Introduction
Hundar används som stora djurmodell för kardiovaskulär forskning sjukdom och kan också drabbas av medfödda (genetiska) kärlmissbildningar 1, 2. För att studera dessa sjukdomar kommersiella endotelceller cellinjer ofta används för att bedöma endotelceller (EG) funktionalitet. För hundar finns en kommersiell endotelceller linje finns (CnAOEC), som härrör från hund aorta. Denna cellinje används oftast i studier som kontroll normal EC 3-5. I human kardiovaskulär forskning de vanligaste endotelceller cellinjer är Human navelvenendotelceller (HUVEC) och humana navelartär endotelceller (HUAECs) härrörande från human navelsträng ven och artär, respektive. HUVEC har använts som den gyllene standarden i vaskulär forskning sedan 1980-talet 6. De anses vara det klassiska modellsystem för att studera endotelfunktion och sjukdom anpassning. Endotelceller som isolerats från olika blodkärl varierar i appearance och funktionalitet på grund av genetisk bakgrund och exponering för mikro 7. Dessutom, HUVEC och HUAECs härrör från navelsträngen, en utvecklings vaskulär struktur som kanske inte helt härma vuxna blodkärl med avseende på de villkor som de utsätts för och svar på sjukdom. Därför översätta träffar i HUVEC och HUAECs till hjärt-kärlsjukdom i allmänhet är otillräcklig.
När man studerar anpassning och beteende vuxen EC, bör primära EC från kärlet av intresse användas som ett mer direkt tillvägagångssätt. Att isolera dessa celler, har flera metoder rapporterats. En allmänt beskrivna metoden, som också används för HUVEC-celler, är spolning av kärlet med en enzymatisk digestion lösning 8. Detta resulterar ofta i kontaminering med icke-EC såsom glatta muskelceller och fibroblaster 9. En annan ofta använd metod för isolering är enzymatisk nedbrytning av malet fartyg vävnad följt av fluorescence-aktiverad cellsortering (FACS) baserat på endotelial cellmarkör Kluster av Differentiation (CD) 31 7, 8. FACS sortering och efterföljande cellodling kräver relativt stora mängder av celler och är därför inte lämplig för isolering av endotel från små blodkärl. Vi har därför inriktat på att utveckla en ny robust metod för att isolera en ren endotelceller befolkningen från olika hund blodkärl med hög renhet. För att testa effektiviteten hos den nya isoleringsmetoden, vi isolerat och fått rena Canine Primary Endothelial Cell (CaPEC) kulturer från olika hund artärer och vener, både stora och små. Denna metod möjliggör också kultur av endotelceller som härrör från sjuka och / eller avvikande fartyg såsom medfödda inträ- eller extra-lever portosystemic shuntar, en vanlig sjukdom hos hundar 2. Metoden gör det möjligt isolering av ytterligare relevanta celltyper av samma fartyg såsom vaskulära glatta muskelceller eftersom de flesta av fartyget förblir intagera under förfarandet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Blodkärl användes i denna studie skördades som överskottsmaterial som erhållits från färska hund kadaver (n = 4) från friska hundar avlivades för andra orelaterade forskning (University 3R politik). Avvikande blodkärlen (intra- och extrahepatiska portosystemic shuntar, n = 1 vardera) skördades efter slakt efter informerat samtycke av ägarna från hundar som presenteras till universitetskliniken för sällskapsdjur i Utrecht University.
1. Isolering och odling av primär Canine endotelceller
- Pre-coat 6-brunnars plattor med 2 ml / brunn 0,5% vikt / volym gelatin och låt stå i 2 h i en inkubator med en fuktad atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C. Ta bort överflödigt gelatin lösning före sådd de primära cellerna.
- Aseptiskt avlägsna blodkärlet (er) av intresse (t.ex., aorta, hålven, vena porta) från en frisk hund kadaver (Figur 1A). Upprätthålla anatomin av kärlet systemetgenom att placera raka pincett i båda ändarna av fartyget av intresse. Undvika onödig manipulation av vävnaden med pincett för att förhindra skador på endotelceller.
- Skär klämmas fartyg på båda ändarna med kirurgisk sax och ta bort från kadaver. Transport i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) på is.
OBS: Ett fartyg längd av ungefär 5 cm föredras för detta förfarande, men de som mäter 1 cm kommer också att ge tillräckligt med celler till kultur.
- Skär klämmas fartyg på båda ändarna med kirurgisk sax och ta bort från kadaver. Transport i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) på is.
- Överföra blodkärlet till en petriskål fylld med iskall HBSS. Användning av kirurgiska saxar, ta bort från angränsande vävnad och fett från utsidan av kärlet, att hålla själva fartyget intakt (Figur 1B). Se till att fartyget är klart synlig vid alla tidpunkter vid sågning: dra undan den omgivande vävnaden med en klämma eller tång för optimal utsikt.
- Stäng alla grenar av kärlet med ligaturer (t.ex. polyglaktin 3-0) och därefter ta bort demmed kirurgisk sax eller en skalpell.
- Noga ange ett kärl ände med en böjd Halsted mygga pincett, klämma spetsen på pincetten i den andra änden av kärlet och sedan dra långsamt vända kärlet tills den är helt inne ut (Figur 1C-G). Utsidan består nu av den endoteliala cellskiktet. Om någon svårighet påträffas vid vända fartyget, dränka i HBSS igen för att minska friktionen.
- Placera handväska sträng suturer vid båda ändarna av fartyget för att stänga den helt och för att förhindra exponering av icke-endotel kärlvävnad till uppslutning (figur 1H). Använd ligatur ändarna för att manipulera den inverterade kärl.
- Om matsmältningen och kultur sker senare cryopreserve den inverterade fartyget före rötnings protokoll (steg 1,7).
- Placera inverterade kärl i en cryovial och fyll med cellodling frysmedium. Frysa ned till -80 ° C med hjälp av en frys container. Lagra vid -80 ° C om fartygen skall användas inom en vecka. För långtidsförvaring, placera cryovials vid -180 ° C. När du utför EG isolering, tina cryovials snabbt i ett vattenbad (37 ° C) och placera omedelbart i iskall HBSS. Följ anvisningarna i 1.7.
OBS: Ta hänsyn till att det totala utbytet av EC efter isolering blir lägre på grund av förlust av livsduglighet under frysprocessen.
- Placera inverterade kärl i en cryovial och fyll med cellodling frysmedium. Frysa ned till -80 ° C med hjälp av en frys container. Lagra vid -80 ° C om fartygen skall användas inom en vecka. För långtidsförvaring, placera cryovials vid -180 ° C. När du utför EG isolering, tina cryovials snabbt i ett vattenbad (37 ° C) och placera omedelbart i iskall HBSS. Följ anvisningarna i 1.7.
- Överför fartyget till ett 50 ml rör och skölj två gånger i HBSS för att avlägsna erytrocyter (eller kvarvarande frysmediet vid upptining) (Figur 1I).
- Smälta kärlet i ett 50 ml rör med en lösning av 30 ml kollagenas typ II (0,15 U / ml) och dispas (0,15 U / ml) i Canine endotelceller Growth Medium (CECGM) under 1 timme vid 37 ° C med intermittent försiktig agitation.
- Ta bort kärlet från röret och centrifugera cellsuspensionen i 5 min vid 250 x g.
- Resuspendera cellpelleten i CECGM ennd frö 2 ml cellsuspension per brunn (1 - 3 brunnar beroende på fartygets storlek). Odla cellerna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär med 5% CO2 i luft och ändra odlingsmediet två gånger i veckan.
- Passage cellerna när en confluency av 70-80% uppnås.
- Tvätta cellerna med förvärmda HBSS för att avlägsna döda eller icke lösa celler. Tillsätt 200 | il rekombinant cell-dissociation enzym (1x) till varje brunn och placera tillbaka i inkubatorn under 5 min eller till dess att alla celler är fristående.
- Överföra celler till ett 15 ml rör och stoppa trypsinisering genom tillsats av 10 ml av odlingsmedia (CEGM) inklusive 10% fetalt kalvserum (FCS). Centrifugera i 5 minuter vid 250 x g. Fortsätta odlingen i en gelatin förbelagd platta eller kolv.
2. Karakterisering
- Kultur Canine aortaendotelceller (CnAOECs), jämför morfologin hos de primära och kommersiella cellinjer två gånger per vecka med ett mikroskop.
OBS: Than typisk växtmönster EC fläckvis kan bäst observeras när en konfluens på> 70% uppnås.- Kultur CnAOECs i CECGM på en 0,5% vikt / volym gelatin förbelagd T75-flaska. Passage celler en gång i veckan när konfluens är 70 - 80%.
- För passage, tvätta cellerna en gång med förvärmda HBSS och tillsätt 1 ml rekombinant cell dissociation enzym (1x). Placera kolven tillbaka i inkubatorn under 5 min eller till dess att alla celler är fristående. Inaktivera trypsin genom tillsats av 10 ml odlingsmedium (CEGM) innefattande 10% FCS. Centrifugera cellsuspensionen i 5 minuter vid 250 xg, kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i en ml odlingsmedium.
- Ta en 10 | il alikvot av cellsuspensionen och späd 1: 1 med 0,4% trypanblått. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare, och platta ut 4,0 x 10 5 levande celler i en ny T75 kolv. Tillsätt 10 ml av pre-warmed CECGM till kolven och odling vid 37 ° C i en fuktad atmosfär med 5% CO2.
- Kultur CnAOECs i CECGM på en 0,5% vikt / volym gelatin förbelagd T75-flaska. Passage celler en gång i veckan när konfluens är 70 - 80%.
- Isolera RNA från passage en av de odlade CaPECs och CnAOECs.
- Samla minst 1 x 10 3 celler som en pellet, tillsätt 20 | il av provberedning reagens (SPR) och inkubera under 1 min för att lysera cellerna. Efter inkubation, noggrant samla cellysatet innehållande totalt RNA och förvara vid -70 ° C.
- Konvertera mRNA till cDNA med användning av en cDNA-synteskit (t.ex. iScript) följa tillverkarens instruktioner. Store cDNA vid 4 ° C upp till en vecka, eller vid -20 ° C för långtids tills redo att utföra qPCR.
- Mät genuttryck av endotel markör CD31 för att bekräfta endotelceller ursprung. Utför experimentuppställning och kvantifiering med hjälp av MIQE Precis riktlinjerna 10. För normalisering, mäta uttryck av referensgener GAPDH, RPS19 och B2MG 11.
- Bered en 10-faldig spädning av den erhållna cDNA i nukleas fritt vatten.
- Förberedaen 4-faldig utspädning från poolade cDNA prover för standardlinjen och använda nukleasfritt vatten som en icke-mall kontroll. Späd proverna fem gånger för att nå en 50-faldig total utspädning för qPCR reaktioner. Pipettera 10 | il reaktioner i duplikat i en 384-brunnars format med användning av 4 | j, l cDNA och 6 | il av fluoroforen blandades med 20 pmol av back- och framåtriktad primer (tabell 1).
- Ställa in programmet till 95 ° C under 5 min för Taq-polymeras-aktivering, följt av 39 cykler av 10 sek vid 95 ° C under denaturering, och 30 sek vid Tm för glödgning och töjning. Tm för varje primeruppsättning visas i tabell 1.
- Utför smältkurva analyser efter varje körning att säkerställa att endast en produkt förstärks. Normalisera uttrycksnivåer av proven med användning av den genomsnittliga relativa mängden av referensgener, och beräkna ΔCt om reaktionseffektiviteten är mellan 95% och 105%.
- Bedöma EG funktionalitet med en angiogenesis assay.
- Tillsätt 10 | il av extracellulär matris till varje brunn i en i förväg kyld angiogenes slide och sprids med en pipettspets för att täcka ytan av brunnen. Hålla den extracellulära matrisen på is och undvika införandet av luftbubblor in i gelén. Stelna gelén genom att placera objektglaset i en petriskål med vatten indränkt pappershanddukar i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 under 30 min.
- Lägg 1,0 x 10 4 primära EC i 50 pl Endothelial Growth Medium per brunn. Inkubera objektglaset under 6 h vid 37 ° C med 5% CO2.
- Efter sex timmar fotografera med en 20X förstoring, och se till att omfatta hela väl i bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Olika blodkärl framgångsrikt utsattes för den beskrivna isolering protokollet (Figur 2). Det var möjligt att dissekera och invertera aorta, hålvenen, vena porta, och kranskärls från friska hundar (alla fartyg från varje hund, n = 4). Med samma tillvägagångssätt EC isolerades från två medfödda portosystemic shuntar (extrahepatisk och intrahepatiska, n = 1 vardera). Även aorta var lätt inverterad, aorta segment var mer utmanande än bukaorta. I bröstkorg segment aorta har många interkostala artärer förgrenas från det, som måste ligeras individuellt för att säkerställa strikt endotel exponering för matsmältningen lösning. Dissekerade segment av stjärtfenan hålvenen ingår förgreningspunkten av njur venerna, som behövs för att ligeras före inversion. För portvenen den bidragande gren av vena gastroduodenalis ligerades före inversion av blodkärlet. den coronary artär hos hundar är en mycket mindre blodkärl (ca 1-2 mm diameter i en medelstor hund), varifrån vi skars ett segment av cirkumflex gren. Eftersom den har en liten diameter, visade den sig vara lättare att invertera en ganska kort segment av 1 cm, eftersom de Mosquito pincett inte skulle kunna införas mycket längre.
En dag efter isolering vidhäftade celler var synliga i odlingsplattan. I kultur, CaPECs hade en polygonal form och uppvisade en tendens att växa i plåster såsom visas i figur 3 Talrika kolonier av endotelceller kunde observeras 3 -. 6 dagar efter isolering. Efter cirka 10 dagar i odling en konfluens på 80% uppnåddes och cellerna kunde överträffas. I genomsnitt de primära endotelceller kulturer kan upprätthållas under en högst 8 passager (en gång i veckan på en delad hastighet av 1: 4) vid vilken tidpunkt de slutat växa.
isolated endotelceller uttryckte endotelial cellmarkör CD31 såsom indikeras av qPCR (Figur 4). Uttrycket i endotelceller härledda från aorta, hålvenen, och vena porta från fyra hundar jämfördes med en kontrollkultur CnAOECs. De odlade primära cellerna hade en jämförbar CD31 uttryck med kontroll EC (Kruskall-Wallis, p = 0,856).
CaPECs härrör från aorta, hålvenen och vena porta visade förgrening efter 6 timmars inkubation på angiogenes bilden som visas i figur 5.
Figur 1: Analysera och invertering blodkärl för Endothelial Cell Isolation. A) Den blodkärl av intresse avlägsnas aseptiskt från en frisk hund kadaver. B) angränsande vävnad och / eller fett som omger kärlet bör vara Avtagbared försiktigt med kirurgiska sax utan att skada själva fartyget (hund hålvenen, buken segment av 5 cm). C) med en böjd Halsted Mosquito pincett, fartyget kan införas utan att perforera endotelskiktet. GD) Fäst pincetten på andra slutet av blodkärlet och försiktigt dra tillbaka, och därmed helt vända blodkärlet. Endotelskiktet är nu på utsidan av kärlet. H) handväska-sträng suturer placeras vid ändarna stängning av den icke-endotelial yta hos den inverterade kärl. I) Blodkärlet överföres till ett 50 ml rör för tvättning och efterföljande digerering. Skalstrecken anger 2 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:.. Cellmorfologi Bilder togs två veckor efter rötning av fartygen A) EC härlett frOm hund aorta i kanalen 2. B) EC härrör från hund hålvenen i kanalen 2. C) EC som härrör från hund vena porta i kanalen 2. Alla bilder är tagna med 4X ursprunglig förstoring. Skalstrecken anger 500 | j, m. Insert visar 10X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Gene Expression av CD31. Uttryck av CD31 i endotelceller i passagen 1 härledda från aorta, hålvenen, och vena porta (n = 4 hundar). Inga signifikanta uttrycks skillnader observerades mellan CaPECs och CnAOECs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Angiogenes Fotografier av CnAOECs och CaPECs från aorta, hålvenen och vena porta efter 6 timmars inkubation på en angiogenes slide (20X förstoring). Gren bildningen är synlig efter sex timmar i B) CaPECs kultur. A) CnAOECs. Härledda från aorta. C) CaPECs härrör från hålvenen. D) CaPECs härrör från vena porta. Alla celler var i passagen 3. Skala staplar indikerar 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| GOI | Riktning | 5'-sekvens-3 ' | tm glödgning | Produktstorlek (bp) | genbank nummer | |
| CD31 | Framåt | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59 ° C | 85 | XM_005624261.1 | |
| Omvänd | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| beta-aktin | Framåt | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58 ° C | 384 | NM_001195845 | |
| Omvänd | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | Framåt | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63 ° C | 95 | XM_005616513 | |
| Omvänd | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | Framåt | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63 ° C | 85 | AB745507 | |
| Omvänd | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
Tabell 1: qPCR Primer Ställer qPCR primers för hund referens gener och CD31..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I studier som fokuserar på hund EC den CnAOEC primära linjen används för att modellera endotelceller linjer av hunden 3, 12, 13. I humanstudier är HUVEC kulturen fortfarande vara den gyllene standarden. Tydligt fokus enbart på EC som härrör från navelsträngen är en fast begränsning i kardiovaskulär forskning. Endotelceller har ett specifikt genuttryck mönster bestämma arteriovenös specifikation. För att ta hänsyn till dessa skillnader i postnatal fartyg presenterar vi denna nya isoleringsmetod baserad på den specifika anatomiska placeringen av endotelceller. De metoder som vanligtvis används för primär EG isolering spola kärlet med en enzymlösning eller mals fartyget före matsmältning, två metoder som båda har en risk för kontaminering med icke-EC. Vi etablerade en teknik för isolering av Canine Primary endotelceller (CaPECs) med en mindre risk för kontaminering som också kan användas på små fartyg. Denna isolering metod av endotelceller är baserad på inversion av kärlet, som undviker nedbrytning av alla andra typer fartyg cell. Det är viktigt att avlägsna kärlen aseptiskt, såsom illustreras i figur 1 A, för att förhindra bakterie- eller svampkontaminering av de endoteliala kulturer. I fall av bakteriell tillväxt ett ytterligare antimikrobiellt medel (t.ex., gentamycin) kan tillsättas till odlingsmediet. I fall av svampinfektion behandling är ofta inte är framgångsrik i vår erfarenhet.
För att inversion skall lyckas, är det viktigt att erhålla ett fartyg som är ungefär 5 cm i längd. Ett andra viktigt steg för att underlätta inversion av blodkärlet är avlägsnandet från angränsande vävnad och fett med kirurgisk sax. Inverterande kärlet görs noggrant genom fastklämning pincetten vid den motsatta änden och långsamt invertera kärlet. Vid placering av handväska sträng suturer se till att röra endotelskiktet så lite som möjligt. damaGE av endotelet kan resultera i dåligt utbyte av livskraftiga endotelceller och åtkomst av uppslutnings media till underliggande vävnad. Detta kan också inträffa om fartyget inte är helt stängd. Fartyget kan enkelt hanteras genom att plocka upp i slutet av en ligatur.
I särskilda fall kan tillämpas en modifiering av den teknik. I blodkärl med liten diameter är det ibland omöjligt att sätta en mygga tång för att invertera kärlet. En lösning är att placera vistelse suturer i ena änden av kärlet och driva sina ligaturer genom blodkärlet med hjälp av pincett. Vid den andra änden kan de sedan säkras med en mygga pincett och dras, och därigenom invertera kärlet. Ibland kärlet kommer att riva som en följd av de extra suturer, så denna modifikation inte är den föredragna metoden. Ett annat problem som kan uppstå är när många erytrocyter är närvarande i odlingsplattor vid sådd av de primära cellerna. Detta kan vara ett resultat avotillräcklig tvättning av blodkärlet före digestion. När detta inträffar, tvättning av brunnarna på dag 2 med varmt HBSS är ofta tillräcklig för att avlägsna huvuddelen av erytrocyterna. I vilket fall som helst kommer erytrocyterna inte kvar i kulturen och försvinner vid passage av CaPECs.
De isolerade CaPECs uttryckte CD31, vilket indikerar att populationen av celler som klövs från blodkärlet är verkligen av endotel ursprung. Som nyligen publicerade, är denna markör också uttrycks i endotelceller från hund mitralisklaffen 14. Bildandet av kolonier i kultur indikerar kulturerna starta från antingen enskilda celler eller från små cellkluster. Snabb tillväxt på endothelial specifika medier är också ett tecken på rätt celltyp. De primära cellerna kan odlas under åtta passager, varefter kulturerna upphör expansion. Detta är en indikation på åldrande och gör den mindre troligt att stam / progenitorceller odlas med detta protocol. I en angiogenesanalys, CaPECs från aorta, hålvenen och vena porta visade förgrening inom sex timmar. Detta endothelial funktion ger hållbara bevis för deras ursprung.
Baserat på tillgänglighet endast hund material studerades, men isoleringsmetoden har möjliga tillämpningar för isolering av humana primära endotelceller eller endotelceller från andra organismer. Tekniken är också möjligt för mycket små fartyg (1 cm längd), men kommer att ge mindre isolerade celler. Av denna anledning CaPECs erhållits från små fartyg kommer att kräva en extra passage innan de har nått ett tillräckligt antal för experiment.
Förmågan att utföra isoleringsmetoden på små fartyg är en stor fördel för studier i kärlsjukdom. EC kunde isoleras från sjuka eller avvikande fartyg som portosystemic shuntar. Dessa är fartyg som förbinder portvenen och den systemiska cirkulationen som orsakar blod för att kringgå levern 2 15, 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
