Introduction
イヌは、心血管疾患の研究のための大型動物モデルとして使用され、また先天性（遺伝的）血管異常1,2苦しむことができる。商業内皮細胞株は、しばしば、内皮細胞（EC）の機能を評価するために使用されるこれらの疾患を研究します。犬のための犬の大動脈由来（CnAOEC）利用可能な1の市販の内皮細胞株は、そこにあります。この細胞株は、主制御通常のEC 3-5として研究に使用されています。人間の心血管研究では、最も一般的に使用される内皮細胞株は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト臍帯動脈内皮細胞（HUAECs）は、それぞれ、ヒト臍帯静脈と動脈由来。 HUVECを、1980 6以降血管研究の黄金の標準として使用されてきました。これらは、内皮機能および疾患の適応を研究するための古典的なモデル系であると考えられます。異なる血管から単離された内皮細胞は、appearancで変化します遺伝的背景と微小環境7への曝露に起因する電子と機能。また、HUVECをとHUAECsは、臍帯からの条件に関して完全に模倣大人の血管が、彼らはにし、病気への応答さらされていない可能性があり、発達血管構造を導出しています。したがって、一般的には、心血管疾患にHUVECを中に見出された結果とHUAECsを翻訳することは不適切です。
大人ECの適応と行動を研究すると、関心の容器からの一次のECは、より直接的なアプローチとして使用されるべきです。これらの細胞を単離するために、いくつかの方法が報告されています。また、HUVECをするために使用され、広く記載された方法は、酵素消化液8と容器をフラッシュします。これは、多くの場合、平滑筋細胞および線維芽細胞9のような非電気部品の混入をもたらします。分離のためのもう一つの頻繁に使用される方法は、蛍光に続いみじん切り血管組織の酵素消化であります分化（CD）31 7、8。FACSソーティングの内皮細胞マーカーのクラスタとそれに続く細胞培養に基づいて選別（FACS）活性化細胞は、細胞を比較的大量に必要とし、したがって小血管からの内皮細胞の単離に適していません。したがって、我々は、高純度で、様々なイヌの血管から純粋な内皮細胞集団を単離するための新しい堅牢な方法を開発することを目的としました。新しい分離方法の効率を試験するために、我々は、単離され、大小異なるイヌの動脈と静脈からの純粋な犬の初代内皮細胞（CaPEC）の文化を、取得しました。この方法はまた、先天性細胞内または肝外門脈体循環シャント、犬2で共通の疾患などの罹患および/または異常な血管由来の内皮細胞の培養を可能にします。血管の大部分は整数のままための方法は、血管平滑筋細胞と同様の容器の追加の関連する細胞型の単離を可能にします手順の間に行動します。
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Protocol
倫理の声明：本研究で用いた血管は、新鮮な犬の死体から得た余剰材料として回収した（n = 4）は他の無関係の研究（大学3R政策）のために安楽死させ、健康な犬から。異常な血管（内および肝外門脈体循環シャント、n = 1のそれぞれ）は、ユトレヒト大学のコンパニオンアニマルのための大学クリニックに提示犬から所有者のインフォームドコンセント後の死後に採取しました。
1.単離および培養初代イヌ内皮細胞の
- 2ミリリットル/ウェルの0.5％重量/容量ゼラチンとでプレコート6ウェルプレートを37℃で5％CO 2の加湿雰囲気でインキュベーター中で2時間放置します。前の一次細胞を播種し、過剰なゼラチン溶液を除去します。
- 無菌的に新鮮な犬の死体（ 図1A）から関心の血管（複数可）（ 例えば、大動脈、大静脈、静脈門脈）を取り外します。血管系の解剖学を維持興味のある容器の両端にストレートピンセットを置くことによって。内皮細胞の損傷を防止するために鉗子で組織の不必要な操作を避けてください。
- 手術用ハサミで両端にクランプされた容器をカットし、死体から取り外します。氷上のハンクス平衡塩溶液（HBSS）で輸送。
注：約5cmの血管の長さは、この手順のために好ましいが、1cmに測定するものはまた、培養に十分な細胞を提供します。
- 手術用ハサミで両端にクランプされた容器をカットし、死体から取り外します。氷上のハンクス平衡塩溶液（HBSS）で輸送。
- 氷冷HBSSで満たされたペトリ皿に血管を転送します。手術用はさみを使用して、容器の外部から任意の付着組織と脂肪を除去し、（ 図1B）は無傷の容器自体を維持します。最適なビューのためのクランプまたは鉗子で脇に周囲の組織を引っ張る：容器は切断、すべての回ではっきりと見えることを確認してください。
- 合字と容器の任意の枝を閉じて（ 例えば 、ポリグラクチン3-0）、続いてそれらを削除手術用ハサミやメスで。
- 容器は、湾曲したハルステッドモスキート鉗子で終わる容器の他端に鉗子の先端をクランプし、その後撤回、それは完全に裏返し（ 図1C-G）になるまでゆっくりと容器を反転慎重を入力します。外側は今内皮細胞層で構成されています。いずれかの難易度は、容器を反転する際に遭遇した場合、摩擦を低減するために、再度HBSSに水没。
- それを完全に閉じるために、消化手順（ 図1H）への任意の非内皮血管組織の暴露を防止するために、容器の両端に巾着縫合糸を配置します。反転容器を操作するリガチャー端を使用してください。
- 消化培養が後に行われた場合、前消化プロトコル（ステップ1.7）に反転容器を凍結保存。
- クライオバイアルに反転容器を置き、凍結培地の細胞培養でいっぱい。凍結の共同を使用して、-80℃まで凍結ntainer。 -80℃で保存容器は1週間以内に使用される場合。長期保存の場合は、場所は-180℃で凍結バイアル。 ECの分離を行う場合は、水浴（37℃）で急速にクリオバイアルを解凍し、直ちに氷冷HBSS中に配置します。 1.7に示すように進んでください。
注：分離後のECの合計収率が原因で凍結プロセス中の生存能力の喪失に低くなることを考慮してください。
- クライオバイアルに反転容器を置き、凍結培地の細胞培養でいっぱい。凍結の共同を使用して、-80℃まで凍結ntainer。 -80℃で保存容器は1週間以内に使用される場合。長期保存の場合は、場所は-180℃で凍結バイアル。 ECの分離を行う場合は、水浴（37℃）で急速にクリオバイアルを解凍し、直ちに氷冷HBSS中に配置します。 1.7に示すように進んでください。
- （ 図1I）50ミリリットルチューブに容器を移し、（解凍の際に又は残留凍結媒体）赤血球を除去するために、HBSS中でそれを2回すすいでください。
- 断続的に穏やかで、37℃で1時間、イヌ内皮細胞増殖培地（CECGM）に30ミリリットルの溶液コラゲナーゼII型（0.15 U / ml）及びディスパーゼ（0.15 U / ml）で50ミリリットルチューブに容器をダイジェスト攪拌。
- チューブから容器を外し、250×gで5分間、細胞懸濁液を遠心してください。
- CECGM aの細胞ペレットを再懸濁しNDシード2mLの細胞懸濁液をウェルあたり（1 - 3のウェルは、容器のサイズに応じて）。培養物を空気中5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃での細胞とは1週間に2回培地を変えます。
- 通路70の密集度、細胞 - 80％に達しました。
- 死亡または非付着細胞を除去するために、予め温めたHBSSで細胞を洗浄。各ウェルに200μlの組換え細胞解離酵素（1X）を追加し、5分間、または全ての細胞が分離されるまで、バックインキュベーター内に置きます。
- 15mlチューブに細胞を移し、10％ウシ胎児血清（FCS）を含む培地10mlの（CEGM）を加えることによりトリプシン処理を停止させます。 250×gで5分間遠心分離します。ゼラチンプレコートプレートまたはフラスコ培養を続けます。
2.キャラクタリゼーション
- 文化イヌ大動脈内皮細胞（CnAOECs）、顕微鏡で週二回、プライマリおよび市販の細胞株の形態を比較します。
注：T彼は、典型的な> 70％の集密度に達したときに最も良く観察することができるパッチに電気部品のパターンを成長させます。- 0.5％w / vのゼラチンをプレコートしたT75フラスコ上CECGM文化CnAOECs。週に一度継代細胞密集度が70である - 80％。
- 継代のために、予め温めておいたHBSSで細胞を1回洗浄し、1 mlの組換え細胞解離酵素（1X）を追加します。 5分間、または全ての細胞が分離されるまで、バックインキュベーターでフラスコを置きます。 10％FCSを含む10mlの培地（CEGM）を添加することによってトリプシンを不活性化します。 、250×gで5分間、細胞懸濁液を遠心し、上清を捨て、1mlの培養培地中で細胞を再懸濁。
- 細胞懸濁液の10μlのアリコートを取り、1希薄：0.4％トリパンブルーで1。自動細胞カウンターを用いて細胞を計数し、新しいT75フラスコに4.0×10 5生細胞をプレートアウト。 5％CO 2の加湿雰囲気中で37℃でフラスコや文化に予め温めておいたCECGMの10ミリリットルを追加します。
- 0.5％w / vのゼラチンをプレコートしたT75フラスコ上CECGM文化CnAOECs。週に一度継代細胞密集度が70である - 80％。
- 培養CaPECsとCnAOECsの通路1からRNAを分離します。
- 試料調製試薬（SPR）の20μlを添加し、細胞を溶解するために1分間インキュベートし、ペレットとして、少なくとも1×10 3個の細胞を収集します。インキュベーション後、慎重に-70℃で全RNAとストアを含む細胞溶解物を収集します。
- 製造業者の説明書に従ってcDNA合成キット（ 例えば、iScript）を使用してcDNAにするmRNAを変換します。定量PCRを実行する準備ができてまで長期的に4°C一週間まで、または-20℃でで保存したcDNAを用いることができます。
- 内皮細胞の起源を確認するために、内皮マーカーCD31の遺伝子発現を測定します。 MIQEのPRECISガイドライン10を使用して実験と定量化を行います。正規化のために、参照遺伝子GAPDH、RPS19、およびB2MG 11の発現を測定します。
- ヌクレアーゼを含まない水で得られたcDNAの10倍希釈を準備します。
- 準備します標準的なラインのためのプールされたcDNA試料から4倍希釈し、非鋳型対照としてヌクレアーゼを含まない水を使用しています。 qPCR反応のために50倍希釈合計に到達するために、サンプルを5倍希釈します。 4μlのcDNAおよびリバースとフォワードプライマー（ 表1）の20ピコモルと混合した蛍光体の6μLを使用して、384ウェルフォーマットで二重にピペット10μlの反応。
- 変性のために95℃で10秒、アニーリングおよび伸長のためのTmで30秒間の39サイクル、続いてTaqポリメラーゼの活性化のため5分間、95℃にプログラムを設定します。各プライマーセットのTmを表1に示します。
- 融解曲線を実行すると、1つの製品だけが増幅されていることを確認するためにあらゆるランの次に分析します。参照遺伝子の平均相対量を使用して試料の発現レベルを標準化し、反応効率が95％と105％の間である場合のΔCtを計算します。
- AngIとECの機能性を評価ogenesisアッセイ。
- 予め冷却した血管新生のスライドの各ウェルに細胞外マトリックスの10μlを添加して、ウェルの表面を覆うようにピペットチップを用いて拡散。氷上で細胞外マトリックスを維持し、ゲル内への気泡の導入を避けます。 30分間、5％CO 2、37℃のインキュベーター中で水に浸したペーパータオルでペトリ皿にスライドを配置することによってゲルを固めます。
- 1.0×10 4、主なものを追加します。 50μlの内皮増殖培地ウェルあたりでのEC。 5％CO 2で37℃で6時間、スライドをインキュベートします。
- 6時間後、画像全体をよく含まれていることを確認し、20Xの倍率で写真を撮ります。
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Representative Results
別の血管が正常に記載の単離プロトコール（ 図2）に供しました。解剖や健康犬の大動脈、大静脈、静脈門脈、及び冠動脈反転することが可能であった（それぞれのイヌからの全ての船舶を、N = 4）。同じアプローチのECは2先天性門脈体循環シャント（肝外と肝内、n = 1のそれぞれ）から単離したと。大動脈を容易に反転されたが、胸部大動脈セグメントは、腹部大動脈よりも困難でした。胸部セグメントに大動脈を消化溶液に厳密内皮露出を確実にするために個々にライゲーションされる必要があることから分岐する多くの肋間動脈を、有しています。尾部大静脈の解剖セグメントが反転する前にライゲートする必要が腎静脈の分岐点を、含まれています。静脈gastroduodenalisの貢献枝静脈ポータルの血管の反転の前に連結しました。 coronar我々は回旋枝のセグメントを切除し、そこから - （中型犬で直径2mm約1）、イヌにおけるyの動脈は、はるかに小さい血管です。それは小さい直径を有するので、モスキート鉗子をはるかにさらに挿入することができなかったので、1センチかなり短いセグメントを反転することが容易であることが判明しました。
ある日ポスト分離付着した細胞は、培養プレート中で見ることができました。文化では、CaPECsは、多角形状を有しており、 図3に示すように、パッチで成長する傾向が表示された内皮細胞の多数のコロニーが3観察することができた- 。6日単離後。約10日後に培養液中で80％の密集度に到達し、細胞を突破することができました。その時点で彼らは成長が止まっ：平均的に一次内皮培養物は、（4 1の分割割合で週一回）8通路の最大のために維持することができました。
イソラ定量PCR（ 図4）によって示されるようにテッド内皮細胞は、内皮細胞マーカーCD31を発現しました。 4匹のイヌから大動脈、大静脈、および静脈門脈由来内皮細胞における発現は、CnAOECsの対照培養と比較しました。初代培養細胞を対照のEC（クラスカル・ワリス、P = 0.856）に匹敵するCD31の発現が認められました。
図5に示すように、大動脈、大静脈と静脈門脈由来CaPECsは、血管新生のスライドに6時間のインキュベーション後に分岐を示しました。
図1： 解剖および内皮細胞の単離のために血管を反転。 A）関心の血管を無菌的に新鮮なイヌの死体から削除されます。B）容器を囲む付着組織および/または脂肪はremovでなければなりません湾曲ハルステッドモスキート鉗子では、血管内皮層を穿孔せずに入力することができます。C）容器自体に損傷を与えることなく、手術用ハサミで慎重編（犬の大静脈、5cmの腹部セグメント）。DG）他に鉗子を固定します血管の終わり、静かに、それによって完全に血管を反転、撤回。内皮層は、容器の外側になりました。H）、巾着縫合が反転容器の非内皮表面を閉鎖端部に配置されている。I）血管が洗浄のために50mlチューブに移し、その後の消化。スケールバーは2センチメートルを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 細胞形態の写真が2週間血管の消化後に採取したA）のEC由来のFR全ての写真は、4X、元の倍率で撮影された通路内のイヌ大静脈2. C由来通路2 B）のEC）通路2におけるイヌの静脈門脈由来のECにおけるオム犬の大動脈。スケールバーは500μmで示しています。挿入は、10倍の倍率を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：CD31 の遺伝子発現 。大動脈、大静脈、および静脈ポルタた（n = 4匹のイヌ）由来の通路1内の内皮細胞におけるCD31の発現。有意な発現差がCaPECsとCnAOECsの間で観察されなかった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：血管新生スライド（20X倍率）での6時間のインキュベーション後の大動脈、大静脈と静脈門脈からCnAOECsとCaPECsの血管新生写真。分枝形成は、培養中の6時間後に表示されている。大動脈由来A）CnAOECs。B）CaPECs。大静脈由来C）CaPECs。D）静脈門脈由来CaPECs。全ての細胞は継代3にスケールバーは1ミリメートルを示した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| GOI | 方向 | 5 '配列の3' | Tmのアニール | 製品サイズ（bp）の | ジーンバンク番号 | |
| CD31 | フォワード | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59°C | 85 | XM_005624261.1 | |
| 逆 | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| β-アクチン | フォワード | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58°C | 384 | NM_001195845 | |
| 逆 | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | フォワード | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63°C | 95 | XM_005616513 | |
| 逆 | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | フォワード | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63°C | 85 | AB745507 | |
| 逆 | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
表1： 定量PCRプライマーは、設定したイヌの参照遺伝子とCD31のための定量PCRプライマーを。
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Discussion
イヌのECに焦点を当てた研究ではCnAOECプライマリラインは犬3、12、13の内皮系統をモデル化するために使用されている。ヒトの研究では、HUVECの文化は、まだゴールドスタンダードと考えられています。明らかに、臍帯由来のECに単に焦点を当てすることは、心血管研究の会社制限があります。内皮細胞は、静脈の仕様を決定する特定の遺伝子の発現パターンを有します。出生後の血管におけるこれらの違いを考慮するために、我々は、内皮細胞の特定の解剖学的位置に基づいて、この新たな分離法を提示します。一般に、一次EC単離するために使用される方法は、両方の非電気部品との汚染の危険性を有する2つの方法を酵素溶液で容器を洗浄するか、消化の前に容器をミンチしています。また、小血管に使用することができ、汚染の少ないチャンスで犬の初代内皮細胞（CaPECs）の単離のための技術を確立しました。この分離メートル内皮細胞のethodは、他のすべての血管細胞型の消化を回避する容器の反転に基づいています。 図1Aに示されるように、内皮細胞培養物の細菌または真菌汚染を防止するために、無菌的に容器を除去することが重要です。細菌増殖の場合には、追加の抗微生物剤（ 例えば、ゲンタマイシン）を培地に添加することができます。真菌感染症の治療の場合にはしばしば私たちの経験では成功していません。
成功する反転ためには、長さが約5cmで容器を得ることが重要です。血管の反転を容易にするための第二の重要なステップは、手術用ハサミで任意の付着組織と脂肪を除去することです。容器を反転させると、反対側の端に鉗子をクランプし、ゆっくり容器を反転させることによって慎重に行われます。配置するときに巾着縫合糸はできるだけ内皮層に触れていることを確認します。ダマ内皮のGEは、生存内皮細胞とその下にある組織への消化メディアのアクセスの悪い収量をもたらすことができます。容器が完全に閉じられていない場合にも発生することができます。容器は、容易に結紮糸の端部でそれを撮像して扱うことができます。
特定の場合において技術の変形を適用することができます。小径の血管では、容器を反転するために、モスキート鉗子を挿入することができない場合があります。解決策は、容器の一端に滞在縫合糸を配置し、鉗子を用いた血管を介して自分の合字をプッシュすることです。もう一方の端で彼らは、それによって容器を反転、モスキート鉗子で固定し、引っ張ることができます。時々、容器は、余分な縫合糸の結果として涙ますので、この変更は、好ましい方法ではありません。多くの赤血球が一次細胞の播種時の培養プレート中に存在する場合に生じ得る別の問題です。これは、の結果であり得ます前消化血管の不十分な洗浄。これが発生すると、温かいHBSSで2日目に、ウェルを洗浄することは、多くの場合、赤血球の大部分を除去するのに十分です。いずれの場合も、赤血球は、培養中に保持されませんとCaPECsの継代時に失われています。
単離されたCaPECs血管から消化された細胞集団は、実際に、内皮起源であることを示す、CD31を発現しました。最近公開されたように、このマーカーはまた、イヌの僧帽弁14からの内皮細胞で発現されます。培養中のコロニーの形成は、文化は、単一の細胞のいずれかから、または小細胞クラスターからスタート示しています。内皮特異的培地上で急速な成長はまた、正しい細胞型の指標です。初代細胞培養物が膨張を停止た後8継代培養することができます。これは、老化の兆候であり、幹細胞/前駆細胞がこのプロトで培養することが少なくなりますCOL。血管形成アッセイでは、大動脈、大静脈と静脈門脈からCaPECsは6時間以内に分岐を示しました。この内皮機能は、その起源のための強固な証拠を提供します。
可用性に基づいてのみイヌ材料が研究されたが、単離方法は、ヒト初代内皮細胞または他の生物由来の内皮細胞の単離のための可能な用途を有します。技術は、非常に小さな容器（長さ1cm）も可能であるが、より少ない単離された細胞が得られます。彼らは実験のための十分な数に達した前に、このような理由から小血管から得られたCaPECsは余分な通路が必要になります。
小血管の分離法を実行する能力は、血管疾患での研究のための大きな利点です。 ECが門脈体循環シャントのような病気にかかったり、異常な血管から単離することができました。これらは、門脈と血液が肝臓を迂回させる循環を接続する容器で2 15,16を研究するための強力なモデルとすることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
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