 ml con una jeringa de 20 ml de cosecha y recoger al menos 20 ml de líquido de perfusión del hígado que emplean una mayor velocidad de perfusión (hasta 4 ml / min). Monitorear continuamente el flujo de líquido de perfusión a la jeringa de recogida, y evitar que el vacío es demasiado fuerte (que puede obstruir la aguja por el colapso de las paredes de la vena cava).
- Terminar la perfusión cuando el color del hígado se convierte en marrón claro.
- Extracción leucocitos
- Aspirar el sobrenadante
- Añadir 10 ml de PBS, centrifugar a 400 xg durante 10 min, y aspirar el sobrenadante. Sobre la base de los objetivos del estudio, utilice la preparación como es, o realizar purificaciones adicionales (por ejemplo, separación en gradiente de densidad).
- En concreto, la capa 4 ml de líquido de perfusión más de 4 ml de los medios de separación en gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 cc. Girar los tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos con la ruptura fuera.
- Obtener las capas mononucleares en la interfase de separación-sobrenadante en gradiente de densidad con la pipeta manual, lavar en PBS, y se insertan en un tubo de 5 ml.
2. Protocolo de ratón
- Preparativos
- Preparar la solución heparinizada PBS (30 unidades / ml) para ser usado a temperatura ambiente (RT) mediante la adición de 30 unidades de heparina libre de conservantes por ml de tampón fosfato salino (PBS) 1x solutionorte. Calcula 20 ml por animal.
- Pase heparinizada PBS a través de las líneas de bomba peristáltica y las agujas de mariposa para eliminar burbujas de aire.
- Esterilizar instrumentos quirúrgicos - 2 pares de tijeras, fórceps-afiladas embotado, 2 pinzas hemostáticas, y fórceps de dientes de tejido (autoclave a 121 ° C durante al menos 30 min en el establecimiento de la gravedad (en seco)).
- Perfusión del hígado y percepción de MH-leucocitos
- La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Como medida de precaución, colocar un tubo de 15 ml que contiene una almohadilla empapada isoflurano alrededor de la cabeza del ratón hasta la apertura de su cavidad torácica.
- Fijar las extremidades del ratón a una cama.
- Abrir las cavidades peritoneales y el pecho para exponer el hígado y el complejo cardiopulmonar inmediatamente al cese de la respiración, manteniendo el aspecto inferior del diafragma intacto (para crear un grupo de drenaje cavidad torácica). Evitar el sangrado a través de este proceso.
- En concreto, iniciar la incisión en la parte inferiorpunto de la línea media abdominal, sin dañar los órganos internos, y el progreso de ambos lados en diagonal hacia las costillas, cortando a través de ellos a los niveles superiores en la cavidad torácica.
- Retirada de los intestinos y el lugar fuera del animal a la derecha del experimentador, para exponer la vena porta.
- Inserte una aguja 30 g, conectado a una bomba peristáltica en el rostral de la vena porta a la vena esplénica.
- Cortar la vena cava inferior por encima del diafragma para permitir el drenaje y recogida del líquido de perfusión de la cavidad torácica.
- Encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente 3 ml / min y recoger suavemente el 3 primero ml de perfundido que están contaminados con sangre de la piscina cavidad torácica.
- Desechar este líquido de perfusión. Repetir un lavado tal vez más si es necesario, mediante el uso de solución salina, y sólo entonces comenzar a recoger líquido de perfusión hepática.
- Re-iniciar la perfusión a una velocidad de hasta 4 ml / min, y recoger 10 ml de perfundido de la cavidad torácica usandouna mariposa conectada a una jeringa.
- Terminar la perfusión cuando el color del hígado se convierte en marrón claro.
- Extracción leucocitos
- Centrifugar el perfundido durante 10 minutos a 400 x g.
- Aspirar el sobrenadante.
- Añadir 10 ml de PBS, centrifugar a 400 g durante 10 min, y aspirar el sobrenadante Sobre la base de los objetivos del estudio, utilice la preparación como es, o realizar purificaciones adicionales (por ejemplo, separación en gradiente de densidad).
- En concreto, cada capa de 4 ml de líquido de perfusión más de 4 ml de los medios de separación en gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 cc. Girar los tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos con la ruptura fuera.
- Obtener las capas mononucleares en la interfase de separación-sobrenadante en gradiente de densidad con la pipeta manual, lavar en PBS, y se insertan en un tubo de 5 ml.
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Representative Results
En las ratas F344 se comparó la citotoxicidad de células NK-MH (recogido de los sinusoides hepáticos por perfusión del hígado forzado) a la citotoxicidad de la totalidad de la población de células de hígado después de trituración mecánica del tejido del hígado, y a la citotoxicidad de los leucocitos circulantes. Todas las preparaciones celulares se lavaron al menos 3 veces, como rutina en ensayos inmunológicos, y como líneas de células diana que utilizan las líneas de la célula diana singénicas MADB106 alogénico YAC-1 o. Como se indica en las figuras 1 - 4, mientras que las células MH-NK mostraron profunda citotoxicidad contra la MADB106 y las líneas de células YAC-1 objetivo (~ 80% y hasta el 100%, respectivamente), tanto a toda la población de células del hígado (Figura 1) y leucocitos circulantes (Figuras 2 y 3) muestran niveles más bajos de citotoxicidad profundamente, y casi no matar contra la línea de células diana singénicas MADB106. El mismo relaticinco niveles más bajos de citotoxicidad fueron evidentes cuando hígados mecánicamente procesados también se sometieron a lavado y separación en gradiente de densidad (Figura 4), los niveles que son típicos en la literatura. Así, las células MH-NK exhiben únicamente los altos niveles de citotoxicidad en ratas F344. análisis FACS se llevó a cabo y reveló profundas diferencias en la composición de las subpoblaciones de células siguientes: monocitos (CD161dim), células NK (CD161 brillantes), células T (CD3), células B (CD45), y las células NKT (CD161 y CD3). Las principales diferencias en el perfil de maduración (CD11b / CD27) también fueron evidentes entre los diferentes compartimentos (Figura 5).
Figura 1: Comparación de la citotoxicidad de células NK-MH, a la citotoxicidad de toda la población de células hepáticas (YAC-1 línea celular diana) las células NK-MH (obtenido de la MH-compartimiento throu.gh el enfoque descrito en el presente documento) mostraron actividad citotóxica profunda contra la línea de células diana YAC-1, mientras que toda la población de células hepáticas, se recogieron a través del procesamiento mecánico del hígado, muestra los niveles mínimos (p <0,05). eje X representa efector al objetivo de células relación. Los datos se presentan como media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Una comparación de la citotoxicidad de células NK-MH, a la citotoxicidad de leucocitos circulantes (YAC-1 línea celular diana). células MH-NK (cosechadas a partir de la MH-compartimento a través de la aproximación descrita en el presente documento) exhibieron profunda citotoxicidad contra la línea de células diana YAC-1, mientras leucocitos circulantes muestran niveles mínimos de citotoxicidad(P <0,05). eje X representa efector al objetivo de células relación. Los datos se presentan como media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Una comparación de la citotoxicidad de las células MH-NK, a la citotoxicidad de circulación (MADB106 Target Cell Line) células MH-NK leucocitos (obtenido de la MH-compartimento a través del método descrito en el presente documento) exhibió profunda citotoxicidad contra la MADB106 singénico orientar línea celular, mientras que los leucocitos circulantes muestran niveles mínimos de citotoxicidad (p <0,05). eje X representa efector al objetivo de células relación. Los datos se presentan como media ± SEM. Por favor, haga clic aquí to ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación de la citotoxicidad de células NK-MH, a la citotoxicidad del hígado entero Los linfocitos que se lavó y enriquecida por separación en gradiente de densidad (YAC-1 línea celular diana) las células NK-MH (obtenido de la MH. compartimento a través de la aproximación descrita en el presente documento) exhibió profunda citotoxicidad contra la línea de células diana YAC-1, mientras que los linfocitos hepáticos enteras (siguientes procesamiento mecánico, que se lavó y se enriquece a través de la separación en gradiente de densidad), muestran niveles significativamente más bajos de citotoxicidad (hasta 30%) (p <0,05) que son típicos en la literatura. eje X representa efector al objetivo de células relación. Los datos se presentan como media ± SEM. Por favorclic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Una comparación de mononucleares subconjuntos de células y subconjuntos de células NK Desde el mononucleares circulantes, el MH-mononucleares, y toda la células del hígado mononucleares FACS análisis muestra claras diferencias en la composición de las siguientes subpoblaciones de células: los monocitos (CD161dim), células NK (CD161 brillante), las células T (CD3), células B (CD45) y células NKT (CD161 y CD3), así como las diferencias en el perfil de maduración (CD11b / CD27) entre los diferentes compartimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
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Discussion
El método de perfusión hepática que aquí se presenta permite una recolección selectiva y el estudio de la población única de marginando leucocitos hepáticas. Células hepáticas NK, también llamadas células de pozo 3, constituyen una población de células NK distintivo que residen en los sinusoides hepáticos. Se encuentran en ratas, ratones y 17 en los seres humanos 18,19. En comparación con las células NK periféricas aisladas, células de pozo demostrado mayor citotoxicidad contra líneas de células diana YAC-1 y CC531s 20, se han mostrado a un mayor número de gránulos citoplásmicos más pequeñas 20, y una mayor expresión de antígenos de superficie, tales como LFA-1 12 . Además, a diferencia de las células NK de sangre aisladas, las células de pozo pueden lisar células P815 resistentes a NK. Similares a la rata células de pozo, las células NK hepáticos humanos tienen una citotoxicidad mayor contra las células diana K562 de NK-sensibles en comparación con las células NK 18,19 circulante, y se muestran para lisar células diana NK-resistentes 18. overall, ya que el hígado es específica y única implicado en diversas enfermedades, la inmunidad debe ser estudiada dentro de este órgano, y las células del compartimiento MH debe distinguirse de parénquima, Kupffer y las células estrelladas.
Como se explica en la introducción, nuestro enfoque de perfusión es ventajoso con respecto a los procedimientos comunes mecánicos de molienda / biológicos de degradación en la cosecha selectivamente leucocitos MH, y en una mejor preservación de la integridad, la actividad, y el medio fisiológico de leucocitos MH. De hecho, la evaluación de la citotoxicidad de NK, leucocitos MH cosechadas a través de nuestro enfoque mostraron una citotoxicidad notablemente mayor NK de leucocitos cosechadas mediante el procedimiento de trituración mecánica, a pesar de número similar de células NK.
La técnica de perfusión hepática sólo es operable en estudios con animales. Sin embargo, diferencias conocimientos específicos obtenidos de este enfoque en cuanto marcaron entre compartimentos inmunes pueden cuestionar la biológicacol y la importancia clínica de las observaciones basadas únicamente en los leucocitos circulantes. Los estudios en animales que miden los índices inmunes en diferentes compartimentos inmunes pueden sugerir el grado en que cada índice inmunológica en la circulación refleja o se correlaciona con sus niveles en el compartimento de MH. Una observación interesante se refiere al empleo de esta técnica en ratones, donde las células MH-NK perfundidos solamente demostrarán actividad citotóxica significativa contra las células diana después de una estimulación inmune a-priori del animal 21.
deben indicarse algunos aspectos críticos de la técnica. Tanto en ratas y ratones, la cavidad torácica se debe abrir ampliamente inmediatamente después de la cesación total de la respiración, y con un sangrado mínimo. En ratas, se recomienda que la cantidad máxima de sangre cardíaca se retira antes de la perfusión. En los ratones, no se recomienda para sangre extraída desde el corazón, ya que reduce la presión sanguínea en la vena porta yhace que sea más difícil para insertar la aguja a través de él para continuar con el proceso. Esta inserción de la aguja debe hacerse adyacente pero rostral a la vena esplénica, como se desea para asegurar que la distancia desde la inserción a la entrada de la vena porta en el hígado es suficiente para que la aguja esté en una posición estable y permite que todos los lóbulos para conseguir perfundidos. La aguja debe insertarse en la vena portal mientras que paralelamente a su superficie, por lo que el riesgo de ruptura de la pared del vaso se reduce al mínimo. En las ratas, mientras que la inserción de una aguja a la vena cava caudal para la recogida de la perfusión, es fundamental para mantener el punto de entrada tan estrecha como sea posible para evitar una fuga potencial de líquido de perfusión. En los ratones, es importante precozmente cortar la vena cava dentro de la cavidad torácica sin romper otros vasos sanguíneos o los pulmones, con el fin de evitar la contaminación de la sangre innecesario. La principal ventaja de utilizar una bomba peristáltica es un control estable sobre la tasa de perfusión, dentro y entre lasanimales. Es importante mantener una velocidad de flujo baja durante todo el procedimiento con el fin de evitar la ruptura de la vena portal. Como los primeros ml de líquido de perfusión hepática están contaminados con sangre, deben ser desechados como se muestra. Para lograr la estandarización entre los animales, el criterio para comenzar a recoger el líquido de perfusión MH se basa en la transición de color de marrón oscuro a marrón claro (en lugar de colección de un volumen específico).
A lo largo de la ejecución del procedimiento, pueden ocurrir varios fallos de funcionamiento, pero la mayoría son reversibles. Si la aguja a través del cual se transfunde la PBS en el hígado se desliza hacia fuera, se recomienda para detener la bomba peristáltica, sumerja el área circundante de la tripa (para lograr una mejor visibilidad), vuelva a insertar la aguja en una posición ligeramente más rostral, y volver a arrancar la bomba.
La técnica de la perfusión del hígado descrito en este documento permite una cosecha selectiva de la población de leucocitos MH en un proceso bastante simple. Dadoque esta población presenta características distintivas en relación con los leucocitos de los otros compartimentos inmunes, y pueden tener importancia biológica y clínica para el organismo, se recomienda el uso de este método, cuando sea posible, como los leucocitos de los otros compartimentos pueden no reflejar el perfil de la población MH. Además, ya que esta técnica no es factible en los seres humanos, se sugiere el empleo de más que en los animales de aclarar biomarcadores específicos circulantes que se correlacionan con las características MH, particularmente cuando se estudian procesos y enfermedades relacionadas hepáticas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26 G | |
| Butterfly needle | OMG | 21 G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
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