Introduction
כלבים משמשים כמודל חיה גדול למחקר מחלות לב וכלי דם וכן עלול לסבול מולדת (גנטי) מומים בכלי דם 1, 2. כדי לחקור מחלות אלה שורות תאים מסחריות אנדותל משמשות לעתים קרובות כדי להעריך תא האנדותל פונקציונלי (EC). לכלבים יש קו תא האנדותל מסחרי אחד זמין (CnAOEC), נגזר האאורטה כלבים. שורת תאים זה משמשת בעיקר במחקרים כשליטה נורמלית ECS 3-5. במחקר לב וכלי דם אדם שורות תאי אנדותל הנפוץ ביותר הם אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs) ותאי האנדותל עורקים אדם טבורים (HUAECs) נגזרים ורידים ועורקים כבל אדם טבור, בהתאמה. HUVECs שמש כתקן זהב במחקר וסקולרית מאז 1980 6. הם נחשבים מערכת המודל הקלסית ללמוד תפקוד האנדותל והתאמת מחלה. תאי האנדותל מבודדים כלי דם שונים להשתנות appearancדואר ופונקציונליות בשל רקע גנטי וחשיפה במיקרו-סביבה של 7. בנוסף, HUVECs ו HUAECs נגזרות חבל הטבור, מבנה כלי הדם התפתחותי שעלול לא לחקות באופן מלא כלי דם בוגרים ביחס לתנאי הם נחשפים ותגובה למחלות. לפיכך, תרגום תוצאות שנמצאו HUVECs ו HUAECs למחלות לב וכלי דם בכלל אינו מספק.
כאשר לומד הסתגלות והתנהגות של ECS המבוגרת, ECS העיקרי מהספינה של ריבית צריך לשמש גישה ישירה יותר. כדי לבודד תאים אלה, מספר שיטות דווחו. שיטה שתואר נרחב, אשר משמש גם HUVECs, מוחקת את הספינה עם פתרון עיכול אנזימטי 8. זה לעתים קרובות תוצאות זיהום עם הלא-ECS כגון תאי שריר חלק פיברובלסטים 9. שיטה נוספת בשימוש תדיר לבידוד היא עיכול אנזימטי של רקמת כלי הטחונה ואחריו fluorescence-תא מיון מופעל (FACS) מבוסס על אשכול סמן תא האנדותל של בידול (CD) 31 7, 8. FACS מיון תרבית תאים עוקבות דורש כמויות גדולות יחסית של תאים, ולכן הוא לא מתאים הבידוד של האנדותל מכלי דם קטנים. לפיכך, אנו שמטרתה לפתח שיטה חזקה חדשה לבידוד אוכלוסיית תא האנדותל טהורה מכלי דם כלבים שונים עם טוהר גבוה. כדי לבדוק את יעילות שיטת הבידוד החדשה, אנחנו מבודדים וקבלנו תא האנדותל הראשי כלב טהור (CaPEC) תרבויות מן עורקי כלבים שונים ורידים, גדולים וקטנים כאחד. שיטה זו גם מאפשרת התרבות של תאי אנדותל שמקורם חולה ו / או כלי סוטה כגון shunts portosystemic תוך או חוץ-כבדית מולד, מחלה נפוצה אצל כלבים 2. השיטה מאפשרת הבידוד של תאים מסוגים רלוונטיים נוספים של אותו הכלי כמו תאי שריר חלק בכלי דם מאחר שרוב הכולים נשאר intלפעול במהלך ההליך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אתיקת הצהרה: כלי דם השתמשו במחקר זה נבצרו כחומר עודף המתקבל גוויות כלבים טריות (n = 4) מכלבים בריאים מורדמים למחקר קשור אחרת (מדיניות האוניברסיטה 3R). כלי הדם סוטה (shunts portosystemic התוך extrahepatic, n = 1 כל אחד) נבצרו שלאחר המוות לאחר הסכמה מדעת של בעלי מכלבים בפני מרפאת אוניברסיטת עבור חיות של אוניברסיטת אוטרכט.
1. ניתוק והתרבות של תאים האנדותל לכלבים ראשיים
- טרום מעיל 6-גם צלחות עם 2 מ"ל / גם 0.5% w / v ג'לטין ולהשאיר למשך 2 שעות באינקובטור עם אווירה humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. סור פתרון ג'לטין עודף לפני זריעת התאים הראשוניים.
- בסביבה נקיה מחיידקים, להסיר את כלי הדם (ים) של עניין (למשל, אב עורקים, וריד נבוב, נבוב פורטה) מתוך (איור 1 א) פגר כלב טרי. לשמור על האנטומיה של מערכת כליעל ידי הצבת מלקחיים ישרים בשני הקצוות של כלי השיט של עניין. הימנע מניפולציה מיותרת של הרקמה עם מלקחיים כדי למנוע נזק לתאי אנדותל.
- חותך את הכלי המהודק בשני הקצוות עם מספרי כירורגיות ומסיר את הגופה. תחבורה תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS) על קרח.
הערה: כלי באורך של כ -5 סנטימטר היא מועדף עבור הליך זה, אבל אלה המודדים 1 סנטימטר גם יספקו מספיק תאים לתרבות.
- חותך את הכלי המהודק בשני הקצוות עם מספרי כירורגיות ומסיר את הגופה. תחבורה תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS) על קרח.
- מעביר את כלי הדם כדי בצלחת פטרי המלאה HBSS קר כקרח. בעזרת מספרי כירורגיות, להסיר את כל רקמת שומן חסיד מהחלק החיצוני של הספינה, שמירה על הכלי עצמו ללא פגע (איור 1 ב). ודא הכלי נראה בבירור בכל העת כאשר חיתוך: מסיט הצידה את הרקמה שמסביב עם מהדק או מלקחיים עבור תצוגה אופטימלית.
- סגור את כל הסניפים של כלי השיט עם ליגטורה (למשל, polyglactin 3-0) ובהמשך להסיר אותםעם מספריים כירורגיות או אזמל.
- בזהירות להזין סוף כלי עם מלקחי יתוש מעוקלים הלסטד, מהדק את קצה המלקחיים בקצה השני של הספינה ולאחר מכן לחזור בו, היפוך הכלי לאט עד שהוא לגמרי מבפנים החוצה (איור 1 ג-ז). מבחוץ עכשיו מורכב של שכבת תא האנדותל. אם כל קושי הוא נתקל על היפוך הכלי, לצלול HBSS שוב כדי להפחית את החיכוך.
- מניחים התפרים הארנק מיתרים בשני קצותיו של כלי השיט כדי לסגור אותו לחלוטין כדי למנוע חשיפה של כל רקמת כלי הדם הלא-אנדותל לנוהל העיכול (1H איור). השתמש הקצוות ליגטורה לתפעל את הכלי ההפוך.
- אם עיכול והתרבות מתבצע מאוחר יותר, cryopreserve הספינה ההפוכה לפני פרוטוקול העיכול (שלב 1.7).
- מניח את הכלי ההפוך בתוך cryovial ולמלא עם תרבית תאי הקפאה בינונית. להקפיא עד -80 ° C באמצעות שיתוף הקפאהntainer. חנות ב -80 ° C אם כלי ישמשו בתוך שבוע. עבור אחסון לטווח ארוך, במקום cryovials ב -180 מעלות צלזיוס. בעת ביצוע הבידוד EC, להפשיר את cryovials במהירות באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) ומכניסים מיד HBSS קר כקרח. המשך כמצוין 1.7.
הערה: קח בחשבון כי התשואה הכוללת של ECS לאחר הבידוד תהיה נמוכה כתוצאה מאובדן כדאיות במהלך תהליך ההקפאה.
- מניח את הכלי ההפוך בתוך cryovial ולמלא עם תרבית תאי הקפאה בינונית. להקפיא עד -80 ° C באמצעות שיתוף הקפאהntainer. חנות ב -80 ° C אם כלי ישמשו בתוך שבוע. עבור אחסון לטווח ארוך, במקום cryovials ב -180 מעלות צלזיוס. בעת ביצוע הבידוד EC, להפשיר את cryovials במהירות באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) ומכניסים מיד HBSS קר כקרח. המשך כמצוין 1.7.
- מעביר את הכלי לצינור 50 מ"ל ולשטוף אותו פעמים HBSS להסיר אריתרוציטים (או בינוני הקפאה שיורית במקרה של הפשרה) (איור 1 ט).
- לעכל את כלי בתוך שפופרת 50 מ"ל עם פתרון מסוג 30 מ"ל collagenase השנייה (0.15 U / ml) ו dispase (0.15 U / ml) בתאי האנדותל לכלבים צמיחה בינוני (CECGM) במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם לסירוגין עדין תסיסה.
- הסר את הכלי מצינור צנטריפוגות השעית התא במשך 5 דקות ב 250 x גרם.
- Resuspend גלולה תא CECGMnd ההשעיה תא מ"ל זרע 2 לכל טוב (1 - 3 בארות בהתאם לגודל כלי). התרבות התאים ב 37 ° C באווירה humidified עם 5% CO 2 באוויר ולשנות את המדיום תרבות פעמיים בשבוע.
- מעבר התאים כאשר confluency של 70 - 80% הוא הגיע.
- שוטפים את התאים עם HBSS מחומם מראש כדי להסיר תאים מתים או שאינם מחוברים. הוסף 200 μl אנזים רקומביננטי תא דיסוציאציה (1x) זה טוב ומניח בחזרה בחממה במשך 5 דקות או עד שכל התאים מנותקים.
- מעבירים את התאים לצינור 15 מ"ל ולעצור trypsinization ידי הוספת 10 מ"ל של התקשורת בתרבות (CEGM) כולל 10% עוברית עגל בסרום (FCS). צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 250 x. המשך התרבות צלחת או בקבוק מראש מצופה ג'לטין.
אפיון 2.
- לתאי אנדותל התרבות כלבים אבי העורקים (CnAOECs) ולהשוות את המורפולוגיה של שורות תאים ראשוניים מסחרי פעמיים בשבוע עם מיקרוסקופ.
הערה: Tהוא אופייני גדל דפוס של ECS בטלאים יכול להיות הכי טוב שנצפה כאשר confluency של> 70% הוא הגיע.- תרבות CnAOECs ב CECGM על ג'לטין 0.5% w / v מצופה מראש בבקבוק T75. תאי מעבר פעם בשבוע כאשר confluency הוא 70 - 80%.
- לקבלת passaging, לשטוף את התאים פעם עם HBSS מחומם מראש ולהוסיף 1 מ"ל אנזים התא דיסוציאציה רקומביננטי (1x). מניח את הבקבוק בחזרה בחממה במשך 5 דקות או עד שכל התאים מנותקים. להשבית טריפסין על ידי הוספת בינוני תרבות 10 מ"ל (CEGM) כולל 10% FCS. צנטריפוגה ההשעיה תא במשך 5 דקות ב 250 XG, וזורקים supernatant ו resuspend התאים במדיום תרבות 1 מ"ל.
- קחו aliquot 10 μl של ההשעיה תא לדלל 1: 1 עם 0.4% trypan כחול. ספירת התאים באמצעות דלפק תא אוטומטי, צלחת החוצה 4.0 x 10 5 תאי קיימא בבקבוק T75 חדש. הוסף 10 מ"ל של מחומם מראש CECGM אל הבקבוק ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO 2.
- תרבות CnAOECs ב CECGM על ג'לטין 0.5% w / v מצופה מראש בבקבוק T75. תאי מעבר פעם בשבוע כאשר confluency הוא 70 - 80%.
- לבודד RNA מפסוק 1 של CaPECs התרבותי CnAOECs.
- אסוף לפחות 1 x 10 3 תאים כמו גלולה, להוסיף 20 μl של מגיב הכנת המדגם (SPR) ו דגירה של 1 דק 'כדי lyse התאים. לאחר דגירה, בזהירות לאסוף את lysate התא המכיל RNA ולאחסן הכולל ב -70 ° C..
- המרת mRNA כדי cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA (למשל, iScript) בהתאם להוראות היצרן. cDNA חנות ב 4 ° C עד שבוע, או ב -20 ° C לטווח ארוך עד מוכן לבצע את qPCR.
- מדוד ביטוי גנים של CD31 סמן אנדותל לאשר ממוצא תא האנדותל. בצע התקנה ניסיונית וכימות באמצעות הנחיות תמצית MIQE 10. לנורמליזציה, למדוד ביטוי של גנים התייחסות GAPDH, RPS19, ו B2MG 11.
- הכן דילול של פי 10 של cDNA שהושגו מים חינם nuclease.
- להכיןדילול של פי 4 ממדגם cDNA ונקוו עבור הקו הרגיל ולהשתמש מים חינם nuclease כביקורת הלא תבנית. לדלל את הדגימות חמש פעמים להגיע דילול כולל של פי 50 לתגובות qPCR. פיפטה 10 תגובות μl בשני עותקים בפורמט 384 גם באמצעות 4 cDNA μl ו -6 μl של fluorophore מעורבב עם 20 pmol של הפוך פריימר קדימה (טבלה 1).
- הגדר את התוכנית עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עבור הפעלת פולימראז תקי, ואחריו 39 מחזורים של 10 שניות על 95 מעלות צלזיוס למשך denaturation, ו -30 שניות ב Tm עבור חישול התארכות. ה- TM עבור כל קבוצה פריימר מוצג בטבלה 1.
- לבצע המסת עקומת המנתח הבאה כל ריצה כדי להבטיח מוצר אחד בלבד מוגברת. לנרמל את רמות הביטוי של דגימות באמצעות הכמות היחסית הממוצעת של גנים התייחסות, ולחשב את ΔCt אם יעילות התגובה היא בין 95% ו -105%.
- להעריך פונקציונלי EC עם angiassay ogenesis.
- הוסף 10 μl של מטריקס היטב בכל שקופית אנגיוגנזה טרום מקורר להתפשט עם קצה פיפטה כדי לכסות את פני השטח של הבאר. שמור את תאי מטריקס על הקרח ולהימנע כניסתה של בועות אוויר לתוך הג'ל. לחזק את הג'ל על ידי הצבת את השקופית בצלחת פטרי עם מגבות נייר ספוגה מים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 30 דקות.
- להוסיף 1.0 x 10 4 עיקרי ECS ב 50 μl בינוני צמיחה האנדותל לכל טוב. דגירת השקופיות עבור 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- לאחר 6 שעות לצלם עם הגדלה 20X, והקפד לכלול הבאר כולו בתמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כלי דם שונים היו נתונים בהצלחת פרוטוקול הבידוד המתואר (תרשים 2). אפשר היה לנתח והפוך אבי העורקים, הווריד הנבוב, פורטה הנבוב, ואת העורקים הכליליים מכלבים בריאים (כל כלי מכל כלב, n = 4). עם אותה ECS הגישה בודדה שני shunts portosystemic המולד (extrahepatic ו intrahepatic, n = 1 כל אחד). למרות אבי העורקים היה הפוך בקלות, מגזרים אבי העורקים החזי היו יותר מאתגר מאשר אבי העורקים בבטן. בשנת פרקי חזה יש האאורטה רב העורקים צלעי הסתעפות ממנו, אשר צריך להיות ligated בנפרד כדי להבטיח חשיפה אנדותל בקפדנות את פתרון העיכול. המגזר הגזור של וריד נבוב הזנב כלל את נקודת ההסתעפות של ורידי הכליות, אשר צריך להיות ligated לפני ההיפוך. עבור הפורטל וריד הסניף התורם של gastroduodenalis הנבוב היה ligated לפני ההיפוך של כלי הדם. coronary עורק בכלבים הוא כלי דם קטן בהרבה (כ 1 - 2 מ"מ קוטר ב כלב בגודל בינוני), שממנו אנו נכרתנו קטע של ענף הגג. כי יש לו קוטר קטן, זה הוכיח את עצמו יותר קל להפוך קטע קצר יחסית 1 סנטימטר מפני מלקחי היתוש לא ניתן היה להוסיף עוד הרבה.
תאים דבקים בידוד פוסט יום אחד נראו הצלחת התרבות. בתרבות, היה CaPECs צורה מצולע וגילה נטייה לגדול בטלאים כפי שמוצגת באיור 3 מושבות רבות של תאי האנדותל יכולות להיבחן 3 -. 6 ימים לאחר הבידוד. לאחר כ -10 ימים בתרבות confluency של 80% הושגה ותא יכול להיות עלה. בממוצע התרבויות אנדותל הראשוניות יכולות להישמר לתקופה מקסימלית של 8 קטעים (שבועי פעם בקצב פיצול 1: 4) ובשלב זה הם הפסיקו לגדול.
Isolaתאי אנדותל טד הביע CD31 סמן תא האנדותל כפי שצוין על ידי qPCR (איור 4). הביטוי בתאי האנדותל נגזרו אב עורקים, וריד נבוב, ו פורטה הנבובה מארבעה כלבים הושווה עם תרבות שליטת CnAOECs. התאים הראשוניים בתרבית היה ביטוי CD31 להשוות עם השליטה ECS (Kruskall-ואליס, p = 0.856).
CaPECs נגזר אב עורקים, וריד נבוב ו פורטה הנבובה הראה הסתעפות לאחר דגירת hr 6 בשקופית אנגיוגנזה כפי שמוצג באיור 5.
איור 1: ביתור, לא הופך כלי דם עבור בידוד תא האנדותל. א) כלי עניין הדם מוסרים בסביבה נקיה מחיידקי מגופו של אדם אחר כלבים טרי. B) רקמה חסידה ו / או שומן סביב הכלי צריך להיות removed בזהירות עם מספרי כירורגיות מבלי לפגוע הכולים עצמו (כלבי וריד נבוב, קטע בטן של 5 סנטימטרים). ג) עם מלקחי יתוש הלסטד מעוקלים, כלי השיט ניתן להזין ללא ניקוב את שכבת האנדותל. DG) Secure המלקחיים מאידך גיסא בסופו של כלי הדם בעדינות לחזור בו, ובכך היפוך כלי הדם לחלוטין. שכבת האנדותל היא עכשיו בצד החיצוני של הספינה. H) תפרי ארנק מייתרים ממוקמים בקץ סגירת השטח הלא-אנדותל של הכלי ההפוך. ט) כלי הדם מועברים צינור 50 מיליליטר לרחצה עיכול שלאחר מכן. ברי סולם עולים 2 סנטימטר. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:.. תא מורפולוגיה התמונות צולמו שבועיים לאחר עיכול של כלי א) ECS נגזר frאב עורקים הכלביים om בסי מעבר 2.) ECS נגזרה וריד נבוב כלבי בקטע 2. C) ECS נגזרה פורטתה הנבובה כלבית בקטע 2. כל התמונות מצולמים עם הגדלה מקורית 4X. ברי סולם עולים 500 מיקרומטר. הכנס מציג בהגדלה 10X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: Gene Expression של CD31. ביטוי של CD31 בתאי האנדותל בקטע 1 נגזרו אב עורקים, וריד נבוב, ו פורטה הנבובה (n = 4 כלבים). לא נמצא הבדל ביטוי משמעותי נצפה בין CaPECs ואת CnAOECs. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונות אנגיוגנזה של CnAOECs ו CaPECs מן האאורטה, וריד נבוב ו פורטה הנבובה לאחר דגירת hr 6 על שקופית אנגיוגנזה (בהגדלת 20X): איור 5.. היווצרות סניף גלויה לאחר 6 שעות בתרבות. א) CnAOECs. B) CaPECs נגזר אב עורקים. C) CaPECs נגזר וריד נבוב. D) CaPECs נגזרו פורטתה הנבובה. כל התאים היו בקטע 3. ברי סולם עולים 1 מ"מ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| ממשלת ישראל | כיוון | 5'-רצף-3 " | חישול tm | גודל מוצר (נ"ב) | מספר Genebank | |
| CD31 | קָדִימָה | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59 ° C | 85 | XM_005624261.1 | |
| לַהֲפוֹך | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| ביתא תקטין | קָדִימָה | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58 ° C | 384 | NM_001195845 | |
| לַהֲפוֹך | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | קָדִימָה | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63 ° C | 95 | XM_005616513 | |
| לַהֲפוֹך | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | קָדִימָה | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63 ° C | 85 | AB745507 | |
| לַהֲפוֹך | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
טבלה 1: qPCR פריימר סטים פריימרים qPCR עבור גנים התייחסות כלבים ו CD31..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקרי ההתמקדות כלבית ECS הקו העיקרי CnAOEC משמש מודל השושלות האנדותל של הכלב 3, 12, 13. במחקרים בבני אדם, תרבות HUVEC עדיין נחשבה תקן הזהב. ברור, התמקדות רק על ECS נגזרה חבל טבור היא הגבלת משרד במחקר לב וכלי דם. יש לתאי אנדותל דפוס ביטוי גנים ספציפיים קביעת מפרט arteriovenous. על מנת להסביר את ההבדלים הללו בכלי לאחר לידה אנו מציגים שיטת בידוד הרומן הזה מבוסס על המיקום האנטומי הספציפי של תאי אנדותל. השיטות הנפוצות לבידוד EC העיקרי הן שטיפת הספינה עם פתרון אנזים או וקוצצות את הכלי לפני העיכול, שתי שיטות כי יש גם סיכון של זיהום עם הלא-ECS. הקמנו טכניקה עבור הבידוד של בתאי האנדותל ראשי לכלבים (CaPECs) עם סיכוי קטן יותר של זיהום שיכול לשמש גם על כלי דם קטנים. מ בידוד זהethod של תאי אנדותל מבוסס על ההיפוך של כלי השיט, אשר ימנע עיכול של כל סוגי תאי כלי האחרים. חשוב להסיר את כלי בסביבה נקייה מחיידקים, כפי שמודגם באיור 1 א ', על מנת למנוע זיהום חיידקי או פטרייתי של תרבויות האנדותל. במקרה של התפתחות חיידקי סוכן מיקרוביאלית נוסף (למשל, gentamycin) ניתן להוסיף עד בינוני התרבות. במקרה של טיפול זיהום פטרייתי הוא לעתים קרובות לא מוצלח מניסיוננו.
על מנת ההיפוך להצליח, חשוב לקבל כלי כי הוא כ 5 ס"מ אורך. צעד חשוב נוסף כדי להקל על היפוך של כלי הדם הוא הסר של כל רקמת חסיד ושומן עם מספרי כירורגיות. היפוך הכלי נעשה בקפידה על ידי כיווץ המלקחיים בקצה השני ולאט לאט היפוך הכלי. כאשר נחת תפרים-מחרוזת הארנק לוודא לגעת שכבת האנדותל כמה שפחות. DamaGE של האנדותל יכול לגרום יבול דל של תאי אנדותל קיימא וגישה של תקשורת העיכול אל רקמה בסיסית. זה יכול לקרות גם אם הספינה לא סגורה לגמרי. הספינה ניתן לטפל בקלות על ידי מרים אותו בסוף ליגטורה.
במקרים ספציפיים מודיפיקציה של הטכניקה יכול להיות מיושם. בכלי דם בקוטר קטן זה לפעמים אפשר להשחיל מלקחי יתוש כדי להפוך את הספינה. פתרון הוא להציב תפרים להישאר על קצה אחד של הכלי ולדחוף ליגטורה שלהם דרך כלי הדם באמצעות המלקחיים. בקצה השני אז הם יכולים להיות מאובטחים עם מלקחי יתוש ומשך, ובכך היפוך הכלי. לפעמים הכלי ייקרע כתוצאת התפרים הנוספים, כך שינוי זה אינו הגישה המועדפת. בעיה נוספת שיכולה להתעורר היא כאשר אריתרוציטים רבים נמצאים צלחות תרבות על זריעה של תאים ראשוניים. זה יכול להיות תוצאה שלכביסה לא מספקת של כלי הדם לפני העיכול. כאשר זה קורה, שטיפת הבארות ביום 2 עם HBSS החם היא לעתים קרובות מספיק כדי להסיר את רוב אריתרוציטים. בכל מקרה, אריתרוציטים לא יימשכו בתרבות אובדת על passaging של CaPECs.
CaPECs המבודד הביע CD31, המציין כי אוכלוסיית התא היה מתעכלת מספינת הדם היא אכן ממוצא האנדותל. כפי שפורסם לאחרונה, סמן זה בא לידי הביטוי גם בתאי האנדותל מן השסתום הכלבי צניפי 14. ההיווצרות של מושבות בתרבות מציינת התרבויות להפעיל אותו באחת משני תאים בודדים או מאשכולות תאים קטנים. צמיחה מהירה על מדיה ספציפית האנדותל היא גם מעידה על סוג תא נכון. התאים הראשוניים יכולים להיות מתורבתים במשך שמונה קטעים, שלאחריו התרבויות להפסיק הרחבה. זוהי אינדיקציה של ההזדקנות אתה מקטין את הסיכוי שתאי גזע / ובתאים הם מתורבתים עם פרוטו זהcol. במאמר assay אנגיוגנזה, CaPECs מן האאורטה, וריד נבוב ו פורטה הנבובה הראה הסתעפות בתוך 6 שעות. פונקציונלי אנדותל זה מספק עדות מוצקה עבור מוצאם.
על בסיס מקום פנוי חומר כלבי רק נחקר, אך שיטת הבידוד יש יישומים אפשריים לבידוד תרמי של תאי אנדותל העיקריים אדם או תאי אנדותל מאורגניזמים אחרים. הטכניקה היא גם אפשרי עבור כלי קטן מאוד (1 ס"מ אורך), אך תניב פחות תאים מבודדים. מסיבה זו CaPECs המתקבל כלי קטן תדרוש מעבר נוסף לפני שהם הגיעו מספר מספיק לניסויים.
היכולת לבצע את שיטת הבידוד על כלי קטן היא יתרון גדול ללימודי מחלת כלי דם. ECS ניתן יהיה לבודד כלי חולה או סוטה כמו shunts portosystemic. אלה הם כולים מחבר את וריד שער ואת המחזור המערכתי אשר גורם לדם לעקוף את הכבד 2 15, 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
