Introduction
Levern sinusvågor innehåller många leukocyter subtyper av olika immun aktiviteter kritiska till organismen. Till exempel marginating lever (MH) naturliga mördarceller (NK), även känd som pit celler, som kännetecknas morfologiskt som stora granulära lymfocyter (LGLs) och funktionellt som leukocyter med spontan cytotoxisk kapacitet, vilket gör att levern-motstånd mot inrättandet av blod- burna tumörmetastaser. Målet med den metod som presenteras här är att möjliggöra selektiv skörd av MH leukocyter, för att studera denna viktiga och unika cellpopulation (och immun fack), och att belysa effekterna av olika manipulationer (t.ex. immunaktivering) på dessa specifika celler.
Trots misslyckandet av immunitet för att eliminera ett utvecklingsprimärtumör, bevis hos cancerpatienter och djurmodeller tyder på att immunsystemet kan styra cirkulerande tumörceller, mikrometastaser och kvarvarande sjukdom through cellmedierad immunitet (CMI). Det finns dock en uppenbar inkonsekvens mellan dessa in vivo-kapacitet och in vitro studier på människor och djur, som visar att de flesta autologa tumörceller är resistenta mot cytotoxicitet genom cirkulerande eller mjälten leukocyter 1,2. Denna inkonsekvens kan tillskrivas, åtminstone delvis, på att det finns en distinkt leukocyt subpopulation, nämligen marginating-hepatiska (sinuskurvor) leukocyter och deras subpopulation av aktiverade NK-celler, nämligen grop cellerna 3 in vivo. I själva verket, opublicerade data från vårt laboratorium indikerade att i F344 råttor syngena tumörceller (MADB106), som befanns resistent mot cirkulerande och mjälten leukocyter, lyserades av MH-NK-celler 4. Således kan tumörceller som påstås "NK-resistent" till cirkulerande leukocyter styras av MH-NK-celler. Anmärkningsvärt i möss ökad aktivitet av MH-NK är uppenbar först efter in vivo immunstimulering (t.ex. genom användning av Poly I: C eller CpG-C) 5.
Lever-specifika NK-celler (MH-NK) är belägna i sinus lumen, som ansluter sig till endotelcellerna och Kupffer celler. MH-NK-celler uteslutande kännetecknas av sfäriska täta granuler och stav fyllda vesiklar 6, som innehåller syrafosfatas som lysosomala enzymer och perforin och granzymes som bioaktiva ämnen 7,8. Jämfört med cirkulerande NK-celler, MH-NK-celler uppvisar en högre antalet och storleken på granuler och vesiklar 9-11. Under inflammatoriska tillstånd, var MH-NK-celler visat sig uppvisa högre uttryck av LFA-1 12, jämfört med cirkulerande NK-celler. Denna förbättrade uttryck kan utgöra en mekanism genom vilken MH-NK-celler är mer cytotoxiska mot vissa tumörceller än cirkulerande NK-celler 13,14. nterestingly, följande in vitro-inkubation med interleukin (IL) -2, MH-NK-celler blir förstorad, ochderas antal och storlek av granulat ökar, som alla är förenliga med en pro fi le av lymfokin-aktiverade mördarceller (LAK) -celler 15.
Aktiva MH leukocyter kan inte enbart erhållas genom de vanliga lever leukocyter skördemetoder, som är baserade på slipning och biologisk nedbrytning av vävnaden. Vår perfusion metod som beskrivs här har två stora fördelar jämfört med vanliga metoder. För det första perfusion metod skördar selektivt MH leukocyter, förhindra förorening av andra leukocyter från andra lever fack. För det andra perfusion teknik bättre bevarar integritet, aktiviteten och den fysiologiska miljön i MH leukocyter, till skillnad från vävnadsbearbetning närmar som skadar celler eller ändra sin morfologi, och på grund av vävnadsskada, inducera frisättningen av olika faktorer som påtagligt modulera immun aktivitet.
Levern är ett viktigt målorgan för cancermetastas ennd för olika infektioner 16. Som MH celler uppvisar unika egenskaper är det viktigt att studera denna specifika befolkningen under olika förhållanden med avseende på dessa sjukdomar. Till exempel, är det värt att notera att systemisk immunaktivering av olika BRMs (t.ex. poly-I: C eller CpG-C) har visats aktivera MH-leukocyter mer än cirkulerande leukocyter 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Rutiner som involverar djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Tel Aviv University.
1. Råttor Protokoll
- preparat
- Förbereda hepariniserat PBS (30 enheter / ml) lösning som skall användas vid rumstemperatur (RT) genom att tillsätta 30 enheter av konserveringsmedel fritt heparin per ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 1x lösning. Beräkna 35 ml per djur.
- Passera heparin PBS genom den peristaltiska pumpen linjer och fjärilsnålar för att eliminera luftbubblor.
- Sterilisera kirurgiska instrument - 2 saxar, trubbiga kanter pincett, 2 peanger och tandvävnads pincett (autoklav vid 121 ° C under minst 30 minuter på torr) inställning vikt ().
- Perfusion av levern och Insamling av MH-leukocyter
- Avliva djuret genom en överdos av 8% isofluran. Som en försiktighetsåtgärd, placera en 50 ml rör innehållande en isofluran-soaked pad runt råtta huvudet tills öppna sin brösthålan.
- Öppna peritoneala och bröst håligheter för att exponera levern och hjärt-komplexet omedelbart efter upphörande av andning. Undvika blödning genom denna process.
- Specifikt starta snitt vid nedre delen av buken mittlinjen punkt, utan att skada inre organ, och vidare till båda sidor diagonalt mot revbenen, skär genom dem till övre bröst-håligheten nivåer.
- Inom ungefär en minut, samla så mycket blod som möjligt (~ 6 ml från en 250 g djur) från den högra kammaren i en spruta.
- Kläm den bakre hålvenen med en hemostat så nära som möjligt till hjärtat, för att möjliggöra insamling av perfusatet.
- Dra ut inälvorna och plats utanför djuret till försöks rätt, för att exponera portådern.
- Infoga en 25 G IV-kateter, som är ansluten till en peristaltisk pump, in i portvenen, som caudal som möjligt,men rostralt om mjälten ven.
- Infoga en 25 G fjärilsnål, som är ansluten till en 5 ml spruta, in i den nedre hålvenen, kaudalt om hemostat.
- Slå på den peristaltiska pumpen med en hastighet av ca 3 ml / min och försiktigt samla de första ml perfusat som är kontaminerade med blod in i sprutan. Fortsätt tills perfusatet färgen är svängar ljusröd (ca 3-5 ml). Lägg märke till att färgen på levern förändras mot ljusbrun.
- Utan att stoppa peristaltiska pumpen, byt skörd sprutan 5 ml med en 20 ml skörd spruta och samla minst 20 ml av lever perfusat utnyttjar en högre hastighet av perfusion (upp till 4 ml / min). Kontinuerligt övervaka perfusat flödet in i uppsamlingssprutan, och undvika vakuum som är för stark (som kan täppa nålen genom att kollapsa hålvenen väggar).
- Avsluta perfusion när färgen i levern vänder sig till ljusbrun.
- leukocyter Extraktion
- Aspirera supernatanten
- Tillsätt 10 ml PBS, centrifugera vid 400 xg under 10 min och aspirera supernatanten. Baserat på studie mål, använder preparat som är, eller utföra ytterligare reningar (t.ex. densitets gradient separation).
- Specifikt skikt 4 ml perfusat över 4 ml densitets gradient separation massa i en 50 cc polypropylen centrifugrör. Snurra rören vid 754 xg, RT, under 30 min med den avbrytbara.
- Skaffa mononukleära skikten vid densitets gradient separation-supernatant gränssnitt genom manuell pipettering, tvätta i PBS, och sätt i en 5 ml rör.
2. musprotokollet
- preparat
- Förbereda hepariniserat PBS (30 enheter / ml) lösning som skall användas vid rumstemperatur (RT) genom att tillsätta 30 enheter av konserveringsmedel fritt heparin per ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 1x Solution. Beräkna 20 ml per djur.
- Passera heparin PBS genom den peristaltiska pumpen linjer och fjärilsnålar för att eliminera luftbubblor.
- Sterilisera kirurgiska instrument - 2 saxar, trubbiga kanter pincett, 2 peanger och tandvävnads pincett (autoklav vid 121 ° C under minst 30 minuter på torr) inställning vikt ().
- Perfusion av levern och Insamling av MH-leukocyter
- Avliva djuret genom en överdos av 8% isofluran. Som en försiktighetsåtgärd, placera en 15 ml rör innehållande en isofluran indränkt dyna runt musen huvudet tills öppna sin brösthålan.
- Fäst benen på musen till en säng.
- Öppna de peritoneala och bröst kaviteter för att exponera levern och hjärt-komplexet omedelbart efter upphörande av andning, hålla den lägre aspekten av membranet intakt (för att skapa en dräneringsbrösthålan pool). Undvika blödning genom denna process.
- Specifikt starta snitt vid lägrebuken mittlinjen punkt, utan att skada inre organ, och vidare till båda sidor diagonalt mot revbenen, skär genom dem till övre bröst-håligheten nivåer.
- Utdragbar tarmarna och plats utanför djuret till försöks rätt, för att exponera portådern.
- Infoga en 30 g nål, som är ansluten till en peristaltisk pump in i portvenen rostralt om mjälten ven.
- Skär den nedre hålvenen ovanför membranet för att möjliggöra dränering och uppsamling av perfusatet från brösthålan.
- Slå på den peristaltiska pumpen med en hastighet av ca 3 ml / min och försiktigt samla in de tre första ml perfusat som är kontaminerade med blod från brösthålan poolen.
- Släng denna perfusat. Upprepa sådan tvätt igen om det behövs, genom att använda saltlösning, och först därefter börja samla lever perfusat.
- Åter initiera perfusion med en hastighet av upp till 4 ml / min, och samla 10 ml perfusat från brösthålan med hjälp aven fjäril som är ansluten till en spruta.
- Avsluta perfusion när färgen i levern vänder sig till ljusbrun.
- leukocyter Extraktion
- Centrifugera perfusatet under 10 min vid 400 x g.
- Aspirera supernatanten.
- Tillsätt 10 ml PBS, centrifugera vid 400 xg under 10 minuter, och aspirera supernatanten baserade på kliniska studier mål, använder preparat som är, eller utföra ytterligare rening (t.ex. densitets gradient separation).
- Specifikt skikt var 4 ml perfusat över 4 ml densitets gradient separation massa i en 50 cc polypropylen centrifugrör. Snurra rören vid 754 xg, RT, under 30 min med den avbrytbara.
- Skaffa mononukleära skikten vid densitets gradient separation-supernatant gränssnitt genom manuell pipettering, tvätta i PBS, och sätt i en 5 ml rör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I F344-råttor jämförde vi cytotoxiciteten hos MH-NK-celler (som samlats in från lever sinusoiderna genom forcerad leverperfusion) för att cytotoxicitet av hela levercellpopulation efter mekanisk målning av levervävnad, och cytotoxiciteten hos cirkulerande leukocyter. Alla cellberedningar tvättades minst 3 gånger, som rutin i immunologiska analyser, och som mål-cellinjer vi använde allogena YAC-1 eller de syngena MADB106 målgrupp cellinjer. Såsom indikeras i figurerna 1 - 4, medan MH-NK-celler uppvisade djupa cytotoxicitet mot MADB106 och YAC-1 mål-cellinjer (~ 80% och upp till 100% respektive), både hela levern cellpopulationen (figur 1) och cirkulerande leukocyter (fig 2 och 3) som visas djupt lägre nivåer av cytotoxicitet, och nästan ingen dödande mot syngena MADB106 målcellinjen. Samma relative lägre nivåer av cytotoxicitet var uppenbart när mekaniskt bearbetade lever gick också tvätt och densitetsgradient separation (Figur 4), nivåer som är typiska i litteraturen. Således, MH-NK-celler uppvisar unikt höga nivåer av cytotoxicitet i F344 råttor. FACS-analys genomfördes och avslöjade stora skillnader i sammansättningen av följande cellsubpopulationer: monocyter (CD161dim), NK-celler (CD161 ljusa), T-celler (CD3), B-celler (CD45), och NKT (CD161 och CD3-celler). Stora skillnader i mognad profil (CD11b / CD27) var också tydlig mellan de olika avdelningarna (Figur 5).
Figur 1: En jämförelse av cytotoxiciteten hos MH-NK-celler, för att cytotoxicitet av hela levern cellpopulation (YAC-1 målcellinje) MH-NK-celler (skördade från MH-facket throu.gh de häri beskrivna tillvägagångssättet) uppvisade djupa cytotoxisk aktivitet mot YAC-1 målcellinje, medan hela levercellpopulationen, skördades genom mekanisk bearbetning av levern, visade minimala nivåer (p <0,05). X-axeln representerar effektor-till-mål-celler förhållande. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: En jämförelse av cytotoxiciteten hos MH-NK-celler, till Cytotoxicitet av cirkulerande leukocyter (YAC-1 Target Cell Line). MH-NK-celler (skördade från MH-facket genom den här beskrivna metoden) uppvisade djupa cytotoxicitet mot YAC-1 mål cellinje medan cirkulerande leukocyter visade minimala nivåer av cytotoxicitet(P <0,05). X-axeln representerar effektor-till-mål-celler förhållande. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. En jämförelse av cytotoxiciteten hos MH-NK-celler, för att cytotoxicitet av cirkulerande leukocyter (MADB106 målcellinje) MH-NK-celler (skördade från MH-rummet genom det här beskrivna tillvägagångssättet) uppvisade djupa cytotoxicitet mot syngena MADB106 rikta cellinjen, medan cirkulerande leukocyter visas minimala nivåer av cytotoxicitet (p <0,05). X-axeln representerar effektor-till-mål-celler förhållande. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Klicka här to se en större version av denna siffra.
Figur 4: En jämförelse av cytotoxiciteten hos MH-NK-celler, för att cytotoxicitet av hela levern Lymfocyter som tvättades och berikas genom Density-gradientseparation (YAC-1 målcellinje) MH-NK-celler (skördade från MH. fack genom den här beskrivna metoden) uppvisade djupa cytotoxicitet mot YAC-1 mål cellinje medan hela lever lymfocyter (efter mekanisk bearbetning, som tvättades och berikas genom densitets gradient separation), uppvisade signifikant lägre nivåer av cytotoxicitet (upp till 30%) (p <0,05) som är typiska i litteraturen. X-axeln representerar effektor-till-mål-celler förhållande. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Vänligenklicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. En jämförelse av mononukleära cellundergrupper och NK cellundergrupper från det cirkulerande mononukleära, MH-mononukleära och hela levern mononukleära celler FACS analys visar tydliga skillnader i sammansättningen av följande cell subpopulationer: monocyter (CD161dim), NK-celler (CD161 ljus), T-celler (CD3), B-celler (CD45), och NKT (CD161 och CD3) celler samt skillnader i mognad profil (CD11b / CD27) mellan olika avdelningar. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden leverperfusion presenteras häri möjliggör en selektiv avverkning och studera den unika befolkningen marginating lever leukocyter. Lever NK-celler, även kallade grop celler 3, utgör en distinkt NK cellpopulation som bor i leversinusvågor. De finns i råttor, möss 17 och hos människor 18,19. Jämfört med isolerade perifera NK-celler, grop celler uppvisade högre cytotoxicitet mot YAC-1 och CC531s mål cellinjer 20, visade sig ha ett större antal mindre cytoplasmiska granuler 20, och en högre uttryck av ytantigener, såsom LFA-1 12 . Dessutom, till skillnad från isolerade blod NK-celler, kan grop celler lysera NK-resistenta P815-celler. I likhet med råtta pit celler, humana lever NK-celler har en högre cytotoxicitet mot NK-känsliga K562 målceller jämfört med cirkulerande NK-celler 18,19, och visade sig lysera NK-resistenta målceller 18. overall, som levern är specifikt och unikt involverade i olika sjukdomar, immunitet bör studeras inom detta organ och celler i MH utrymmet bör skiljas från parenkymal, Kupffer och stel celler.
Som utarbetats i inledningen, är vår perfusion metod fördelaktig under de vanliga mekaniska slip / biologiska nedbrytningsförfaranden selektivt skördar MH leukocyter, och i bättre bevara integriteten, aktiviteten och den fysiologiska miljön i MH leukocyter. Faktum är att bedöma NK cytotoxicitet, MH leukocyter skördas genom vår strategi uppvisade en markant högre NK cytotoxicitet än leukocyter skördas genom mekanisk slipning förfarande, trots liknande antal NK-celler.
Den lever perfusion teknik fungerar endast i djurstudier. Men särskilda insikter som erhållits från denna förhållningssätt markanta skillnader mellan immun avdelningar kan ifrågasätta den biologiskaal och kliniska betydelsen av observationer som enbart bygger på cirkulerande leukocyter. Djurstudier som mäter immunindex i olika immun avdelningar kan föreslå till vilken grad varje immunologisk index i cirkulationen reflekterar eller korrelerar med dess nivåer i MH utrymmet. En intressant iakttagelse avser att använda denna teknik i möss, där perfusion MH-NK-celler endast kommer att visa signifikant cytotoxisk aktivitet mot målceller efter en a-priori immunstimulering av djuret 21.
Några kritiska aspekter av tekniken bör anges. I både råttor och möss, bör brösthålan öppnas brett omedelbart efter fullständigt upphörande av andning, och med minimal blödning. Hos råttor, rekommenderas det att maximal mängd hjärt blod dras innan perfusion. Hos möss är det inte rekommenderat att dras blod från hjärtat, eftersom det minskar blodtrycket i portalvenen ochgör det svårare att sätta nålen genom att fortsätta processen. Denna nål insättning bör göras intill men rostralt mjälten ven, som man önskar att säkerställa att avståndet från insättnings till ingången portådern till levern är tillräcklig för nålen att vara i en stabil position och tillåter alla lober att få perfusion. Nålen ska föras in i portådern, medan parallellt med dess yta, så att risken för bristning kärlväggen minimeras. Hos råttor, medan du för in en nål till den bakre hålvenen för insamling av perfusatet, är det viktigt att bibehålla ingångspunkten så smal som möjligt för att undvika en potentiell läckage av perfusatet. I möss, är det viktigt att precociously skära vena cava inuti brösthålan utan att brista andra blodkärl eller lungorna, i syfte att undvika onödig blodsmitta. Den stora fördelen med användning av en peristaltisk pump är en stabil kontroll över perfusionshastighet, inom och mellandjur. Det är viktigt att bibehålla en låg flödeshastighet under hela proceduren för att undvika bristning av portvenen. När de första milliliter lever perfusat är förorenade med blod, bör de kasseras som visas. För att uppnå standardisering mellan djur, är kriteriet för att börja samla MH perfusatet baserad på färgövergång från mörkbrun till ljusbrun (snarare än insamling av en viss volym).
Längs genomför förfarandet kan flera fel uppstå, men de flesta är reversibla. Om nålen genom vilken PBS transfused i levern glider ut, är det rekommenderat att stoppa den peristaltiska pumpen, blöt omgivande område i tarmen (för att uppnå bättre synlighet), åter in nålen i en något mer rostralt läge, och åter starta pumpen.
Levern perfusion teknik som beskrivs häri möjliggör en selektiv skörd av den MH leukocytpopulationen i en ganska enkel process. Givenatt denna population uppvisar särdrag jämfört med leukocyter från andra immun avdelningar, och kan ha biologisk och klinisk betydelse för organismen, rekommenderar vi att använda denna metod när så är möjligt, eftersom leukocyter från andra avdelningar inte kan återspegla profilen MH befolkningen. Dessutom, eftersom denna teknik inte är genomförbart i människor, vidare föreslår vi användning av den i djur för att klargöra specifika cirkulerande biomarkörer som korrelerar med de MH egenskaper, särskilt när de studerar hepatiska relaterade processer och sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26 G | |
| Butterfly needle | OMG | 21 G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G.
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).
