Introduction
Hunde sind als Großtiermodell für kardiovaskuläre Erkrankungen Forschung und auch von angeborener (genetischen) Gefäßanomalien 1, 2 leiden können. Um diese Krankheiten kommerziellen Endothelzelllinien studieren häufig verwendet werden , um Endothelzellen (EC) Funktionalität beurteilen. Für Hunde gibt es eine kommerzielle Endothelzelllinie verfügbar (CnAOEC), von Eckzahn Aorta abgeleitet. Diese Zelllinie ist vor allem in Studien als Kontrolle normalen ECs 3-5 verwendet. In der menschlichen kardiovaskulären Forschung sind die am häufigsten verwendeten Endothelzelllinien menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) und menschlichen Nabelschnurarterie Endothelial Cells (HUAECs) aus menschlicher Nabelschnur Vene und Arterie abgeleitet sind. HUVECs wurden als Goldstandard in der Gefäßforschung seit den 1980er Jahren 6 verwendet. Sie gelten als das klassische Modellsystem zum Studium der Endothelfunktion und Krankheit Anpassung sein. Endothelial-Zellen isoliert aus verschiedenen Blutgefäße variieren in appearance und Funktionalität durch genetische Hintergrund und der Exposition gegenüber der Mikroumgebung 7. Zusätzlich werden HUVECs und HUAECs aus Nabelschnur abgeleitet sind, eine Entwicklungsgefäßstruktur, die an die Bedingungen in Bezug erwachsenen Blutgefäße möglicherweise nicht vollständig mimic sie und die Reaktion auf Krankheit ausgesetzt sind. Daher ist unzureichend in HUVECs und HUAECs zu kardiovaskulären Erkrankungen im Allgemeinen gefunden Ergebnisse zu übersetzen.
Wenn die Anpassung und das Verhalten von Erwachsenen ECs studieren, primären ECs aus dem Gefäß von Interesse sollte als direkter Ansatz verwendet werden. Zur Isolierung haben diese Zellen zeigen verschiedene Methoden berichtet. Eine weit beschriebene Verfahren, die auch für HUVECs verwendet wird, wird das Spülen des Behälters mit einem enzymatischen Verdauungslösung 8. Dies führt oft zu einer Kontamination mit nicht-ECs wie glatte Muskelzellen und Fibroblasten 9. Ein anderes häufig verwendetes Verfahren zur Isolierung ist die enzymatische Verdauung von gehackten Gefäßgewebe, gefolgt von Fluoreszenz-aktivierte Zelle (FACS) , basierend auf endothelialen Zellmarker Cluster of Differentiation (CD) 31 7, 8. FACS - Sortierung und anschließender Zellkultur Sortieranlage erfordert relativ große Mengen an Zellen und ist daher nicht geeignet für die Isolierung von Endothel von kleinen Blutgefäßen. Wir haben daher ein neues robustes Verfahren zu entwickeln, zur Isolierung eines reinen endothelialen Zellpopulation aus verschiedenen Hunde- Blutgefäße mit hoher Reinheit gerichtet. Um die Effizienz des neuen Isolationsmethode testen, haben wir isoliert und rein erhalten Canine Primary Endothelzell (CAPEC) Kulturen aus verschiedenen Hunde-Arterien und Venen, große und kleine. Dieses Verfahren ermöglicht auch die Kultur von Endothelzellen aus erkrankten Ursprung und / oder abweichende Gefäße wie angeborene intra- oder extrahepatischen portosystemischen Shunts, eine häufige Erkrankung bei Hunden 2. Das Verfahren erlaubt die Isolierung von zusätzlichen relevanten Zelltypen des gleichen Gefäß wie vaskulären glatten Muskelzellen, da die meisten des Schiffes int bleibtWährend des Verfahrens handeln.
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Protocol
Ethik-Erklärung: Die Blutgefäße in dieser Studie verwendet wurden, als überschüssige Material geerntet wurden aus frischen Hunde-Kadaver (n = 4) von gesunden Hunden für andere, unabhängige Forschung (Universität 3R Politik) euthanasiert. Aberrant Blutgefäße (intra- und extrahepatischen portosystemischen Shunts, n = je 1) vorgestellt wurden für Haustiere der Universität Utrecht an der Universitätsklinik von Hunden post-mortem nach informierte Zustimmung der Eigentümer geerntet.
1. Isolierung und Kultur von primären Canine Endothelial Cells
- Precoat-6-well - Platten mit 2 ml / Vertiefung 0,5% w / v Gelatine und mit einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C für 2 h in einem Brutschrank belassen. Entfernen Lösung überschüssige Gelatine vor der primären Zellen Aussaat.
- Aseptisch entfernen Sie das Blutgefäß (e) von Interesse (zB Aorta, Hohlvene, Vena porta) von einem frischen Eckzahn kadaver (Abbildung 1A). Aufrechterhaltung der Anatomie des Gefäßsystemsindem gerade Zange an beiden Enden des Schiffes von Interesse. Unnötige Manipulation des Gewebes mit einer Pinzette Schädigung der Endothelzellen zu verhindern.
- Schneiden Sie das geklemmt Gefäß an beiden Enden mit chirurgischen Scheren und vom kadaver entfernen. Transport in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) auf Eis.
HINWEIS: Eine Schiffslänge von ca. 5 cm Für dieses Verfahren wird bevorzugt, aber diejenigen, die 1 cm messen auch genügend Zellen zur Kultur bieten.
- Schneiden Sie das geklemmt Gefäß an beiden Enden mit chirurgischen Scheren und vom kadaver entfernen. Transport in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) auf Eis.
- Übertragen Sie das Blutgefäß in eine Petrischale gefüllt mit eiskaltem HBSS. Mit chirurgische Scheren, entfernen Sie alle anhaftendem Gewebe und Fett von der Außenseite des Gefäßes, halten das Gefäß selbst intakt (1B). Stellen Sie sicher, dass das Schiff jederzeit deutlich sichtbar ist beim Schneiden: beiseite ziehen das umgebende Gewebe mit einer Klammer oder einer Zange für optimale Sicht.
- Schließen Sie alle Zweige des Schiffes mit Ligatur (zB Polyglactin 3-0) und sie anschließend zu entfernenmit chirurgischen Schere oder einem Skalpell.
- Ein Gefäßende mit einem gekrümmten Halsted Moskito Zange, klemmen die Spitze der Zange an dem anderen Ende des Behälters sorgfältig eingeben und dann zurückziehen, langsam das Gefäß Invertieren bis er vollständig von innen nach außen (1C-G) ist. Die Außenseite besteht nun aus der endothelialen Zellschicht. Wenn sich eine Schwierigkeit beim Umdrehen des Behälters angetroffen wird, wieder in HBSS versenken Reibung zu reduzieren.
- Platzieren Sie Tabaksbeutelnähte an beiden Enden des Schiffes es vollständig zu schließen und die Exposition von Nicht-endothelialen Gefäßgewebe zu dem Aufschlussverfahren (Abbildung 1H) zu verhindern. Verwenden Sie die Ligatur Enden des invertierten Gefäß zu manipulieren.
- Wenn die Verdauung und Kultur später durchgeführt wird, das invertierte Kryokonservierung Gefäß vor dem Verdau Protokoll (Schritt 1.7).
- Legen Sie das invertierte Schiff in einem Kryoröhrchen und füllen mit Zellkultur Einfriermedium. Einfrieren bis -80 ° C, um ein Einfrieren Co mitntainer. Bei -80 ° C, wenn Schiffe sind innerhalb einer Woche verwendet werden. Für die langfristige Lagerung Ort Kryovials bei -180 ° C. Wenn die EG-Isolierung durchgeführt wird, tauen die Kryovials schnell in einem Wasserbad (37 ° C) und sofort in eiskaltem HBSS platzieren. Gehen Sie wie in 1.7 angegeben.
Hinweis: Beachten Sie, dass die Gesamtausbeute von ECs nach der Isolierung geringer sein wird durch den Verlust der Lebensfähigkeit während des Gefrierprozesses.
- Legen Sie das invertierte Schiff in einem Kryoröhrchen und füllen mit Zellkultur Einfriermedium. Einfrieren bis -80 ° C, um ein Einfrieren Co mitntainer. Bei -80 ° C, wenn Schiffe sind innerhalb einer Woche verwendet werden. Für die langfristige Lagerung Ort Kryovials bei -180 ° C. Wenn die EG-Isolierung durchgeführt wird, tauen die Kryovials schnell in einem Wasserbad (37 ° C) und sofort in eiskaltem HBSS platzieren. Gehen Sie wie in 1.7 angegeben.
- Übertragen Sie das Gefäß in ein 50 - ml - Röhrchen und spülen Sie es zweimal in HBSS Erythrozyten (oder Rest Einfriermedium bei Auftauen) (1I) zu entfernen.
- Digest das Gefäß in einer 50-ml-Röhrchen mit einer Lösung von 30 ml Kollagenase Typ II (0,15 U / ml) und Dispase (0,15 U / ml) in Canine Endothelial Cells Growth Medium (CECGM) für 1 h bei 37 ° C mit intermittierender sanften Agitation.
- Entfernen des Behälters aus dem Rohr und zentrifugieren die Zellsuspension für 5 min bei 250 x g.
- Zellpellet in CECGM einnd Samen 2 ml Zellsuspension pro Well (1 - 3 Brunnen je nach Gefäßgröße). Kultur der Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 in Luft und das Kulturmedium zweimal pro Woche ändern.
- Passage der Zellen, wenn eine Konfluenz von 70-80% erreicht ist.
- Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem HBSS tot oder nicht-anhaftenden Zellen zu entfernen. In 200 ul rekombinanter Zell-Dissoziation Enzym (1x) in jede Vertiefung und legen zurück in den Inkubator für 5 Minuten oder bis alle Zellen abgelöst werden.
- Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube und stoppen Trypsinierung durch Zugabe von 10 ml Kulturmedien (CEGM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS). Zentrifuge für 5 Minuten bei 250 x g. Weiter wird die Kultur im Gelatine vorbeschichtet Platte oder Kolben.
2. Charakterisierung
- Kultur Canine Aortic Endothelial Cells (CnAOECs) und die Morphologie der primären und kommerziellen Zelllinien zweimal wöchentlich mit einem Mikroskop vergleichen.
HINWEIS: Ter wächst typisches Muster von ECs in Patches lassen sich am besten beobachtet werden, wenn eine Konfluenz von> 70% erreicht ist.- Kultur CnAOECs in CECGM auf einem 0,5% w / v Gelatine vorbeschichtet T75-Kolben. Passage-Zellen einmal in der Woche, wenn die Konfluenz 70 - 80%.
- Für Passagierung, waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmter HBSS und 1 ml rekombinanten Zell-Dissoziation Enzym (1x). Der Kolben wird wieder in den Inkubator für 5 Minuten oder bis alle Zellen abgelöst werden. Inactivate Trypsin von 10 ml Kulturmedium Zugabe (CEGM) mit 10% FCS. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 Minuten bei 250 · g, den Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml Kulturmedium.
- Nehmen Sie ein 10-ul-Aliquot der Zellsuspension und verdünnt 1: 1 mit 0,4% Trypanblau. Zählen Sie die Zellen eines automatisierten Zellzähler verwenden, und die Platte aus 4,0 x 10 5 lebensfähigen Zellen in einem neuen T75 - Flasche. 10 ml vorgewärmtes CECGM in den Kolben und die Kultur bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2.
- Kultur CnAOECs in CECGM auf einem 0,5% w / v Gelatine vorbeschichtet T75-Kolben. Passage-Zellen einmal in der Woche, wenn die Konfluenz 70 - 80%.
- Isolieren von RNA aus Durchgang 1 der kultivierten CaPECs und CnAOECs.
- Sammeln Sie mindestens 1 x 10 3 Zellen als Pellet, fügen Sie 20 ul der Probenvorbereitung Reagenz (SPR) und Inkubation für 1 min die Zellen zu lysieren. Nach der Inkubation sorgfältig sammeln Zelllysat Gesamt-RNA und lagern bei -70 ° C enthält.
- Konvertieren von mRNA in cDNA eine cDNA - Synthese - Kit (zB iScript) nach den Anweisungen des Herstellers. Shop cDNA bei 4 ° C bis zu einer Woche oder bei -20 ° C für langfristige, bis bereit, die qPCR auszuführen.
- Messen Sie die Genexpression der endothelialen Marker CD31 Endothel-Zell-Ursprung zu bestätigen. Führen Versuchsaufbau und die Quantifizierung mit Hilfe der MIQE précis Richtlinien 10. Zur Normalisierung, messen die Expression von Referenzgenen GAPDH, RPS19 und B2MG 11.
- Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnung der erhaltenen cDNA in nukleasefreiem Wasser.
- Bereiteneine 4-fache Verdünnung von gepoolten cDNA-Proben für die Standard-Linie und nukleasefreiem Wasser als Nicht-Template-Steuerung verwenden. Verdünnen Sie die Proben fünfmal einen 50-fachen Gesamtverdünnung für qPCR Reaktionen zu erreichen. Pipette 10 ul - Reaktionen in doppelter Ausfertigung in einer 384-Well - Format unter Verwendung von 4 & mgr; l cDNA und 6 & mgr; l des Fluorophors mit 20 pmol reverser gemischt und Vorwärts - Primer (Tabelle 1).
- Stellen Sie das Programm auf 95 ° C für 5 min für Taq-Polymerase-Aktivierung, gefolgt von 39 Zyklen von 10 sec bei 95 ° C für die Denaturierung und 30 sec bei Tm zum Glühen und Dehnung. Die Tm für jeden Primersatz ist in Tabelle 1 gezeigt.
- Perform Kurve Schmelzen analysiert jede Lauf folgende nur ein Produkt, um sicherzustellen, wird verstärkt. Normalisieren der Expressionsniveaus der Proben die durchschnittliche relative Menge der Referenzgene verwenden, und berechnen die ACt wenn Reaktionswirkungsgrad zwischen 95% und 105% liegt.
- Beurteilen Sie EC-Funktionalität mit einem angiogenesis Test.
- Zugabe von 10 & mgr; l der extrazellulären Matrix zu jeder Vertiefung einer vorgekühlten Angiogenese Dia- und verteilt mit einer Pipettenspitze die Oberfläche der Vertiefung zu bedecken. Halten Sie die extrazelluläre Matrix auf Eis und vermeiden, dass die Einführung von Luftblasen in das Gel. In einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 30 min erstarren das Gel durch den Schieber in eine Petrischale mit Wasser getränkten Papiertüchern platzieren.
- In 1,0 x 10 4 primäre ECs in 50 ul Endothelial Growth Medium pro Vertiefung. Inkubieren der Objektträger 6 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Nach 6 Stunden Fotos mit einer 20-facher Vergrößerung nehmen, um sicherzustellen, das Ganze gut in das Bild aufzunehmen.
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Representative Results
Verschiedene Blutgefäße wurden erfolgreich auf das beschriebene Isolierungsprotokoll (Figur 2) unterzogen. Es war möglich, zu sezieren und Aorta, Hohlvene, Vena porta invertieren und Koronararterie von gesunden Hunden (alle Gefäße von jedem Hund, n = 4). Mit dem gleichen Ansatz ECs wurden aus zwei angeborenen portosystemischen Shunts (extrahepatische und intrahepatische, n = je 1) isoliert. Obwohl Aorta leicht invertiert wurde, waren thorakalen Aorta Segmente eine größere Herausforderung als Bauchaorta. In thorakalen Segmente hat die Aorta viele Intercostalarterien davon abzweig, die einzeln ligiert werden müssen streng endothelial Einwirkung der Verdauungslösung zu gewährleisten. Die sezierten Segment der Vena cava caudalis enthalten Verzweigungspunkt der Nierenvenen, die vor der Inversion ligiert werden musste. Für das Portal den Beitrag Zweig der Vena gastroduodenalis Vene wurde vor dem Umdrehen des Blutgefäßes ligiert. Die coronary Arterie bei Hunden ist ein viel kleineres Blutgefäß (ca. 1 bis 2 mm Durchmesser in einem mittelgroßen Hund), von dem wir ein Segment des circumflexus ausgeschnitten. Weil es einen kleinen Durchmesser hat, erwies es einfacher sein, ein ziemlich kurzes Segment von 1 cm zu invertieren, da die Mosquito Zange nicht viel weiter eingesetzt werden konnte.
Eines Tages nach der Isolierung haften Zellen sichtbar waren in der Kulturplatte. In Kultur hatte CaPECs eine polygonale Form und zeigte eine Tendenz in Patches zu wachsen , wie in Figur 3 gezeigt zahlreiche Kolonien von Endothelzellen 3 beobachtet werden konnte -. 6 Tage nach der Isolierung. Nach ungefähr 10 Tagen in Kultur wurde eine Konfluenz von 80% erreicht, und die Zellen übertroffen werden konnten. Im Durchschnitt konnten die primären endothelialen Kulturen für maximal 8 Passagen (einmal wöchentlich an einem Split-Rate von 1: 4) gehalten werden, an welcher Stelle sie aufgehört zu wachsen.
Isolated Endothelzellen CD31 endotheliale Zellmarker exprimiert , wie durch qPCR (Figur 4) angedeutet ist . Die Expression in Endothelzellen aus der Aorta abgeleitet, Hohlvene und Pfortader von vier Hunden wurde mit einer Kontrollkultur von CnAOECs verglichen. Die kultivierten primären Zellen hatten eine vergleichbare CD31 Expression mit der Steuer ECs (Kruskall-Wallis, p = 0,856).
CaPECs aus Aorta abgeleitet, Vena cava und vena porta zeigte auf der Angiogenese Folie , nach 6 Stunden Inkubation Verzweigungs wie in Figur 5 gezeigt.
Abbildung 1: Zergliedern und Invertierung Blutgefäße für Endothelial Zellisolierung. A) Das Blutgefäß von Interesse ist aseptisch aus einem frischen Hunde-kadaver entfernt. B) anhaftendem Gewebe und / oder Fett , das Schiff umgebenden sollte remov seined sorgfältig mit chirurgische Scheren , ohne sich das Schiff zu beschädigen (Eckzahn Hohlvene, Abdominalsegment von 5 cm). C) mit einer Halsted Mosquito gebogenen Pinzette kann der Behälter ohne Perforieren der Endothel - Schicht eingegeben werden. DG) auf der anderen Seite der Zange Sichern Ende des Blutgefäßes und sanft zurückzuziehen, um dadurch vollständig das Blutgefäß zu invertieren. Die Endothelschicht ist nun auf der Außenseite des Behälters. H) Tabaksbeutelnähte an den Enden der nicht-endotheliale Oberfläche des umgekehrten Behälters. I) das Blutgefäß für das Waschen in ein 50 ml Röhrchen überführt wird Verschließen platziert und anschließende Verdauung. Maßstabsbalken zeigen 2 cm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:.. Zellmorphologie Bilder aufgenommen wurden zwei Wochen nach der Verdauung der Gefäße A) ECs abgeleitet from Eckzahn Aorta in Durchgang 2 B) ECs abgeleitet von Hunde- Hohlvene in Durchgang 2. C) ECs abgeleitet von Eckzahn Pfortader in Durchgang 2. Alle Bilder sind mit 4X Original Vergrößerung. Maßstabsbalken zeigen an 500 & mgr; m. Legen Sie zeigt 10 - facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Gene Expression von CD31. Die Expression von CD31 in Endothelzellen in Passage 1 von Aorta abgeleitet, Hohlvene und Pfortader (n = 4 Hunde). Keine signifikanten Expressionsunterschiede wurden zwischen dem CaPECs und der CnAOECs beobachtet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Angiogenesis Fotografien von CnAOECs und CaPECs aus Aorta, Hohlvene und Pfortader nach 6 h Inkubation auf einem Angiogenese Schieber (20 - facher Vergrößerung). Zweigbildung sichtbar nach 6 Stunden in der Kultur. A) CnAOECs. B) CaPECs abgeleitet von Aorta. C) CaPECs abgeleitet aus Hohlvene. D) CaPECs aus Pfortader abgeleitet. Alle Zellen wurden in der Passage 3. Maßstabsbalken zeigen 1 mm. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| GOI | Richtung | 5'-Sequence-3 ' | Tm Glühen | Produktgröße (bp) | Genbank - Nummer | |
| CD31 | Vorwärts | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59 ° C | 85 | XM_005624261.1 | |
| Umkehren | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| beta-Actin | Vorwärts | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58 ° C | 384 | NM_001195845 | |
| Umkehren | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | Vorwärts | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63 ° C | 95 | XM_005616513 | |
| Umkehren | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | Vorwärts | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63 ° C | 85 | AB745507 | |
| Umkehren | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
Tabelle 1: qPCR Primer - Sets qPCR Primer für Hunde Referenzgenen und CD31..
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Discussion
In Studien über Hunde-ECs Fokussierung der CnAOEC primäre Linie , die die endotheliale Abstammungslinien des Hundes 3, 12, Modell 13. In Studien am Menschen wird die HUVEC Kultur immer noch der Goldstandard. Offensichtlich aus Nabelschnur abgeleitet Fokussierung nur auf ECs ist eine feste Beschränkung in der kardiovaskulären Forschung. Endothelial-Zellen haben einen spezifischen Genexpressionsmuster arteriovenöse Spezifikation zu bestimmen. Um diese Unterschiede in der postnatalen Schiffe zu berücksichtigen, stellen wir diese Methode neuartige Isolierung auf der Basis der spezifischen anatomischen Lage der Endothelzellen. Die Verfahren, die üblicherweise für die primäre EC-Isolierung verwendet werden Spülen der Behälter mit einer Enzymlösung oder Zerkleinern des Schiffes vor der Verdauung, zwei Methoden, die sowohl das Risiko einer Kontamination mit nicht-ECs haben. Wir haben ein Verfahren zur Isolierung von Canine Primäre Endothelzellen (CaPECs) mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit einer Kontamination, die auch auf kleinen Gefäßen verwendet werden kann. Diese Isolation methode von Endothelzellen auf die Invertierung des Schiffes zugrunde, die Zelltypen Verdauung aller anderen Behälter vermeidet. Es ist wichtig , die Behälter aseptisch zu entfernen, wie in Figur 1A dargestellt ist , Bakterien- oder Pilzkontamination der endothelialen Kulturen zu verhindern. Im Falle von Bakterienwachstum ein zusätzliches antimikrobielles Mittel (zB Gentamycin) dem Kulturmedium zugegeben werden. Im Falle der Behandlung von Pilzinfektion ist häufig nicht erfolgreich in unserer Erfahrung.
Damit die Inversion erfolgreich zu sein, ist es wichtig, einen Behälter zu erhalten, die etwa 5 cm lang ist. Ein zweiter wichtiger Schritt Invertierung des Blutgefäßes zu erleichtern, ist die Entfernung von anhaftendem Gewebe und Fett mit chirurgischen Schere. das Gefäß invertierende wird sorgfältig durchgeführt, indem die Zange am gegenüberliegenden Ende Spann- und langsam das Gefäß umgekehrt wird. Wenn die Tabaksbeutel platzieren Nähte stellen Sie sicher, die endotheliale Schicht so wenig wie möglich zu berühren. Damage des Endothels kann in schlechten Ausbeute von lebenden Endothelzellen und den Zugang der Verdauung Medien zu darunter liegenden Gewebes zur Folge haben. Dies kann auch passieren, wenn der Behälter nicht vollständig geschlossen ist. Der Behälter kann leicht durch es Kommissionierung am Ende einer Ligatur up gehandhabt werden.
In bestimmten Fällen kann eine Modifikation der Technik angewendet werden. In Blutgefäßen mit einem kleinen Durchmesser ist es manchmal unmöglich, eine Mosquito Zange einzulegen, um das Schiff zu invertieren. Eine Lösung ist Nähte an einem Ende des Behälters zu legen und deren Ligaturen durch das Blutgefäß schieben die Zange verwendet wird. Am anderen Ende können sie dann mit einem Moskito Zange und zog gesichert werden, wodurch das Gefäß umgekehrt wird. Manchmal wird der Behälter reißen als Folge der zusätzlichen Nähte, so Diese Modifikation ist nicht der bevorzugte Ansatz. Ein weiteres Problem, das auftreten kann, ist, wenn viele Erythrozyten in den Kulturplatten beim Aussäen der primären Zellen vorhanden sind. Dies kann das Ergebnis vonunzureichendes Waschen des Blutgefäßes vor der Verdauung. Wenn dies auftritt, am Tag 2 mit warmem HBSS Waschen der Vertiefungen ist oft ausreichend, um den Großteil der Erythrozyten zu entfernen. In jedem Fall bleiben die Erythrozyten nicht in der Kultur und zeichnen sich bei Passagierung der CaPECs verloren.
Die isolierten CaPECs ausgedrückt CD31, was darauf hinweist, dass die Population von Zellen, die aus dem Blutgefäß ist in der Tat endothelialen Ursprungs verdaut wurde. Wie kürzlich veröffentlicht, wird diese Markierung auch in Endothelzellen aus der canine Mitralklappe 14 ausgedrückt. Die Bildung von Kolonien in Kultur zeigt die Kulturen entweder aus einzelnen Zellen oder von kleinen Zellhaufen zu starten. Das schnelle Wachstum auf die endotheliale spezifischen Medien ist auch ein Hinweis auf korrekte Zelltyp. Die primären Zellen können für acht Passagen kultiviert werden, wonach die Kulturen Ausdehnung einzustellen. Dies ist ein Hinweis auf die Seneszenz und macht es weniger wahrscheinlich, dass Stammzellen / Vorläuferzellen mit diesem proto kultiviertcol. In einem Angiogenese-Assay, CaPECs von Aorta, Hohlvene und Pfortader zeigte innerhalb von 6 Stunden Verzweigung. Diese endotheliale Funktionalität bietet solide Beweise für ihre Herkunft.
Je nach Verfügbarkeit wurde nur Hunde Material untersucht, aber die Isolationsmethode hat mögliche Anwendungen für die Isolierung von primären humanen Endothelzellen oder Endothelzellen aus anderen Organismen. Die Technik ist auch möglich, sehr kleine Gefäße (1 cm Länge), aber nachgeben weniger isolierten Zellen. Aus diesem Grund von kleinen Gefäßen erhalten CaPECs wird eine zusätzliche Passage erfordern, bevor sie über eine ausreichende Zahl für Experimente erreicht haben.
Die Fähigkeit, die Isolationsmethode auf kleinen Schiffen durchzuführen ist ein großer Vorteil für Studien in Gefäßerkrankungen. ECs konnte von erkrankten oder anomalen Gefäße wie portosystemischen Shunts isoliert werden. Das sind Schiffe , die die Pfortader verbindet und den systemischen Kreislauf , das Blut , die Leber zu umgehen verursacht 2 15, 16.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
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