Introduction
Honden worden gebruikt als grote diermodel voor cardiovasculaire ziekte onderzoek en kan ook last hebben van aangeboren (genetische) vasculaire abnormaliteiten 1, 2. Om deze ziekten commerciële endotheliale cellijnen worden vaak gebruikt om endotheelcellen (EC) functionaliteit beoordelen bestuderen. Voor honden is er een commercieel endotheliale cellijn beschikbaar (CnAOEC), afkomstig van honden aorta. Deze cellijn wordt meestal gebruikt in studies als controle normale EC 3-5. In menselijke cardiovasculair onderzoek het meest gebruikte endotheliale cellijnen humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) en Human Umbilical Artery endotheelcellen (HUAECs) afgeleid van menselijke navelstreng ader en slagader, respectievelijk. HUVEC's werden gebruikt als de gouden standaard voor vasculaire onderzoek sinds 1980 6. Zij worden beschouwd als de klassieke modelsysteem endotheelfunctie en aanpassing ziekte bestuderen. Endotheelcellen geïsoleerd uit verschillende bloedvaten variëren appearance en functionaliteit door genetische achtergrond en blootstelling aan de micro-7. Bovendien, HUVEC en HUAECs zijn afgeleid van navelstreng, een ontwikkelings vasculaire structuur die misschien niet volledig nabootsen volwassen bloedvaten met betrekking tot de voorwaarden die worden blootgesteld en respons op disease. Vandaar dat het vertalen van de resultaten gevonden in HUVECs en HUAECs aan hart- en vaatziekten in het algemeen onvoldoende is.
Bij het bestuderen aanpassing en gedrag van volwassen EC moet primaire EC uit het vat plaats worden gebruikt als een directere aanpak. Om deze cellen te isoleren, zijn verscheidene werkwijzen gerapporteerd. Een veel beschreven werkwijze, die ook wordt gebruikt voor HUVEC, wordt het vat spoelen met een enzymatische digestieoplossing 8. Dit resulteert vaak verontreinigd met niet-ECs zoals gladde spiercellen en fibroblasten 9. Een andere veel gebruikte werkwijze voor isolatie enzymatische digestie van gehakt vaatweefsel gevolgd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) op basis van endotheelcellen marker Cluster van Differentiatie (CD) 31 7, 8. FACS sortering en daaropvolgende celcultuur vereist relatief veel cellen en is daarom niet geschikt voor het isoleren van endotheel van kleine bloedvaten. Wij zijn dan ook gericht op het ontwikkelen van een nieuwe robuuste methode voor het isoleren van een zuivere endotheelcellen bevolking uit verschillende honden bloedvaten met een hoge zuiverheid. Om de efficiëntie van de nieuwe isolatiewerkwijze testen we geïsoleerd en verkregen zuivere Canine Primaire endotheelcellen (CAPEC) kweken van verschillende honden slagaders en aders, zowel grote als kleine. Deze methode maakt het ook mogelijk de cultuur van endotheelcellen afkomstig van zieke en / of afwijkende schepen zoals aangeboren intra- of extra-lever portosystemische shunts, een veel voorkomende ziekte bij honden 2. De werkwijze maakt de isolatie van aanvullende relevante celtypes van hetzelfde vat zoals vasculaire gladde spiercellen aangezien de meeste van het vaartuig blijft intoptreden tijdens de procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: Bloedvaten die in deze studie werden geoogst als overtollig materiaal verkregen uit verse honden kadavers (n = 4) van gezonde honden gedood voor andere niet-verwante onderzoek (Universiteit 3R-beleid). Afwijkende bloedvaten (intra- en extrahepatische portosystemische shunts, n = 1 elk) werden geoogst post-mortem na geïnformeerde toestemming van de eigenaren van honden voorgelegd aan de Universiteitskliniek voor Gezelschapsdieren van de Universiteit Utrecht.
1. Isolatie en cultuur van de Primary Canine endotheelcellen
- Voorbekleding 6-well platen met 2 ml / putje 0,5% w / v gelatine, laat gedurende 2 uur in een incubator met een vochtige atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Verwijder overtollig gelatine-oplossing voorafgaand aan het zaaien van de primaire cellen.
- Aseptisch verwijderen van het bloedvat (s) van belang (bijvoorbeeld, aorta, vena cava, vena porta) uit een nieuw hond kadaver (Figuur 1A). Handhaving van de anatomie van het schip systeemdoor het plaatsen van rechte tang aan beide uiteinden van het vat plaats. Onnodige manipulatie van het weefsel met een tang om schade aan de endotheelcellen te voorkomen.
- Snijd de geklemd vat aan beide uiteinden voorzien chirurgische schaar en uit het kadaver. Transport in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) op ijs.
LET OP: Een vaartuig lengte van circa 5 cm is de voorkeur voor deze procedure, maar die 1 cm meten zal ook voldoende cellen tot cultuur.
- Snijd de geklemd vat aan beide uiteinden voorzien chirurgische schaar en uit het kadaver. Transport in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) op ijs.
- Breng de bloedvat een petrischaal gevuld met ijskoude HBSS. Gebruik chirurgische schaar, verwijder aanhechtend weefsel en vet van de buitenkant van het vat, waarbij het vat zelf intact (Figuur 1B). Zorg ervoor dat het vat is duidelijk zichtbaar te allen tijde bij het snijden: trek vernietiging van het omringende weefsel met een klem of pincet voor een optimale weergave.
- Sluit alle takken van het schip met ligaturen (bijv polyglactine 3-0) en vervolgens deze te verwijderenmet chirurgische schaar of een scalpel.
- Voer voorzichtig een vat met een gebogen uiteinde Halsted mosquitoklem klemt het uiteinde van de tang aan het andere einde van het vat en vervolgens terugtrekken langzaam omkeren van het vat totdat het volledig binnenste buiten (figuur 1C-G). De buitenkant bestaat nu uit de endotheliale cellaag. Als er een probleem wordt aangetroffen op het omkeren van het vat, onder te dompelen in HBSS opnieuw om wrijving te verminderen.
- Plaats samentrekkende hechtdraden aan beide uiteinden van het vat om het volledig sluiten en de blootstelling van niet-endotheliale vaatweefsel de destructieprocedure (Figuur 1H) te voorkomen. Gebruik de ligatuur uiteinden om de omgekeerde vat te manipuleren.
- Als de spijsvertering en cultuur later wordt uitgevoerd, cryopreserve de omgekeerde vat voorafgaand aan de vertering protocol (stap 1.7).
- Leg de omgekeerde vaartuig in een cryovial en vul met celcultuur bevriezing medium. Ontdooide tot -80 ° C met een ijskoud container. Bewaar bij -80 ° C of vaartuigen voor gebruik binnen een week. Voor de lange termijn opslag, plaats cryovials bij -180 ° C. Bij het uitvoeren van het EG-isolatie, dooi de cryovials snel in een waterbad (37 ° C) en onmiddellijk plaatsen in ijskoude HBSS. Handel zoals beschreven in 1.7.
LET OP: Houd er rekening mee dat de totale opbrengst van de EC na isolatie lager zal zijn als gevolg van het verlies van de levensvatbaarheid tijdens het invriezen.
- Leg de omgekeerde vaartuig in een cryovial en vul met celcultuur bevriezing medium. Ontdooide tot -80 ° C met een ijskoud container. Bewaar bij -80 ° C of vaartuigen voor gebruik binnen een week. Voor de lange termijn opslag, plaats cryovials bij -180 ° C. Bij het uitvoeren van het EG-isolatie, dooi de cryovials snel in een waterbad (37 ° C) en onmiddellijk plaatsen in ijskoude HBSS. Handel zoals beschreven in 1.7.
- Breng het vaartuig naar een 50 ml buis en spoel het twee keer in HBSS om erytrocyten te verwijderen (of resterende bevriezing medium in het geval van het ontdooien) (Figuur 1I).
- Digest het vaartuig in een 50 ml buis met een oplossing van 30 ml collagenase type II (0,15 U / ml) en dispase (0,15 U / ml) in Canine endotheelcellen groeimedium (CECGM) gedurende 1 uur bij 37 ° C met intermitterende zachte agitatie.
- Verwijder het vat uit de buis en centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 250 x g.
- Resuspendeer de celpellet in een CECGMnd zaad 2 ml celsuspensie per putje (1-3 putten afhankelijk van de grootte van het vaartuig). De cellen te kweken bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 in lucht en veranderen het kweekmedium tweemaal per week.
- Passage van de cellen bij een confluentie van 70-80% bereikt.
- Was de cellen met voorverwarmd HBSS om dode of niet-ingeschreven cellen te verwijderen. Voeg 200 ul recombinant cel-dissociatie enzym (1x) aan elk putje en zet terug in de incubator gedurende 5 minuten of totdat alle cellen worden losgemaakt.
- Overdracht van de cellen om een 15 ml buis en stop trypsine door toevoeging van 10 ml kweekmedium (CEGM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS). Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 250 x g. Voortzetting van de cultuur in een gelatine pre-gecoate plaat of kolf.
2. Analyse
- Cultuur Canine aorta endotheelcellen (CnAOECs) te zoeken en de morfologie van de primaire en commerciële cellijnen tweemaal per week met een microscoop.
LET OP: THij typische groeiende patroon van de EC aan flarden kan het best worden waargenomen wanneer een confluentie van> 70% is bereikt.- Cultuur CnAOECs in CECGM op een 0,5% w / v gelatine voorbekleed T75 kolf. Passage cellen eenmaal per week bij de confluentie is 70-80%.
- Voor passage, was de cellen eenmaal met voorverwarmde HBSS en voeg 1 ml recombinant cel-dissociatie enzym (1x). Plaats de kolf opnieuw in de incubator gedurende 5 minuten of totdat alle cellen worden losgemaakt. Inactiveren trypsine door toevoeging van 10 ml kweekmedium (CEGM) inclusief 10% FCS. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 250 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml kweekmedium.
- Neem een 10 pl aliquot van de celsuspensie en verdund 1: 1 met 0,4% trypan blauw. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde cel tegen te gaan, en de plaat uit 4,0 x 10 5 levensvatbare cellen in een nieuwe T75 kolf. Voeg 10 ml voorverwarmd CECGM aan de kolf en kweek bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
- Cultuur CnAOECs in CECGM op een 0,5% w / v gelatine voorbekleed T75 kolf. Passage cellen eenmaal per week bij de confluentie is 70-80%.
- Isoleer RNA van passage 1 van de gekweekte CaPECs en CnAOECs.
- Vang minimaal 1 x 10 3 cellen als pellet, voeg 20 ul monsterbereiding reagens (SPR) en incubeer gedurende 1 min om de cellen te lyseren. Na incubatie zorgvuldig verzamelen cellysaat bevattende totaal RNA en bewaar bij -70 ° C.
- Converteren mRNA in cDNA met behulp van een cDNA-synthese kit (bijv iScript) volgens de instructies van de fabrikant. cDNA bewaar bij 4 ° C maximaal een week, of bij -20 ° C voor lange termijn tot gebruik de qPCR voeren.
- Meet genexpressie van de endotheliale marker CD31 om endotheelcellen oorsprong te bevestigen. Voer experimentele opstelling en kwantificering met behulp van de MiQE précis richtlijnen 10. Voor normalisatie, het meten van de expressie van genen verwijzing GAPDH, RPS19 en B2MG 11.
- Bereid een 10-voudige verdunning van het verkregen cDNA in nuclease vrij water.
- Klaarmakeneen 4-voudige verdunning van samengevoegde cDNA monsters voor de standaardlijn en gebruik nuclease vrij water als een niet-mal controle. Verdun de monsters vijf keer naar een 50-voudig de totale verwatering voor qPCR reacties te bereiken. Pipetteer 10 ul reacties in tweevoud in een 384-well formaat met behulp van 4 pi cDNA en 6 pi van de fluorofoor gemengd met 20 pmol reverse en voorwaartse primer (tabel 1).
- Stel het programma 95 ° C gedurende 5 min voor Taq polymerase activering, gevolgd door 39 cycli van 10 sec bij 95 ° C voor denaturatie, en 30 sec bij Tm voor annealing en verlenging. De Tm voor elke primerset wordt weergegeven in tabel 1.
- Voeren smeltcurve analyses na elke run op slechts één product te waarborgen wordt versterkt. Normaliseren van de expressieniveaus van de monsters met de gemiddelde hoeveelheid die de referentie genen, en bereken de ACt als reactie-efficiëntie tussen 95% en 105%.
- Assess EG functionaliteit met een Angiogenesis assay.
- Voeg 10 ul van extracellulaire matrix aan elk putje van een voorgekoelde angiogenese glijbaan en verspreid met een pipet op het oppervlak van de put omvatten. Houd de extracellulaire matrix op ijs en vermijd de introductie van luchtbellen in de gel. Stollen de gel door het plaatsen van de slede in een petrischaal met water doordrenkte papieren handdoekjes in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 30 minuten.
- Voeg 1,0 x 10 4 primaire EC aan 50 gl endotheelcellen groeimedium per putje. Incubeer de glijbaan voor 6 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
- Na 6 uur foto's nemen met een 20x vergroting, en zorg ervoor dat het geheel goed onder in het beeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verschillende bloedvaten werden met succes aan de beschreven isolatieprotocol (figuur 2). Het was mogelijk om te ontleden en te keren aorta, vena cava, vena porta en kransslagader van gezonde honden (alle schepen van elke hond, n = 4). Met dezelfde aanpak EC werden geïsoleerd uit twee aangeboren portosystemische shunts (extrahepatische en intrahepatische, n = 1 per stuk). Hoewel aorta gemakkelijk werd omgekeerd, thoracale aorta segmenten waren een grotere uitdaging dan de abdominale aorta. Thoracale aorta segmenten vele intercostale slagaders vertakkingen ervan, die afzonderlijk moeten worden geligeerd strikt endotheliale blootstelling aan de verteringsoplossing waarborgen. De ontlede segment caudale vena cava onder het vertakkingspunt van de renale aderen, die moeten worden geligeerd vóór inversie. Voor de poortader de bijdragende tak van de vena gastroduodenalis geligeerd vóór inversie van het bloedvat. de Coronary slagader bij honden is een bloedvat veel kleiner (ongeveer 1 - 2 mm diameter in een middelgrote hond), waar we een deel van de circumflex tak uitgesneden. Omdat het een kleine diameter, bleek het gemakkelijker om een vrij kort segment van 1 cm omkeren omdat het mosquitoklem niet veel verder kan worden ingebracht.
Een dag na de isolatie gehandeld cellen zichtbaar waren in de cultuur plaat. In cultuur CaPECs had een polygonale vorm en vertoonde een neiging te groeien in patches figuur 3 Veel kolonies van endotheelcellen kan worden waargenomen 3 -. 6 dagen na isolatie. Na ongeveer 10 dagen in de cultuur van een confluentie van 80% werd bereikt en cellen kunnen worden overtroffen. Gemiddeld primaire endotheliale kweken kan worden gehandhaafd gedurende maximaal 8 doorgangen (eenmaal per week bij een snelheid van splitsing 1: 4) waarna zij gestopt met groeien.
Isolated endotheelcellen tot expressie endotheliale merker CD31 zoals aangeduid door qPCR (figuur 4). De expressie in endotheelcellen afgeleid van aorta, vena cava, en de vena porta van vier honden werd vergeleken met een controlekweek van CnAOECs. De gekweekte primaire cellen hadden een vergelijkbaar CD31 expressie met de besturing EC (Kruskall-Wallis, p = 0,856).
CaPECs afgeleid van aorta, vena cava en vena porta toonde vertakking na 6 uur incubatie op de angiogenese dia zie figuur 5.
Figuur 1: Opheldering en omkeren Bloedvaten voor endotheelcellen Isolation. A) De bloedvat van belang wordt aseptisch verwijderd uit een nieuw hond kadaver. B) aanhangende weefsels en / of vet rond het schip dient te zijn afneemed voorzichtig met chirurgische schaar zonder beschadiging van het schip zelf (honden vena cava, abdominale segment van 5 cm). C) met een gebogen Halsted Mosquito tang, het schip kan worden ingevoerd zonder perforeren de endotheliale laag. DG) Zet de tang aan de andere kant einde van het bloedvat en voorzichtig terugtrekken, waardoor volledig omkeren van het bloedvat. De endotheliale laag nu aan de buitenzijde van het vat. H) beurs-hechtdraden zijn aan de uiteinden afsluiten van de niet-endotheliale oppervlak van het omgekeerde vat. I) het bloedvat wordt overgebracht naar een 50 ml buis voor het wassen geplaatst en daaropvolgende digestie. Schaal balken geven 2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:.. Cell morfologie foto's werden genomen twee weken na vertering van de vaten A) EC afgeleid frOM honden aorta in passage 2. B) EC afkomstig van honden vena cava in passage 2. C) EC afkomstig van honden vena porta in passage 2. Alle foto's zijn genomen met 4x originele vergroting. Schaalbalken geven 500 urn. Steek toont 10x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: genexpressie van CD31. Expressie van CD31 in endotheelcellen in passage 1 ontleend aorta, vena cava, en vena porta (n = 4 honden). Er werden geen significante verschillen in expressie waargenomen tussen de CaPECs en de CnAOECs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Angiogenese Foto's van CnAOECs en CaPECs van aorta, vena cava en vena porta na 6 uur incubatie op de angiogenese slide (20x vergroting). Formatie tak zichtbaar is na 6 uur in de cultuur. A) CnAOECs. B) CaPECs afkomstig van aorta. C) CaPECs afgeleid van vena cava. D) CaPECs afgeleid van vena porta. Alle cellen waren in passage 3. Schaal balken geven 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Indiase overheid | Richting | 5'-Sequence-3 ' | Tm gloeien | Grootte van het product (bp) | genenbank nummer | |
| CD31 | vooruit | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59 ° C | 85 | XM_005624261.1 | |
| Omgekeerde | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| beta-actine | vooruit | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58 ° C | 384 | NM_001195845 | |
| Omgekeerde | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | vooruit | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63 ° C | 95 | XM_005616513 | |
| Omgekeerde | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | vooruit | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63 ° C | 85 | AB745507 | |
| Omgekeerde | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
Tabel 1: qPCR Primer Stelt qPCR primers voor honden verwijzing genen en CD31..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In studies gericht op honden EC de primaire lijn CnAOEC wordt gebruikt om de endotheliale lijnen van de hond 3, 12, 13 te modelleren. In humane studies, is de HUVEC cultuur nog steeds beschouwd als de gouden standaard. Het is duidelijk dat, met de nadruk alleen op de EC afkomstig uit de navelstreng is een stevige beperking in de cardiovasculaire onderzoek. Endotheelcellen een genexpressie patroon bepalen arterioveneuze specificatie. Om rekening houden met deze verschillen in postnatale vaartuigen stellen wij deze nieuwe isolatiemethode gebaseerd op de specifieke anatomische locatie van de endotheelcellen. De gebruikelijke primair EC isolatiemethoden spoelt het vaartuig met een enzymoplossing of hakken het vat voorafgaand aan digestie twee methoden beide verontreinigd met niet-EC. We hebben een techniek voor het isoleren van Canine Primaire endotheelcellen (CaPECs) met minder kans op besmetting die ook kan worden aangebracht op kleine vaartuigen. Deze isolatie methode van endotheliale cellen is gebaseerd op de inversie van het vaartuig, die vertering van andere scheepstypen cellen voorkomt. Het is belangrijk om de vaten aseptisch verwijderd, zoals geïllustreerd in figuur 1A, bacteriële of fungale besmetting van de endotheliale culturen voorkomen. Bij bacteriegroei tegen antimicrobieel middel (bijvoorbeeld gentamycine) aan het kweekmedium worden toegevoegd. Bij schimmelinfectie behandeling is vaak niet succesvol in onze ervaring.
Om de inversie slagen, is het essentieel om een vat die ongeveer 5 cm in lengte te verkrijgen. Een tweede belangrijke stap om inversie van het bloedvat te vergemakkelijken is de verwijdering van aanhechtend weefsel en vet met chirurgische schaar. Omkeren van het vat wordt zorgvuldig uitgevoerd door het klemmen van de tang aan de andere kant en langzaam omkeren van het vat. Bij het plaatsen van de portemonnee-string hechtingen zorg ervoor dat de endotheliale laag zo min mogelijk aan te raken. Damage van het endotheel kan leiden tot een slechte opbrengst van levensvatbare endotheelcellen en toegang van de vertering media onderliggende weefsel. Dit kan ook gebeuren als het schip niet volledig gesloten is. Het vat kan gemakkelijk worden behandeld door het oprapen op het einde van een ligatuur.
In specifieke gevallen een modificatie van de techniek kan worden toegepast. In bloedvaten met een kleine diameter is het soms onmogelijk om een mosquitoklem steken om het vat te keren. Een oplossing is het verblijf hechtingen te plaatsen op een uiteinde van het vat en banen zich ligaturen door het bloedvat met de tang. Aan de andere kant kunnen ze worden vastgezet met een mosquitoklem en getrokken, waardoor het vat omkeren. Soms het vat scheurt ten gevolge van de extra hechtingen, zodat deze wijziging niet de voorkeur. Een ander probleem dat kan optreden is wanneer veel erytrocyten in de kweekplaten bij het enten van de primaire cellen. Dit kan het gevolg zijn vanonvoldoende wassen van het bloedvat voorafgaand aan digestie. Wanneer dit gebeurt, wassen van de putjes op dag 2 met warm HBSS vaak voldoende om de meerderheid van de erytrocyten verwijderd. In ieder geval zal de erytrocyten niet bestaan in de cultuur en zijn verloren bij passage van de CaPECs.
De geïsoleerde CaPECs CD31 tot expressie, wat aangeeft dat de populatie van cellen die werd geknipt uit het bloedvat inderdaad van endotheliale oorsprong. Zoals onlangs is deze markering ook tot expressie gebracht in endotheliale cellen van de hond mitralisklep 14. De vorming van kolonies in kweek geeft de kweken starten van ofwel enkelvoudige cellen of kleine celclusters. Snelle groei op endotheliale specifieke media is ook een indicatie van het juiste type cel. De primaire cellen kunnen worden gekweekt gedurende acht passages, waarna de kweken beëindigen expansie. Dit is een indicatie van senescentie en maakt het minder waarschijnlijk dat stamcellen / voorlopercellen zijn gekweekt met deze protocol. Per angiogenese assay CaPECs van aorta, vena cava en vena porta toonde vertakking binnen 6 uur. Deze endotheliale functionaliteit biedt solide bewijs voor hun oorsprong.
Volgens beschikbaarheid werd alleen honden bestudeerd materiaal, maar de isolatiemethode is toepassingsmogelijkheden van isolatie van humane primaire endotheelcellen endotheelcellen of van andere organismen. De techniek is ook mogelijk voor zeer kleine vaten (1 cm lengte), maar minder geïsoleerde cellen opleveren. Om deze reden CaPECs verkregen van kleine schepen zullen een extra passage voordat ze een voldoende aantal voor experimenten hebben bereikt.
De mogelijkheid om de isolatiemethode voeren op kleine schepen is een groot voordeel voor onderzoek bij vaatziekten. EC kan worden geïsoleerd uit zieke of afwijkende schepen als portosystemische shunts. Dit zijn schepen het aansluiten van de poortader en de systemische circulatie waardoor het bloed naar de lever te omzeilen 2 15, 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
