Introduction
Les chiens sont utilisés comme modèle animal grande pour la recherche sur les maladies cardiovasculaires et peuvent également souffrir de innés (génétiques) anomalies vasculaires 1, 2. Pour étudier ces maladies des lignées de cellules endothéliales commerciales sont souvent utilisés pour évaluer des cellules endothéliales (CE) fonctionnalité. Pour les chiens il y a une ligne de cellules endothéliales commerciale disponible (CnAOEC), dérivé de l'aorte canine. Cette lignée cellulaire est surtout utilisé dans les études comme témoin normal CEs 3-5. Dans la recherche cardiovasculaire humain lignes de cellules endotheliales les plus couramment utilisées sont des cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) et ombilicale humaine Artère cellules endothéliales (HUAEC) provenant de la veine du cordon ombilical humain et de l'artère, respectivement. HUVEC ont été utilisés comme la norme d' or dans la recherche vasculaire depuis les années 1980 6. Ils sont considérés comme le système de modèle classique pour étudier la fonction endothéliale et de l'adaptation de la maladie. Les cellules endothéliales isolées à partir de différents vaisseaux sanguins varient en appearance et la fonctionnalité en raison de fond génétique et l' exposition au microenvironnement 7. En outre, HUVEC et HUAEC sont dérivées du cordon ombilical, une structure vasculaire de développement qui pourraient ne pas pleinement imiter les vaisseaux sanguins des adultes par rapport aux conditions qu'ils sont exposés à et de la réponse à la maladie. Par conséquent, la traduction des résultats trouvés dans HUVEC et HUAEC aux maladies cardiovasculaires en général est insuffisant.
Lorsque l'on étudie l'adaptation et le comportement des adultes CEs, CEs primaires du navire d'intérêt devrait être utilisé comme une approche plus directe. Pour isoler ces cellules, plusieurs procédés ont été rapportés. Un procédé largement décrit, qui est également utilisé pour HUVEC, est le rinçage de la cuve avec une solution de digestion enzymatique 8. Il en résulte souvent une contamination par des non telles que les cellules endothéliales et les fibroblastes 9 musculaires lisses. Une autre méthode fréquemment utilisée pour l'isolement est la digestion enzymatique du tissu de vaisseau émincé suivie par fluorescencetri des cellules activées (FACS) en fonction endothéliale Cluster marqueur de cellules de différenciation (CD) , 31 7, 8. tri FACS et la culture cellulaire ultérieure exige des quantités relativement importantes de cellules et ne convient donc pas pour l'isolement de l' endothélium des petits vaisseaux sanguins. Nous avons donc cherché à mettre au point une nouvelle méthode robuste pour isoler une population de cellules endothéliales pur à partir de divers vaisseaux sanguins canine avec une grande pureté. Pour tester l'efficacité de la nouvelle méthode d'isolement, nous avons isolé et obtenu Canine endothéliale primaire cellulaire (CAPEC) des cultures pures de différentes artères et les veines canines, grandes et petites. Ce procédé permet également la culture des cellules endothéliales provenant de malades et / ou des vaisseaux aberrants tels que des shunts portosystémiques intra ou extra-hépatiques congénitaux, une maladie courante chez les chiens 2. Le procédé permet l'isolement de types cellulaires appropriés supplémentaires du même navire, tels que des cellules musculaires lisses vasculaires, puisque la majeure partie du bateau reste intagir au cours de la procédure.
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Protocol
Éthique déclaration: Les vaisseaux sanguins utilisés dans cette étude ont été récoltées en tant que matériau de surplus obtenu à partir de cadavres frais canins (n = 4) des chiens en bonne santé euthanasiés pour d'autres recherches sans rapport (politique de l'Université 3R). vaisseaux sanguins aberrants (shunts portosystémiques intra- et extrahépatiques, n = 1 chacun) ont été récoltées post-mortem après le consentement éclairé des propriétaires de chiens présentés à la clinique universitaire pour les animaux de compagnie de l'Université d'Utrecht.
1. Isolement et culture de cellules primaires Canine endothéliales
- Pré-manteau des plaques 6 puits avec 2 ml / puits de 0,5% p / v de gélatine et laisser reposer pendant 2 h dans un incubateur avec une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 à 37 ° C. Retirer la solution de gélatine en excès avant l'ensemencement des cellules primaires.
- Retirer aseptique du vaisseau sanguin (s) d'intérêt (par exemple, l' aorte, la veine cave, la veine porte) à partir d' une nouvelle canine cadaver (figure 1A). Maintenir l'anatomie du système de récipienten plaçant une pince droite sur les deux extrémités du vaisseau d'intérêt. Éviter des manipulations inutiles du tissu avec une pince pour éviter tout dommage aux cellules endothéliales.
- Couper le récipient serré sur les deux extrémités avec des ciseaux chirurgicaux et retirer du cadavre. Transport en solution saline équilibrée de Hank (HBSS) sur la glace.
NOTE: Une longueur du navire d'environ 5 cm est préférée pour cette procédure, mais ceux qui mesurent 1 cm également fournir suffisamment de cellules à la culture.
- Couper le récipient serré sur les deux extrémités avec des ciseaux chirurgicaux et retirer du cadavre. Transport en solution saline équilibrée de Hank (HBSS) sur la glace.
- Transférer le vaisseau sanguin dans une boîte de Pétri remplie de HBSS glacé. Avec des ciseaux chirurgicaux, enlever tous les tissus et la graisse adhérente de l'extérieur du navire, en gardant le navire lui - même intacte (figure 1B). Assurez-vous que le navire est clairement visible en tout temps lors de la coupe: tirez de côté le tissu environnant avec une pince ou une pince pour une vue optimale.
- Fermez toutes les branches de la cuve avec ligatures (par exemple, polyglactine 3-0) et retirer ensuite lesavec des ciseaux chirurgicaux ou un scalpel.
- Entrez soigneusement une extrémité de l' enceinte avec un incurvées pince mosquito Halsted, serrer la pointe de la pince à l'autre extrémité de la cuve, puis se rétracter, inverser lentement le navire jusqu'à ce qu'il soit complètement à l' intérieur (Figure 1C-G). L'extérieur se compose désormais de la couche de cellules endothéliales. Si une difficulté est rencontrée lors de l'inversion du navire, plonger dans HBSS à nouveau pour réduire la friction.
- Placer des sutures cordon de bourse aux deux extrémités de la cuve pour la fermer complètement , et pour empêcher l' exposition d'un tissu vasculaire non endothelial à la procédure de digestion (figure 1H). Utilisez les extrémités ligatures pour manipuler le récipient inversé.
- Si la digestion et la culture est réalisée plus tard, le récipient renversé cryoconservation avant le protocole de digestion (étape 1.7).
- Placer le récipient inversé dans un cryovial et remplir avec la culture cellulaire milieu de congélation. Le gel jusqu'à -80 ° C en utilisant un gel container. Conserver à -80 ° C si les navires doivent être utilisés dans une semaine. Pour le stockage à long terme, le lieu cryovials à -180 ° C. Lors de l'isolement CE, dégeler les cryotubes rapidement dans un bain d'eau (37 ° C) et placer immédiatement glacée HBSS. Procéder comme indiqué en 1.7.
NOTE: Prendre en compte que le rendement total de CEs après isolement sera moindre en raison de la perte de viabilité pendant le processus de congélation.
- Placer le récipient inversé dans un cryovial et remplir avec la culture cellulaire milieu de congélation. Le gel jusqu'à -80 ° C en utilisant un gel container. Conserver à -80 ° C si les navires doivent être utilisés dans une semaine. Pour le stockage à long terme, le lieu cryovials à -180 ° C. Lors de l'isolement CE, dégeler les cryotubes rapidement dans un bain d'eau (37 ° C) et placer immédiatement glacée HBSS. Procéder comme indiqué en 1.7.
- Transférer le navire vers un tube de 50 ml et rincer deux fois dans HBSS pour éliminer les érythrocytes (ou milieu de congélation résiduelle en cas de dégel) (Figure 1I).
- Digérer le récipient dans un tube de 50 ml avec une solution de 30 ml de collagénase de type II (0,15 U / ml) et la dispase (0,15 U / ml) dans des cellules canines Endothelial Growth Medium (CECGM) pendant 1 heure à 37 ° C avec intermittente en douceur agitation.
- Retirez le récipient du tube et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 250 x g.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans un CECGMnd semences 2 suspension de cellules ml par puits (1 - 3 puits en fonction de la taille du navire). Culture des cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 dans l' air et changer le milieu de culture deux fois par semaine.
- Passage des cellules quand une confluence de 70 - 80% est atteint.
- Laver les cellules avec pré-chauffé HBSS pour éliminer les cellules mortes ou non-inscrits. Ajouter 200 ul enzyme de dissociation de cellules recombinant (1x) à chaque puits et placer dans l'incubateur pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que toutes les cellules sont détachées.
- Transférer les cellules à un tube de 15 ml et arrêter trypsinisation en ajoutant 10 ml de milieux de culture (CEGM) dont 10% de sérum de veau fœtal (FCS). Centrifuger pendant 5 min à 250 x g. Continuer la culture dans une plaque ou un flacon de gélatine pré-enduit.
2. Caractérisation
- Culture des cellules endothéliales aortiques Canine (CnAOECs) et comparer la morphologie des lignes primaires et commerciales cellulaires deux fois par semaine avec un microscope.
NOTE: Til de plus en plus typique modèle de CEs en plaques peut être mieux observé quand une confluence de> 70% est atteint.- La culture dans CnAOECs CECGM sur un flacon T75 0,5% en poids / volume de gélatine pré-revêtue. cellules Passage une fois par semaine lorsque la confluence est de 70 - 80%.
- Pour repiquage, laver les cellules une fois avec HBSS préchauffé et ajouter 1 ml d'enzyme de dissociation de cellules recombinant (1x). Placer le ballon dans l'incubateur pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que toutes les cellules sont détachées. Inactiver trypsine en ajoutant un milieu de culture de 10 ml (CEGM) dont 10% de FCS. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 250 x g, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de culture.
- Prélever une partie aliquote de 10 ul de la suspension cellulaire et on dilue 1: 1 avec 0,4% de bleu trypan. Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé et la plaque à 4,0 x 10 5 cellules viables dans un nouveau flacon T75. Ajouter 10 ml de pré-chauffé CECGM dans le ballon et la culture à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2.
- La culture dans CnAOECs CECGM sur un flacon T75 0,5% en poids / volume de gélatine pré-revêtue. cellules Passage une fois par semaine lorsque la confluence est de 70 - 80%.
- Isoler ARN du passage 1 des CAPEC cultivées et CnAOECs.
- Collecter au moins 1 x 10 3 cellules sous forme d' une pastille, ajouter 20 ul de réactif de préparation de l' échantillon (SPR) et incuber pendant 1 min pour lyser les cellules. Après incubation, recueillir soigneusement le lysat cellulaire contenant l'ARN total et conserver à -70 ° C.
- Convertir l' ARNm en ADNc en utilisant un kit de synthèse d'ADNc (par exemple, iScript) en suivant les instructions du fabricant. ADNc de magasin à 4 ° C jusqu'à une semaine, ou à -20 ° C pour le long terme avant d'être prêt à effectuer la qPCR.
- Mesurer l'expression du gène du marqueur CD31 endothéliale pour confirmer l'origine des cellules endothéliales. Effectuez la configuration expérimentale et la quantification en utilisant les lignes directrices PRECIS MIQE 10. Pour la normalisation, mesurer l' expression des gènes de référence GAPDH, RPS19 et B2MG 11.
- Préparer une dilution de 10 fois de l'ADNc obtenu dans l'eau sans nucléase.
- Préparerune dilution de 4 fois à partir d'échantillons d'ADNc mis en commun pour la ligne standard et utiliser l'eau sans nucléase comme un contrôle non-modèle. Diluer les échantillons de cinq fois pour atteindre une dilution totale de 50 fois pour les réactions de qPCR. Introduire à la pipette 10 ul de réactions en double dans un format de 384 puits avec 4 ul d' ADNc et 6 pi du fluorophore mélangé avec 20 pmol d'amorce inverse et vers l' avant (tableau 1).
- Définir le programme à 95 ° C pendant 5 minutes pour l'activation de la polymérase Taq, suivie par 39 cycles de 10 s à 95 ° C pour la dénaturation et 30 secondes à Tm pour l'hybridation et l'allongement. La Tm pour chaque jeu d' amorces est indiquée dans le tableau 1.
- Effectuer la courbe de fusion analyse après chaque course pour assurer un seul produit est amplifié. Normaliser les niveaux des échantillons en utilisant la quantité relative moyenne des gènes de référence d'expression, et calculer la ACt si l'efficacité de la réaction se situe entre 95% et 105%.
- Évaluer la fonctionnalité CE avec un angiogenesis dosage.
- Ajouter 10 ul de matrice extracellulaire à chaque puits d'une lame pré-refroidi l'angiogenèse et la propagation avec une pointe de pipette pour couvrir la surface du puits. Gardez la matrice extracellulaire sur la glace et éviter l'introduction de bulles d'air dans le gel. Solidifier le gel en plaçant la lame dans une boîte de Pétri avec du papier absorbant imbibé d'eau dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 30 min.
- Ajouter 1,0 x 10 4 primaire CEs dans 50 pl de croissance endothélial moyenne par puits. Incuber la lame pendant 6 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Après 6 h de prendre des photos avec un grossissement 20X, en veillant à inclure l'ensemble bien dans l'image.
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Representative Results
Les vaisseaux sanguins différents ont été soumis avec succès au protocole d'isolement décrit (figure 2). Il était possible de disséquer et inverser l'aorte, la veine cave, la veine porte et l'artère coronaire des chiens en bonne santé (tous les navires de chaque chien, n = 4). Avec les mêmes CEs d'approche ont été isolés à partir de deux shunts portosystémiques congénitales (extrahépatique et intrahépatique, n = 1 chacun). Bien que l'aorte a été facilement inversé, les segments de l'aorte thoracique étaient plus difficiles que l'aorte abdominale. Dans l'aorte thoracique segments possède de nombreuses artères intercostales ramification de celle-ci, qui doivent être ligaturée individuellement pour assurer une exposition strictement endothélial à la solution de digestion. Le segment disséqué de la veine cave caudale inclus le point des veines rénales, qui devaient être ligaturé avant inversion ramification. Pour le portail de la veine de la branche à part entière de l'gastroduodenalis vena a été ligaturé avant inversion du vaisseau sanguin. Le coronary artère chez les chiens est un navire beaucoup plus petit de sang (environ 1 - de 2 mm de diamètre dans un chien de taille moyenne), à partir duquel nous excisé un segment de la branche circonflexe. Parce qu'il a un petit diamètre, il est avéré être plus facile d'inverser un assez court segment de 1 cm parce que les pinces moustiques ne pouvaient pas être insérés beaucoup plus loin.
cellules adhérant après l'isolement d'une journée étaient visibles dans la plaque de culture. En culture, CAPEC a une forme polygonale et fait preuve d' une tendance à croître en plaques comme le montre la figure 3 , de nombreuses colonies de cellules endothéliales ont pu être observées . 3 - 6 jours après l' isolement. Après environ 10 jours en culture une confluence de 80% a été atteint et les cellules pourrait être dépassé. En moyenne, les cultures endothéliales primaires pourraient être maintenues pour un maximum de 8 passages (une fois par semaine à un taux de division de 1: 4) à quel point ils ont cessé de croître.
Isolated cellules endotheliales expriment le marqueur endothélial de cellules CD31 comme indiqué par qPCR (figure 4). L'expression dans les cellules endothéliales dérivées de l'aorte, la veine cave et la veine porte de quatre chiens a été comparée avec une culture témoin de CnAOECs. Les cellules primaires cultivées avaient une expression de CD31 comparable avec le contrôle COCOM (Kruskall-Wallis, p = 0,856).
CAPEC dérivées de l' aorte, la veine cave et la veine porte de ramification montré après 6 heures d' incubation sur la lame de l' angiogenèse , comme illustré sur la figure 5.
Figure 1: Dissection et Inversant vaisseaux sanguins pour les cellules endothéliales isolement. A) Le vaisseau sanguin d'intérêt est prélevé aseptiquement sur un cadavre canin frais. B) tissus Adhérent et / ou la graisse entourant la cuve doit être removed soigneusement avec des ciseaux chirurgicaux sans endommager le navire lui - même (canine vena cava, segment abdominal de 5 cm). C) Avec courbes pince Halsted Mosquito, le navire peut être saisi sans perforer la couche endothéliale. DG) Fixer la pince de l'autre la fin du vaisseau sanguin et se rétracter doucement, de manière à inverser complètement le vaisseau sanguin. La couche endotheliale est maintenant à l'extérieur de la cuve. H) sutures cordon de bourse sont placés aux extrémités de fermeture de la surface non endothelial du récipient inversé. I) , le vaisseau sanguin est transféré dans un tube de 50 ml pour le lavage et la digestion subséquente. Les barres d'échelle indiquent 2 cm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:.. Morphologie des cellules photos ont été prises deux semaines après la digestion des vaisseaux fr A) CEs dérivéaorte om canine dans le passage 2. B) CEs dérivé de chien dans la veine cave passage 2. C) CEs dérivés de chien veine porte dans le passage 2. Toutes les photos sont prises avec 4X grossissement. Les barres d'échelle indiquent 500 um. Insérer montre un grossissement de 10X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Gene expression de CD31. L'expression de CD31 dans les cellules endothéliales dans le passage 1 dérivées de l'aorte, la veine cave et la veine porte (n = 4 chiens). Aucune différence d'expression significative n'a été observée entre la CAPEC et CnAOECs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Angiogenèse Photographies de CnAOECs et CAPEC de l' aorte, la veine cave et la veine porte après 6 heures d' incubation sur une lame d'angiogenèse (20X grossissement). La formation de la Direction générale est visible après 6 h dans la culture. A) CnAOECs. B) CAPEC dérivées de l' aorte. C) CAPEC provenant de la veine cave. D) CAPEC dérivée de la veine porte. Toutes les cellules étaient dans le passage 3. Les barres d'échelle indiquent 1 mm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| GOI | Direction | Séquence 5'-3 ' | tm recuit | Taille du produit (pb) | Numéro de Genebank | |
| CD31 | Vers l'avant | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59 ° C | 85 | XM_005624261.1 | |
| Sens inverse | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| la bêta-actine | Vers l'avant | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58 ° C, | 384 | NM_001195845 | |
| Sens inverse | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | Vers l'avant | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63 ° C, | 95 | XM_005616513 | |
| Sens inverse | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | Vers l'avant | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63 ° C, | 85 | AB745507 | |
| Sens inverse | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
Tableau 1: Primer qPCR Définit amorces qPCR des gènes de référence canine et CD31..
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Discussion
Dans les études portant sur canine CEs la ligne primaire CnAOEC est utilisé pour modéliser les lignées endothéliales du chien 3, 12, 13. Dans les études humaines, la culture HUVEC est toujours considéré comme l'étalon-or. De toute évidence, en se concentrant uniquement sur CEs dérivées du cordon ombilical est une restriction ferme dans la recherche cardiovasculaire. Les cellules endothéliales ont un profil d'expression génique spécifique déterminant la spécification artérioveineuse. Afin de tenir compte de ces différences dans les vaisseaux postnatales nous présentons cette nouvelle méthode d'isolement sur la base de la localisation anatomique spécifique des cellules endothéliales. Les méthodes couramment utilisées pour l'isolement CE primaire sont bouffées vasomotrices le récipient avec une solution enzymatique ou émincer le navire avant la digestion, deux méthodes qui ont tous deux un risque de contamination par des non-CEs. Nous avons établi une technique pour l'isolement des cellules endothéliales Canine primaire (CAPEC) avec une moindre chance de contamination qui peut également être utilisé sur les petits navires. Cet isolement méthode des cellules endothéliales est basée sur l'inversion de la cuve, ce qui évite la digestion de tous les autres types de cellules de la cuve. Il est important de retirer les récipients aseptiques, comme illustré sur la figure 1A, afin d' éviter une contamination bactérienne ou fongique des cultures endotheliales. Dans le cas de la croissance bactérienne d' un agent antimicrobien supplémentaire (par exemple, la gentamicine) peut être ajouté au milieu de culture. En cas de traitement de l'infection fongique est souvent pas réussi à notre expérience.
Pour que l'inversion réussisse, il est essentiel d'obtenir un récipient qui est d'environ 5 cm de longueur. Une deuxième étape importante pour faciliter l'inversion du vaisseau sanguin est la suppression de tout tissu adhérent et de la graisse avec des ciseaux chirurgicaux. Inverser le récipient est fait avec soin par serrage de la pince à l'extrémité opposée et en inversant lentement la cuve. Lorsque vous placez le sac-string sutures assurez-vous de toucher la couche aussi peu que possible endothéliale. Damage de l'endothélium peut entraîner un mauvais rendement des cellules endothéliales viables et l'accès des médias de digestion au tissu sous-jacent. Cela peut également se produire si le navire est pas complètement fermé. Le récipient peut être facilement manipulé en le prenant à la fin d'une ligature.
Dans certains cas une modification de la technique peut être appliquée. Dans les vaisseaux sanguins avec un petit diamètre, il est parfois impossible d'insérer une pince Mosquito pour inverser le navire. Une solution consiste à placer des sutures de fixation à une extrémité du navire et de pousser leurs ligatures à travers le vaisseau sanguin à l'aide de la pince. À l'autre extrémité, ils peuvent alors être fixés avec une pince Mosquito et tiré, inversant ainsi le navire. Parfois, le navire se déchire comme une conséquence des sutures supplémentaires, de sorte que cette modification ne soit pas l'approche privilégiée. Un autre problème qui peut se poser est alors beaucoup érythrocytes sont présents dans les plaques de culture lors de l'ensemencement des cellules primaires. Cela peut être le résultat d'un lavage insuffisant du vaisseau sanguin avant la digestion. Lorsque cela se produit, le lavage des puits le jour 2 avec HBSS chaud est souvent suffisante pour éliminer la majorité des globules rouges. Dans tous les cas, les érythrocytes ne persisteront pas dans la culture et sont perdus lors de repiquage des CAPEC.
Les CAPEC isolées ont exprimé CD31, ce qui indique que la population de cellules qui a été digéré à partir du vaisseau sanguin est bien d'origine endothéliale. Tout récemment publiée, ce marqueur est également exprimé dans les cellules endothéliales de la valvule mitrale 14 canine. La formation de colonies dans la culture indique que les cultures commencent à partir soit des cellules individuelles ou de petits amas cellulaires. La croissance rapide sur endothéliale média spécifique est également indicative du type de cellule correcte. Les cellules primaires peuvent être mises en culture pendant huit passages, après quoi les cultures ont cessé d'expansion. Ceci est une indication de la sénescence et la rend moins probable que les cellules souches / progénitrices sont cultivées avec ce protocol. Dans un essai d'angiogenèse, CAPEC de l'aorte, la veine cave et la veine porte a montré la ramification dans les 6 heures. Cette fonctionnalité endothéliale fournit des preuves solides pour leur origine.
Sur la base de la disponibilité seule matière canine a été étudiée, mais la méthode d'isolement a des applications possibles pour l'isolement de cellules endotheliales primaires humaines ou des cellules endothéliales provenant d'autres organismes. La technique est également possible pour les très petits vaisseaux (1 cm de longueur), mais produira moins de cellules isolées. Pour cette raison CAPEC obtenus à partir de petits navires, il faudra un passage supplémentaire avant qu'ils aient atteint un nombre suffisant pour les expériences.
La capacité d'exécuter la méthode d'isolation sur les petits vaisseaux est un grand avantage pour l'étude de la maladie vasculaire. CEs pourrait être isolé à partir des vaisseaux malades ou aberrants comme shunts portosystémiques. Ce sont là les navires reliant la veine porte et la circulation systémique , ce qui provoque au sang de contourner le foie 2 15, 16.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
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