Introduction
狗被用作大型动物模型为心血管疾病的研究和也可以从天生（基因）血管异常1,2受到影响。为了研究这些疾病的商业内皮细胞系通常用于评估内皮细胞（EC）的功能。狗有可用（CnAOEC）一家商业内皮细胞线，从犬主动脉的。该细胞系在研究，作为控制正常内皮细胞3-5个最常用的。在人类心血管疾病研究中最常用的内皮细胞系分别来自人脐静脉和动脉，派生人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人脐动脉内皮细胞（HUAECs）。内皮细胞已被用来作为自1980年代以来6在血管研究的金标准。它们被认为是研究内皮功能和疾病适应的经典模型系统。从不同的血管分离的内皮细胞的变化appearance和由于遗传背景和暴露于微环境7的功能。另外，内皮细胞和HUAECs从脐带衍生的，可能不会完全模拟成人血管相对于该条件下，它们被暴露于并响应于疾病发展的血管结构。因此，在一般翻译内皮细胞中发现的结果和HUAECs心血管疾病是不够的。
当学习适应和成年内皮细胞的行为，从感兴趣的容器主内皮应作为一个更直接的方法。为了分离这些细胞，已报道的几种方法。一种广泛描述的方法，它也用于内皮细胞，用酶消化溶液8冲洗容器。这通常会导致与非内皮细胞污染如平滑肌细胞和成纤维9。为隔离另一种常用的方法是剁碎血管组织的酶消化，随后通过荧光 -激活细胞根据分化（CD）的31 7，8。FACS分选的内皮细胞标记物群集和随后的细胞培养分选（FACS）需要相对大量的细胞的，因此不适合于内皮细胞的小血管的隔离。因此，我们旨在开发用于从各种犬血管具有高纯度的分离出纯的内皮细胞群的新的鲁棒方法。为了测试新的隔离方法的有效性，我们分离并从不同的犬动脉和静脉，大型和小型纯获得主犬内皮细胞（CAPEC）文化。这种方法还可以使从患病和/或异常血管始发如先天内或肝外门体分流，犬2的常见疾病的内皮细胞的培养。该方法允许额外的相关细胞类型相同的容器，如血管平滑肌细胞的分离，因为大多数的船只保持INT在操作过程中起作用。
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Protocol
伦理声明：在本研究中所用的血管收获是从新鲜尸体犬获得的剩余材料（N = 4）安乐死其他无关的研究（大学3R政策）健康的狗。异常血管（内和肝外门体分流术，N = 1个）收获从提交给大学医院的乌得勒支大学的伴侣动物狗的业主知情同意后验尸。
1.隔离主犬内皮细胞的培养和
- 用2ml /孔的0.5％w / v的明胶和预涂层6孔板，在37℃用5％CO 2的潮湿气氛离开2小时在恒温箱。播种原代细胞之前，除去多余的明胶溶液。
- 无菌删除从新鲜尸体犬（ 图1A）血管（S）的利益（ 例如，主动脉，下腔静脉，肝门静脉）。维持血管系统的解剖结构通过将直镊子感兴趣的容器的两端。避免与镊子的组织的不必要的操作，以防止对血管内皮细胞的损伤。
- 切断与手术剪两端夹紧容器，并从尸体除去。运输中Hank氏冰上平衡盐溶液（HBSS）中。
注：大约5厘米的容器长度是优选的此过程，但那些测量1厘米还将向培养提供足够的细胞。
- 切断与手术剪两端夹紧容器，并从尸体除去。运输中Hank氏冰上平衡盐溶液（HBSS）中。
- 血管转移至培养皿填充用冰冷的HBSS。用手术剪，从容器的外侧除去任何粘附的组织和脂肪，保持容器本身完整（ 图1B）。确保切割时船舶在任何时候都清晰可见：拉拨周围组织用夹子或镊子最佳视图。
- 关闭船只的任何分支机构，连字（ 例如 ，聚乳糖3-0），随后将其删除与外科剪刀或手术刀。
- 小心进入具有弯曲霍尔斯特德蚊子镊子的容器端，在容器的另一端夹住钳子的前端，然后缩回，慢慢倒转容器中，直至其完全内向外（ 图1C-G）。外部现在由内皮细胞层的。如果任何困难是在反相容器中遇到，淹没在HBSS再次以减少摩擦。
- 放置荷包缝合在容器的两端完全关闭它，并防止任何非内皮血管组织的消化过程（ 图1H）的曝光。使用绑带末端操纵倒置容器中。
- 如果消化和文化稍后进行冷冻保存前的消化协议（步骤1.7）倒船。
- 将倒船只混和，细胞培养冻存液填充。冻结下降到-80℃，用冷冻合作ntainer。储存于-80℃，如果船只要在一周内使用。对于长期储存，在-180℃的冷冻管到位。当执行欧共体隔离，迅速解冻冷冻管在水浴（37℃），并立即放置在冰冷的HBSS。请按照1.7所示。
注意：考虑到该内皮细胞的分离后的总产率将降低，由于在冷冻过程中丧失活力。
- 将倒船只混和，细胞培养冻存液填充。冻结下降到-80℃，用冷冻合作ntainer。储存于-80℃，如果船只要在一周内使用。对于长期储存，在-180℃的冷冻管到位。当执行欧共体隔离，迅速解冻冷冻管在水浴（37℃），并立即放置在冰冷的HBSS。请按照1.7所示。
- 容器转移至50ml管中，并在HBSS冲洗两次以除去红细胞（或剩余冷冻介质在解冻的情况下）（ 图1I）。
- 消化在50ml管中在容器用30 ml胶原酶II型（0.15单位/ ml）和分散酶（0.15单位/毫升）的犬内皮细胞生长培养基（CECGM）1小时，在37℃，间歇温和溶液搅动。
- 从管中取出容器，并在250离心细胞悬浮液5分钟×g下。
- 重悬在CECGM一个细胞沉淀第二，每孔种子2毫升细胞悬液（1 - 3井取决于容器的大小）。培养在5％的CO 2在空气中的潮湿气氛中的细胞在37℃，并改变它的培养基每周两次。
- 通道中的细胞70汇合时 - 在达到80％以上。
- 清洗细胞与预热HBSS去除死或非贴壁细胞。加入200μl重组细胞解离酶（1倍），以每个孔，并放回培养箱中5分钟或直到所有的细胞分离。
- 转移细胞到15毫升管中并通过加入10ml培养基（CEGM）含10％胎牛血清（FCS）的停止胰蛋白酶消化。离心机在250×g下5分钟。继续培养明胶预涂板或瓶。
2.表征
- 培养犬主动脉内皮细胞（CnAOECs）并比较初级和商业细胞系用显微镜每周两次的形态。
注：t他典型的成长内皮细胞的图案补丁是达到> 70％汇合时，最能观察到。- 培养CnAOECs在CECGM上的0.5％重量/预涂-V明胶T75烧瓶中。传代细胞每周一次当汇合为70％ - 80％。
- 为传代，用预温热的HBSS洗涤细胞一次，并加入1 ml重组细胞解离酶（1×）。放置烧瓶放回培养箱中5分钟或直到所有的细胞分离。通过加入10ml培养基（CEGM）含10％FCS的灭活胰蛋白酶。离心细胞悬浮液5分钟，在250 xg离心，弃去上清，重悬在1ml培养基中的细胞。
- 取细胞悬浮液的10微升等分试样和稀释1：1 0.4％台盼蓝。计数使用自动细胞计数器的细胞，并在新的T75烧瓶积垢4.0×10 5个活细胞。在37℃下在5％的CO 2的潮湿气氛中加入10 mL预热CECGM的烧瓶中并培养。
- 培养CnAOECs在CECGM上的0.5％重量/预涂-V明胶T75烧瓶中。传代细胞每周一次当汇合为70％ - 80％。
- 从培养CaPECs和CnAOECs的通道1分离RNA。
- 收集至少为1×10 3个细胞作为沉淀，加入20微升样品制备试剂（SPR）的孵育1分钟以裂解细胞。培养后，小心收集含在-70℃下的总RNA和存储的细胞裂解物。
- 使用按照制造商的指示的cDNA合成试剂盒（ 例如，的iScript）转换的mRNA合成cDNA。在4℃长达一个星期，或者在-20℃储存的cDNA长期直至准备执行的qPCR。
- 测量血管内皮标记CD31基因的表达，以确认内皮细胞来源。执行实验装置和量化使用MIQE简要记录准则10。对于标准化，测量参考基因GAPDH，RPS19和B2MG 11的表达。
- 在无核酸酶的水制备得到的cDNA的10倍稀释。
- 准备从合并的cDNA样品的4倍稀释的标准线，并使用不含核酸酶的水作为非模板对照。稀释样本五次以达到定量PCR反应的50倍的总稀释度。一式两份移取10微升的反应中使用4μl的cDNA和6微升反向和正向引物（ 表1）的20皮摩尔混合荧光团的一个384孔格式。
- 程序设定为95℃，在95℃5分钟为Taq聚合酶活化，然后用10秒的39个循环变性，和在Tm 30秒退火和延伸。上述Tm为每个引物组示于表1中 。
- 进行熔解曲线分析下列每一次运行，以确保只有一个产品被放大。正常化使用参考基因的平均相对量的样品的表达水平，并计算ΔCT如果反应效率为95％和105％之间。
- 与ANGI评估EC功能ogenesis检测。
- 添加10微升的细胞外基质的一预冷却的血管发生滑动的各孔，并用移液管尖端扩散到覆盖的表面良好。保持在冰上的细胞外基质和避免引入气泡进入凝胶。通过用水浸湿的纸巾在37℃，5％的CO 2将所述滑动在培养皿在培养箱中30分钟固化的凝胶。
- 添加1.0×10 4个主 内皮在50μl内皮生长培养基每孔。孵育6小时，在37℃，5％的CO 2的幻灯片。
- 6小时后拍照用放大20倍，并确保包括整个很好的形象。
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Representative Results
不同的血管被成功经受所描述的隔离协议（ 图2）。这是可能的剖析和反转主动脉，下腔静脉，肝门静脉和冠状动脉健康的狗（从每只犬的所有船只，N = 4）。用同样的方法进行内皮两个先天性门体分流术（肝和肝内，N = 1个）隔离。虽然主动脉很容易倒，胸主动脉段均高于腹主动脉更具挑战性。在胸段中的主动脉有许多肋间动脉从它的分支，这需要单独连接，以确保严格内皮暴露在消化溶液中。尾部腔静脉解剖段包括肾静脉，这需要反转之前被连接的分支点。对于门静脉腔gastroduodenalis的贡献分支血管的反转前结扎。该coronar犬Ÿ动脉是一个更小的血管（约1 - 2直径为中型犬毫米），从中我们切除了回旋支段。因为它有一个小的直径，它被证明是容易反转1cm的相当短的段，因为蚊子镊子不能太大进一步插入。
一天后隔离粘附细胞在培养板中可见。在培养，CaPECs具有多边形形状，并显示为如图3所示的补丁以生长倾向的内皮细胞的许多集落可能3中可以观察到。 -分离后6天。后在培养约10天后的80％达到融合和细胞可被超越。平均初级内皮细胞培养能够维持最多8个通道（以1分率每周一次：4）在这一点上他们停止生长。
伊索拉通过qPCR（ 图4）所指示的泰德内皮细胞中表达的内皮细胞标志物CD31。在从主动脉，腔静脉，并静脉肝门从四条狗来源的内皮细胞中的表达与CnAOECs的控制培养物相比较。培养的原代细胞与对照ECS（Kruskall - 沃利斯，P = 0.856），可比的CD31的表达。
从主动脉，腔静脉和静脉肝门衍生CaPECs 如图5后的血管生成的幻灯片6小时孵育显示出支化。
图1： 解剖和反相血管内皮细胞分离。 A）感兴趣的血管无菌从一个新的犬尸。B）贴壁组织和/或容器周围应祛瘀脂肪去除编仔细而不损坏容器本身（犬腔静脉，5厘米腹段）。13 C）同一个弯曲霍尔斯特德蚊镊子手术剪，该容器可以在不穿孔的内皮细胞层进入。DG）固定在另一钳血管的结束，并轻轻地缩回，从而完全颠倒血管。现在内皮细胞层是在该容器中。H的外侧）荷包缝线被放置在端部封闭的倒置容器中。Ⅰ）的血管转移到50ml管中用于洗涤的断非内皮表面和随后的消化。比例尺表示2厘米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：。 细胞形态照片是血管的消化两周后拍摄的）内皮源性FR在通道2。B OM犬主动脉）的EC从犬腔静脉源性的通路2 C）从犬肝门静脉通道中2.所有图片来源内皮细胞等都是用原来的4倍的放大倍率。比例尺显示500微米。将显示放大10倍。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：CD31 基因的表达 。 CD31的在通道1的内皮细胞从主动脉，腔静脉，和静脉肝门（n = 4的犬）衍生的表达。观察CaPECs和CnAOECs之间无显著表达差异。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：从主动脉，腔静脉和静脉肝门后血管发生滑动（20X放大率）6小时孵育CnAOECs和CaPECs的血管生成照片。后从主动脉。Ç衍生文化。A）CnAOECs。B）CaPECs）从下腔静脉。ð派生CaPECs）CaPECs 6小时从肝门静脉分支衍生的形成是可见的。所有的细胞在通道3.档位横道1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
| GOI | 方向 | 5'-序列-3' | TM退火 | 产品尺寸（BP） | 基因库号 | |
| CD31 | 前锋 | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59℃ | 85 | XM_005624261.1 | |
| 相反 | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| β-肌动蛋白 | 前锋 | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58℃ | 384 | NM_001195845 | |
| 相反 | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | 前锋 | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63℃ | 95 | XM_005616513 | |
| 相反 | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | 前锋 | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63℃ | 85 | AB745507 | |
| 相反 | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
表1： 定量PCR的引物组的qPCR引物犬参考基因和CD31。
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Discussion
在研究中注重对犬内皮细胞的CnAOEC主线路用于狗3，12，13的内皮细胞谱系的模型。在人类的研究中，HUVEC文化仍然被认为是黄金标准。显然，仅仅着眼于从脐带来源的内皮细胞是心血管研究的坚定限制。内皮细胞具有特定的基因表达模式确定动规范。为了占产后血管这些差异，我们提出了一种基于血管内皮细胞的特定解剖位置这种新的隔离法。通常用于主乳油分离方法被冲洗用酶溶液的容器或之前消化切碎的容器中，两种方法都具有污染的与非内皮细胞的危险。我们建立了犬初级内皮细胞与污染的较少的机会，也可以在小血管中使用的隔离（CaPECs）的技术。这种隔离米内皮细胞的ethod是基于该容器，这避免了所有其它容器类型的细胞消化的反转。到无菌取出容器，如在图1A中所示，为了防止内皮培养的细菌或真菌污染是重要的。在细菌生长的情况下，一个额外的抗微生物剂（ 例如，庆大霉素）可被加入到培养基中。在真菌感染治疗的情况下，往往不是成功的在我们的经验。
为了使反转成功，关键是要获得的容器是大约5厘米长。以促进血管的倒置的第二个重要步骤是去除任何粘附的组织和脂肪与外科剪刀。反相器是通过在相对端夹紧钳并缓慢倒在容器仔细。当将荷包缝合，确保触摸尽可能少的内皮细胞层。达马内皮GE可导致存活内皮细胞和消化媒体访问底层组织的收益率差。这也可能发生，如果该船未完全关闭。该船可以很容易地拿起它，在结扎的最后处理。
在特定情况下的技术中的修改可以应用。在血管直径小，有时不可能为了反转容器插入蚊钳子。一种解决方案是放置在容器的一端留缝线和使用镊子通过血管推动他们的连字。在另一端，他们然后可以固定用一个蚊镊子和拉动，从而反相容器中。有时该容器会撕裂作为额外缝线的结果，所以这种变形不优选的方法。可能产生的另一个问题是，当许多红细胞中存在于原代细胞接种的培养板中。这可以是的结果之前消化血管的不足洗涤。当这种情况发生时，洗涤与温暖的HBSS第2天的井通常是足以除去大部分的红细胞。在任何情况下，红细胞不会在培养持续的，对CaPECs的传代都将丢失。
分离的CaPECs表达CD31的，这表明这是从血管消化细胞群确实内皮来源的。由于近期公布的，这个标记也在内皮细胞从犬二尖瓣14表示。在培养集落的形成指示的培养物可以是单细胞或小细胞簇启动。内皮特定介质的快速增长也表明正确的细胞类型。主细胞可为8次传代，之后将培养物停止扩张培养。这是衰老的迹象，并使得它不太可能是干/祖细胞与本原培养山坳。在血管生成实验，从主动脉，腔静脉和肝门静脉显示CaPECs 6小时内跳转。这内皮功能提供其来源确凿的证据。
基于可用性只犬材料进行了研究，但分离方法对人类初级内皮细胞或来自其他生物的内皮细胞的分离可能的应用。该技术也可以用于非常小血管（1cm长），但会产生以下分离的细胞。出于这个原因，从小型船只获得CaPECs将需要额外的通道，他们已经达到了实验的足够数量前。
对小型船只进行隔离方法的能力是在血管疾病的研究具有很大的优势。内皮细胞可以从患病或异常血管像门体分流术中分离出来。这些是连接门静脉和导致血液绕过肝脏体循环血管2 15，16。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
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