Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60909
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

Summary

الحصول على السكان نقية من الخلايا الليفية أمر بالغ الأهمية لدراسة دورها في إصلاح الجروح والتليف. وصف هنا هو طريقة مفصلة لعزل الخلايا الليفية وmyofibroblasts من قلوب الفئران غير المصابة والجرحى تليها توصيف نقاوتها ووظائفها من قبل الفلورسة المناعية ، RTPCR ، الفلورسة بمساعدة فرز الخلايا ، و الكولاجين هلام الانكماش.

Abstract

التليف القلبي استجابة للإصابة هو استجابة فسيولوجية لتضميد الجروح. وقد بُذلت جهود لدراسة واستهداف الأنواع الفرعية للانفجار الليفي التي تخفف من التليف. ومع ذلك ، تم إعاقة أبحاث الخلايا الليفية بسبب عدم وجود علامات ليفية مقبولة عالميًا لتحديد الخلايا الليفية الممتعة وكذلك الخلايا الليفية المنشطة. الخلايا الليفية هي مجموعة خلايا غير متجانسة ، مما يجعلها صعبة العزل وتوصيفها. يصف البروتوكول المقدم ثلاث طرق مختلفة لإثراء الخلايا الليفية والخلايا الليفية من قلوب الفئران غير المصابة والمصابة. استخدام بروتوكول قياسي وموثوق به لعزل الخلايا الليفية سيمكن من دراسة أدوارها في التوازن وكذلك تعديل التليف.

Introduction

الخلايا الليفية القلبية، الخلايا ذات الأصل المتوسط، تلعب دورا هاما في الحفاظ على التوصيل الكهربائي والقوى الميكانيكية في القلب بالإضافة إلى الحفاظ على الهندسة المعمارية القلبية أثناء التوازن1. بعد الإصابة ، يتم تنشيط هذه الخلايا ، وتوسيعها ، وإنتاج بروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM)2. وقد كشفت العديد من الدراسات قبل السريرية الخلايا الليفية والمنظمين الخلوية الحرجة التي تحافظ على السلامة الهيكلية للقلب المصاب3 وكذلك الخلايا المؤثرات الرئيسية المسؤولة عن إنتاج وترسب البروتينات ECM دون رادع، مما أدى إلى تشكيل ندبة قاسية وفشل القلب4. الخلايا الليفية هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا ، مما يجعل من الصعب تشريح وظيفتها العلاجية من الخصائص غير التكيفية المؤيدة للليفية. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد التغاير الوظيفي لهذين النوعين الفرعيين الليفيين المتميزين بعد إصابة عضلة القلب ، مما يشير إلى إمكانية عزل الأنواع الفرعية المختلفة للخلايا الليفية ودراسة دورها في التئام الجروح5.

الحصول على الخلايا الليفية النقية أمر بالغ الأهمية في تحديد دورهم الوظيفي في الإصلاح والتليف. ومع ذلك ، فإن وجود علامات الليفية المتعددة التي تعترف بأنواع الخلايا الأخرى تجعل من الصعب عزل مجموعة من الخلايا الليفية النقية إلى حد كبير6. وقد وضعت العديد من الدراسات الأنيقة طرق ذكية لعزل الخلايا الليفية القلبية من غير المصابين والجرحى عضلة القلب. الطريقة الأكثر شعبية وراسخة لإثراء الخلايا الليفية هي من خلال الالتصاق الانتقائي بعد هضم الأنسجة الأنزيمية7.

بالإضافة إلى ذلك ، تم بنجاح وصف فرز الخلايا المنشط ة (FACS) من الخلايا الليفية استنادًا إلى مستضدات سطح الخلية8. في الدراسة، بعد الهضم الأنزيمي، تم فرز الخلايا المتوسطة كنسب سلبي (لين: Ter119−CD45−CD31−) وgp38-إيجابية (gp38+) من قلوب الفئران. تم تأكيد Gp38+ ve الخلايا لتكون الخلايا الليفية على أساس التعبير المشترك من col1α1 وغيرها من علامات mesenchymal. على الرغم من أن معظم هضم الأنسجة يتم الانتهاء بعد تشريح البطين في طبق بيتري، وقد حققت دراسة حديثة استخدام إنزيم إبرة مباشرة من البطين الأيسر لعزل myocytes وغير myocytes التي تشمل الخلايا الليفية9. ثم تم عزل الخلايا الليفية عن طريق الالتصاق الانتقائي في هذه الحالة.

يصف هذا البروتوكول عزل وإثراء الخلايا الليفية باستخدام ثلاث طرق. الأول هو طريقة راسخة بالفعل تنطوي على الالتصاق الانتقائي للخلايا الليفية بعد الهضم الأنزيمي. يتم استخدام الطريقة الثانية لعزل في المقام الأول إصابة الناجمة عن العضلات ألفا الملساء التعبير عن myofibroblasts. الطريقة الثالثة تنطوي على الاستنفاد المغناطيسي التتابعي لتعليق خلايا القلب المهضم ة من الخلايا الدمية والفيوثيريلية. بعد الاستنفاد ، يتم عزل الخلايا الليفية / myofibroblasts استنادًا إلى وجود مستضد MEFSK4 باستخدام الخرز المغناطيسي. في الآونة الأخيرة ، وقد وصفت MEFSK4 كما antigen الحاضر على quiescent وكذلك تنشيط الخلايا الليفية ، مما يجعلها علامة مناسبة لتحديد الخلايا الليفية والعزلة. وبطبيعة الحال، فإن جميع الأساليب الموضحة هنا لها قيود فريدة من نوعها. ولذلك يوصى بشدة بالتحقق من نقاء مجموعة الخلايا المعزولة عن طريق تحليل التدفق ، وتلطيخ المناعة ، وشبه الكمية PCR في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، يمكن توسيع نطاق هذه المنهجيات ، ويمكن إضافة علامات إضافية من أجل استبعاد المجموعات السكانية الملوثة الأخرى قبل استخدام الخلايا الليفية والخلايا الليفية للسكان لإجراء تجارب حاسمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتؤيد هذه الدراسة بدقة التوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية للمعاهد الوطنية للصحة. ووافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي للمملكة في جامعة فاندربيلت على البروتوكول (رقم البروتوكول: M1600076-01).

1. تشريح القلب

  1. إعداد الحل
    1. المخزن المؤقت KHB
      1. باستخدام شريط اثارة، تذوب ببطء 9.4 غرام من كريبس-Henseleit العازلة (KHB) مسحوق في 900 مل من المياه DDI.
        ملاحظة: سوف يترسب المخزن المؤقت إذا أثار بسرعة كبيرة جداً أو لفترة طويلة جداً. يجب أن يكون العازلة KHB الباردة أثناء عزل الخلايا الليفية.
      2. إضافة 2.9 mM CaCl2 و 24 mM NaHCO3. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.3 وتمييع إلى حجم 1 لتر مع dH2O.
      3. باستخدام فلتر معقم (0.22 ميكرون)، يخزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع. الحفاظ على الجليد أو عند 4 درجات مئوية لمدة العزلة.
    2. كوكتيل هضم الكولاجين
      1. إعداد كوكتيل الهضم في يوم العزلة الليفية. تحديد الحجم المناسب من كوكتيل الهضم وفقا لعدد من القلوب; 5 مل من الكوكتيل لكل قلب واحد.
      2. إعداد مزيج الكولاجين (انظر جدول المواد)وDNase الأول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      3. ل20 مل من مجموع كوكتيل الهضم، إضافة 17.5 ميكرولتر من DNase I، 180 ميكرولتر من 1 M HEPES، و 500 ميكرولتر من الكولاجين إلى أنبوب مخروطي فارغ 50 مل.
      4. إضافة حجم كاف من حل هانك الملح المتوازن (HBSS) مع كاليفورنيا2 + وملغ2 + للحصول على حجم إجمالي 20 مل.
    3. خلية الدم الحمراء (RBC) العازلة
      1. تحديد الحجم الإجمالي المطلوب بناءً على عدد القلوب (5 مل/قلب). تمييع المخزن الاحتياطي للمخزون RBC 10x إلى 1x باستخدام dH2O.
    4. وسائل الإعلام الليفية: 10٪ FBS في DMEM F-12
      1. إضافة 10٪ FBS إلى DMEM-F12 مع L-الجلوتامين وHEPES. أضف 10 يو/مل بنسلين/ستريبتومسين، 2.5 ميكروغرام/مل مضاد للفطريات، و2.5 ميكروغرام/مل من الميكوبلازما الوقائية (انظر جدول المواد). تخزين في 4 درجة مئوية.
  2. تشريح القلب
    1. إعداد لوحة بئر 6 على الجليد مع 2 مل من KHB الباردة لكل بئر لتخزين القلوب في أثناء تشريح. الاستفادة من مقص جراحي ة الأوتوكلف وملقط.
    2. القتل الرحيم الفئران في 12 أسبوعا من العمر أو أكثر عن طريق جرعة زائدة من الايفورلوران، واتبع مع خلع عنق الرحم.
    3. بدلا من ذلك، لعزل ة الليفية المنشطة، حث احتشاء عضلة القلب في الفئران 12 أسبوع من العمر عن طريق ربط الشريان التاجي10. القتل الرحيم الفئران 8-10 أيام بعد الإصابة.
    4. الجسم رذاذ مع الإيثانول 70٪ والشرقية حتى الجانب البطني يواجه المجرب. قم بتثبيت الزوائد أو تقييدها لمنع التداخل.
    5. قطع الجلد والعضلات في البطن مفتوحة ولكن تجنب ثقب الكبد. قطع عموديا نحو القص, وفتح الصدر بعناية مع تجنب ثقب القلب. الاستمرار في قطع من خلال القفص الصدري لفضح القلب.
    6. باستخدام ملقط، ارفع القلب برفق من الصدر، وقص أي رئة أو أنسجة زائدة متصلة بالجزء الخارجي من القلب. إزالة البطين ومكان في بئر واحد من 6 لوحة جيدة مع KHB الباردة. الاستمرار في تشريح القلوب بهذه الطريقة حتى تم عزل جميع العينات.
  3. التفكك الأنزيمي للقلب
    1. استخدام ملقط، والضغط مرارا وتكرارا وتحريك القلب في KHB لإزالة الدم الزائد. نقل القلب إلى لوحة معقمة نظيفة 10 سم2. باستخدام شفرة حافة واحدة، بسرعة المفروم القلب إلى قطع صغيرة.
    2. أضف 1 مل من كوكتيل هضم الكولاجين واستمر في التشليل حتى تصبح القطع صغيرة بما يكفي لنقلها مع ميكروبيبات 1 مل. نقل القطع إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع ميكروبيبات 1 مل. غسل لوحة 2x مع 2 مل من كوكتيل هضم الكولاجين.
      ملاحظة: يمكن أن يساعد قطع جزء من طرف الماصة في جمع قطع أكبر من القلب قد تصبح عالقة في طرف الماصة.
    3. احتضان أنبوب مخروطي في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع هزاز أو التحريض. أنبوب آمن حسب الحاجة. إعادة تعليق 10x مع أنبوب 5 مل حتى تكون المحتويات متجانسة، واحتضان أنبوب مخروطي في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع التناوب أو الانفعالات.
    4. إعادة تعليق 10x مع 10 مل الأنابيب حتى متجانسة. قم بإنشاء مصفاة خلية تبلغ 40 ميكرومترًا عن طريق ترطيب الفلتر باستخدام 1-2 مل من المخزن المؤقت KHB فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. إضافة 25 مل من العازلة KHB لتعليق الهضم، وإعادة تعليق، وتصفية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر تستعد. تغيير عامل التصفية حسب الحاجة.
      ملاحظة: كما يبطئ الترشيح، والتنصت طفيفة أنبوب أو باستخدام ميكروبيبات 1 مل لرسم تعليق من الجانب السفلي من مرشح يمكن أن تساعد على تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر المحظورة جزئيا.
    5. الطرد المركزي في 400 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 1x RBC العازلة الليسيه (5 مل / القلب). احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    6. الطرد المركزي في 400 × ز وRT لمدة 10 دقيقة. إزالة supernatant ثم غسل عن طريق إعادة تعليق بيليه في 1 مل من العازلة KHB.
    7. إضافة 9 مل من العازلة KHB والتصفية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد 50 مل. الطرد المركزي في 400 × ز وRT لمدة 10 دقيقة.
    8. إزالة supernatant، resuspend في 1 مل من وسائل الإعلام الليفية أو برنامج تلفزيوني، وتحديد عدد الخلية. يمكن عزل الخلايا الليفية بالطرق الثلاث المختلفة الموضحة أدناه.

2. عزل الخلايا الليفية من تعليق الخلية الواحدة

  1. العزلة الليفية: الطلاء التفاضلي(الشكل 1)
    1. إعداد لوحة 6-جيدا عن طريق إضافة 2 مل من وسائل الإعلام الليفية في البئر ويحوم لوحة لتغطية الجزء السفلي جيدا.
    2. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسائل الإعلام لكل قلب. لوحة 1 مل من تعليق الخلية في البئر بحيث يتم مطلي قلب واحد (نظريا) في البئر. على سبيل المثال، سيتم إعادة تعليق ستة قلوب في 6 مل من وسائل الإعلام، ثم مطلي في ستة آبار مع 1 مل من تعليق الخلية لكل بئر.
    3. لوحة دوامة لتوزيع الخلايا بالتساوي. أضف وسائط إضافية من 1 إلى 2 مل لكل بئر لحجم إجمالي يصل إلى 5 مل لكل بئر، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة.
    4. سيتم فصل الخلايا الليفية عن طريق الالتصاق الانتقائي بعد 4 ح. إزالة الخلايا غير المرتبطة والميتة عن طريق إزالة وسائل الإعلام. غسل الخلايا المرفقة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة 2-4 مل وسائط الليفية العقيمة في البئر. احتضان في 37 درجة مئوية حتى confluent. تغيير وسائل الإعلام كل 2-4 أيام.
  2. العزلة الليفية : FACS باستخدام نموذج الماوس مراسل GFP(الشكل 1)
    1. المخزن المؤقت FACS
      1. إعداد 15 مل من 5٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) في dPBS دون Ca2+ وMg2+. تخزينها على الجليد أو عند 4 درجات مئوية.
    2. حل مانع FC
      1. إعداد 0.5 μL FC مانع (تنقية المضادة للفأرة CD16/CD32) في 25 ميكرولتر من FACS (1:50 تخفيف). مطلوب 25 ميكرولتر من محلول مانع FC لكل عينة. تخزينها على الجليد أو في 4 درجة مئوية.
    3. إعداد العينة وتلطيخ الأجسام المضادة
      ملاحظة: يمكن إعداد تخفيفات الأجسام المضادة مسبقًا، ولكن هذا قد يخاطر بالتعرض للضوء أو درجة الحرارة.
      1. إعداد 7AAD أو شبح صبغ البنفسجي 510 وهذا هو 2x التخفيف المطلوب في المخزن المؤقت FACS. انظر الجدول 1 للأجسام المضادة والمخففات.
      2. إعادة تعليق 500،000 الخلايا المعزولة حديثا في 25 ميكرولتر من حل مانع FC لمنع الربط غير محدد من منطقة الأجسام المضادة FC لمستقبلات FC. احتضان لمدة 5 دقيقة في RT.
      3. إضافة 7AAD أو شبح صبغ البنفسجي 510 الأجسام المضادة إلى الحجم النهائي من 25 ميكرولتر من تعليق الخلية. احتضان لمدة 30-60 دقيقة على الجليد في الظلام.
      4. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 500 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      5. إعادة تعليق بيليه في حجم عينة قياس التدفق الموصى به من المخزن المؤقت FACS (300 ميكرولتر) ونقله إلى أنبوب قياس الخلايا المتدفق.
    4. فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS)
      ملاحظة: كانت فئران مراسل GFP-αSMA مساهمة من الدكتور إيفو كالازيكيتش11. هذا الماوس يعبر GFP تحت الخلية العضلية الملساء ألفا (αSMA) المروج. وقد استخدمت αSMA كعلامة على الخلايا الليفية المنشطة (myofibroblasts)12.
      1. لعزلة الخلايا الليفية المنشطة (αSMA التي تعبر عن الخلايا الليفية الليفية) ، حث احتشاء عضلة القلب في 12 من العمر أسابيع GFP-αSMA الفئران عن طريق ربط الشريان التاجي. التضحية الفئران 8-10 أيام بعد الإصابة.
      2. بعد تعليق خلية واحدة من قلوب الفئران المصابة، فرز αSMA+ ve الخلايا الليفية للبروتين الفلوري الأخضر (GFP). استخدم الخلايا الليفية غير الملطخة غير المصابة لتعيين إشارة الخلفية في قناة GFP بعد التعويض.
      3. بوابة ليعيش GFP+ ve الخلايا عن طريق التكبير ل7AAD-ve/GFP+ الخلايا أو خلايا الشبح صبغ البنفسجي 510-ve/GFP+ ve الخلايا وفرز GFP التعبير عن αSMA +ve myofibroblasts. جمع الخلايا في وسائل الإعلام الليفية.
  3. العزلة الليفية: عزل الخلايا الليفية المغناطيسية القائمة على الخلايا الليفية(الشكل 1)
    1. المخزن المؤقت للتوازن
      ملاحظة: قم دائماً بإعداد مخزن مؤقت جديد للعزل.
      1. إعداد 0.5٪ BSA و 2 MM EDTA في برنامج تلفزيوني. إزالة الغاز المخزن المؤقت عن طريق تحريك الحل في حين تعلق فراغ لغطاء الحاوية.
        ملاحظة: التحريك يزيل الغاز الزائد من الحل الذي تتم إزالته بعد ذلك من خلال الفراغ بحيث فقاعات لن تسد عمود الفصل عند الاستخدام.
    2. وضع العلامات المغناطيسية: CD45+ الخلايا الهيماتوبوية
      1. خلايا طرد مركزي معزولة من قلوب الفئران في 500 × ز لمدة 5 دقيقة، ثم إزالة supernatant.
      2. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من عازلة التوازن. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.
      3. الطرد المركزي تعليق الخلية على النحو الوارد أعلاه وإعادة تعليق بيليه الخلية في 90 ميكرولتر عازلة التوازن لكل 1 × 107 الخلايا الإجمالية. أضف 10 ميكرولتر من CD45+ الخرز المغناطيسي لكل 1 × 107 خلايا إجمالية. مزيج جيد واحتضان لمدة لا تقل عن 15 دقيقة في 4°C.
      4. غسل الخلايا عن طريق إضافة 2 مل عازلة التوازن لكل 1 × 107 الخلايا الإجمالية، ثم الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4°C.
      5. إزالة supernatant، عد الخلايا باستخدام مقياس الهيوكتومتر وإعادة تعليق ما يصل إلى 1 × 107 الخلايا الإجمالية في 2 مل من المخزن المؤقت التوازن. إذا كان هناك أكثر من 10خلايا 7، مقياس المخزن المؤقت خطياً. تمرير الخلايا من خلال مرشح 40 ميكرومتر لمنع تجمعات الخلايا من انسداد مصفوفة عمود الفصل.
    3. الفصل المغناطيسي: CD45+ الخلايا الهيماتوبوية
      1. ضع عمود الفصل في المجال المغناطيسي لعمود فاصل وتوازن مناسب مع ما لا يقل عن 3 مل من PBS.
      2. جمع الخلايا غير المسماة في flowthrough (FT)، وغسل العمود 3x مع 3 مل من المخزن المؤقت التوازن. جمع السهو مع FT. إزالة العمود من الفاصل. ضع العمود على أنبوب مخروطي 15 مل.
      3. طرد CD45 المسمى مغناطيسيا+ الخلايا عن طريق pipetting 5 مل من عازلة التوازن على العمود ويغرق بحزم الخلايا مع المكبس الموردة مع العمود.
      4. طرد مركزي eluent وكذلك FT / غسل كسور في 500 × ز. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.
    4. وضع العلامات المغناطيسية والانفصال: CD31+ الخلايا التنظيرية
      1. كرر بروتوكول لCD45+ وضع العلامات المغناطيسية والفصل (الأقسام 2.3.2-2.3.3)، باستثناء استخدام CD31+ الخرز المغناطيسي لاحتضان مع FT وغسل أجزاء منالعزلCD45 + .
    5. العلامات المغناطيسية والانفصال: MEFSK4+ الخلايا الليفية
      1. كرر بروتوكول لCD45+ وضع العلامات المغناطيسية باستخدام MEFSK4 المضادة للتغذية- APC الأجسام المضادة بدلا من الخرز المغناطيسي. الطرد المركزي FT ويغسل أجزاء من CD31+ العزل في 500 × ز لمدة 5 دقيقة، ثم إزالة supernatant. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت للتوازن، وعد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.
      2. أضف 10 ميكرولتر من MEFSK4 المضادة للتغذية-APC الأجسام المضادة لكل 1 × 107 خلايا. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل في 4 درجة مئوية.
      3. غسل الخلايا المنضمة MEFSK4 الأجسام المضادة عن طريق إضافة 5 مل من عازلة التوازن لكل 1 × 107 الخلايا الإجمالية، ثم الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقيقة.
      4. إزالة supernatant وresuspend في الخرز المضادة لAPC، وذلك باستخدام نفس الحجم من MEFSK4 المضادة للتغذية- APC الأجسام المضادة المستخدمة. احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
      5. الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 10 دقيقة. إزالة supernatant، إعادة تعليق في 2 مل من عازلة التوازن لكل 1 × 107 الخلايا الإجمالية، والمضي قدما مع الفصل المغناطيسي كما هو موضح سابقا (القسم 2.3.3). يمكن استخدام الخلايا الليفية المنفصلة مغناطيسيًا MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve في تحليلات النقاء والتطبيقات الأخرى في المصب.-ve

3. النقاء وتحليل وظائف السكان الليفية المعزولة

  1. تحليل نقاء السكان FACS: تحليل خلية αSMA-GFP(الشكل 2)
    1. إعادة تعليق الخلايا المعزولة حديثا في 25 ميكرولتر من محلول مانع Fc لمنع الربط غير محدد من الأجسام المضادة. احتضان لمدة 5 دقيقة في RT.
    2. اختياري: إضافة 25 ميكرولتر من 7AAD أو شبح صبغ البنفسجي 510 إلى تعليق الخلية. احتضان لمدة 30-60 دقيقة على الجليد في الظلام.
    3. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 500 × ز لمدة 5 دقيقة.
    4. إعادة تعليق بيليه في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. إضافة CD31-PE، CD45-APC، والأجسام المضادة AN2/NG2 مباشرة إلى تعليق الخلية. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد(الجدول 1).
    5. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل FACS المخزن المؤقت. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 5 سنوات.
    6. إضافة حمار المضادة للفئران AlexaFluor 405 الأجسام المضادة الثانوية إلى الخلايا المسماة مع الأجسام المضادة الأولية غير المبشور. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    7. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 5 سنوات.
    8. إعادة تعليق بيليه في حجم عينة قياس التدفق الموصى به من المخزن المؤقت FACS (300 ميكرولتر) ونقله إلى أنبوب قياس التدفق المسمى لتحليل التدفق.
      ملاحظة: تحليل FACS لتوصيف تعبير مستضد MEFSK4 على الخلايا الليفية المعزولة موضح في القسم 3.3.
  2. تحليل نقاء الخلايا الليفية: الفلورة المناعية(الشكل 3A)
    1. البذور 30،000 الخلايا الليفية الأولية (P0-P1) في البئر على coverslips وضعت في لوحة 24 جيدا والثقافة حتى 80٪ confluent. أو التركيز على فرز CD45+ وCD31+ الخلايا (30،000 خلية لكل بئر) على قسيمة الغلاف بواسطة cytospin في 400 × × ز (طريقة تستخدم لإيداع الخلايا مباشرة والتساوي على غطاء في لوحة 24 جيدا).
    2. إصلاح الخلايا مع الأسيتون الباردة لمدة 15 دقيقة. غسل 3x مرات مع برنامج تلفزيوني.
    3. كتلة الشرائح في 10٪ مصل الماعز. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها(الجدول 2).
    4. غسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني. احتضان الأجسام المضادة الثانوية ل2 ساعة(الجدول 2).
    5. الشرائح مضادة للبقع، وجبل مع قطرة واحدة من DAPI في وسائل الإعلام المتصاعدة بطيئة تتلاشى.
  3. FACS تحليل النقاء السكاني: MEFSK4 التحقيق(الشكل 3B)
    1. إعادة تعليق الخلايا المعزولة حديثا في 25 ميكرولتر من محلول مانع FC لمنع الربط غير محدد من الأجسام المضادة. احتضان لمدة 5 دقيقة في RT.
    2. اختياري: إضافة 25 ميكرولتر من 7AAD أو شبح صبغ البنفسجي 510 إلى تعليق الخلية. احتضان لمدة 30-60 دقيقة على الجليد في الظلام.
    3. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 500 × ز لمدة 5 دقيقة.
    4. إعادة تعليق بيليه في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. إضافة MEFSK4 الأجسام المضادة مباشرة إلى تعليق الخلية. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد (الجدول 1).
    5. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 5 سنوات.
    6. إضافة الجرذ IgG-APC إلى الخلايا(الجدول 1). احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    7. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 5 سنوات.
    8. إعادة تعليق بيليه في حجم عينة قياس التدفق الموصى به من المخزن المؤقت FACS (300 ميكرولتر) ونقل لتدفق أنبوب القياس الخلوي لتحليل التدفق.
  4. تحليل نقاء الخلايا الليفية: شبه كمي في الوقت الحقيقي rtPCR(الشكل 3C)
    1. عزل الجيش الملكي النيبالي وشبه كمي PCR في الوقت الحقيقي
    2. بعد إثراء الخلايا الليفية ، عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة العزل الجيش الملكي النيبالي (انظر جدول المواد). اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
    3. استكمال أول توليف الحمض النووي حبلا باستخدام مجموعة التوليف cDNA (انظر جدول المواد)،وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. تنفيذ شبه كمي في الوقت الحقيقي PCR5.
  5. تحليل وظائف الليفية: تحليل الكولاجين هلام انقباض(الشكل 4)
    1. محلول الكولاجين
      1. إعداد 20 MM HEPES و 44 MM NaHCO3 في DMEM. إضافة 1.67 ملغ من نوع 1 الكولاجين الفئران لكل 1 مل من DMEM مع HEPES وNaHCO3.
    2. TGFа المكمل DMEM
      1. إعداد 10٪ FBS في DMEM تكملها المضادات الحيوية والمضادة للفطريات. إضافة TGFа إلى تركيز نهائي من 1 نانوغرام / مل.
    3. خلية / خليط الكولاجين والطلاء
      1. إعداد تعليق الخلية (P3-P5) وتحديد الحجم المطلوب للحصول على 3.3 × 105 خلايا.
      2. إضافة حجم تعليق مع 3.3 × 105 خلايا إلى ما يكفي من محلول الكولاجين للحصول على 1 مل الحجم الإجمالي.
        ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الكولاجين من النوع 1 1 الآن 1.5 ملغم/مل.
      3. في لوحة بئر 48، البذور 300 ميكرولتر من مزيج الكولاجين الخلية لكل بئر (~ 1 × 105 خلايا / جيد). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة حتى هلام.
      4. استخدم إبرة 30 G للمساعدة في فصل الجل عن جدران البئر. إضافة 600 ميكرولتر من TGFа وFBS مكملة DMEM إلى كل بئر. لوحات الصور على الماسح الضوئي العاكسة في 24 ساعة و 48 ساعة.
        ملاحظة: أجريت جميع تجارب الفلورسينس المناعي على آلة قياس خلايا التدفق مجهزة بثلاثة أشعة ليزر (405 نانومتر و488 نانومتر و640 نانومتر). تم الحصول على البيانات باستخدام برنامج الحصول على بيانات التدفق(جدول المواد). وأُجري مزيد من تحليل البيانات باستخدام برامجيات تحليل بيانات التدفق. AlexaFluor 405 والشبح صبغ البنفسجي 510 كانت متحمسة مع ليزر 405 نانومتر وجمعها باستخدام 450/50 BP و 525/50 BP مرشح، على التوالي. كانت GFP و PE متحمسة بليزر 488 نانومتر وتم جمعها باستخدام مرشحات 530/30 BP و 575/26 BP ، على التوالي. أما APC أو AlexaFluor 647 كان متحمسا من قبل 640 نانومتر الليزر وجمعها باستخدام مرشح 670/14 BP. تم إجراء جميع تجارب فرز الخلايا على آلة قياس الخلايا المتدفقة(جدول المواد)المجهزة بأربعة أشعة ليزر (405 نانومتر و488 نانومتر و561 نانومتر و640 نانومتر). 7-AAD كان متحمسا باستخدام ليزر 561 نانومتر وجمعها مع مرشح 670/14 BP. تم جمع GFP وGhost Dye Violet 510 باستخدام نفس تركيبات الليزر / التصفية كما هو موضح أعلاه. استخدمت جميع تجارب الفرز فوهة 100 أم مع تكوين ضغط 17 psi لزيادة قابلية استمرارية المصب للخلايا المستهدفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تدفق نظام الجاتينغ الذي يظهر عزل myofibroblast باستخدام فئران مراسل αSMA-GFP
وأظهرت قلوب غير مصاب لا يمكن الكشف عنها GFP+ الخلايا في αSMA-GFP نموذج الماوس مراسل; وبالتالي ، تم استخدامها لإنشاء بوابة لإشارة خلفية قناة GFP بعد التعويض(الشكل 2). تم فرز αSMA+ الخلايا على أساس وجود التعبير GFP من البطين الأيسر المصاب بعد 10 أيام من MI. نسبة صغيرة من الخلايا التنظيرية (GFP+/CD31+ ؛ SD = 3.8% ± 0.0164; ن = 5) وخلايا الدم (GFP+/CD45+ ؛ SD = 3.18% ± 0.0112; ن = 5) الخلايا كما أعرب GFP في قلوب الفئران αSMA-GFP المصابة(الشكل 2A). ومع ذلك، GFP+/CD31-/CD45-الخلايا لم تعبر AN2، علامة pericyte.

الخلايا غير المصابة (هادئة) والمصابة (تنشيط، αSMA+GFP +) أعرب عن علامات الخلايا الليفية
الخلايا GFP + معزولة عن الفئران αSMA-GFP أعرب αSMA، الكولاجين نوع 1 سلسلة ألفا-1 (COL1α1)، فيمنتين، والبيريوستين عند تحليلها من قبل تحليل IF. الخلايا الليفية غير المصابة المعزولة عن طريق الالتصاق الانتقائي أعرب vimentin ولكن لم تثبت التعبير عن علامات الليفية تنشيط: αSMA، periostin، وCOL1α1(الشكل 3A). كل من الخلايا الليفية غير المصابة والمنشطة أعرب عن مستضد MEFSK4 عند تحليلها من قبل تحليل التدفق(الشكل 3B). معزولة مغناطيسيا MEFSK4 + الخلايا من قلوب الفئران غير المصابة أعرب عن علامات الخلايا الليفية: Col1a1، pdgfrα، والبيريوستين. وعلى النقيض من ذلك، كان للخلايا الإيجابية CD45 و CD31 المعزولة مغناطيسياً تعبير لا يذكر عن علامات الليفية.

أظهرت الخلايا الليفية والخلايا الليفية القدرة على التعاقد الكولاجين
في زراعة الخلايا على البلاستيك قاسية، وقد ثبت الخلايا الليفية لعقد المواد الهلامية الكولاجين في وجود TGFа، مما يدل على قدرتها الوظيفية من الانكماش13،,14. هذه السمة المختبرية للخلايا الليفية تشبه إلى حد كبير تقلص الأنسجة الضامة الذي يحدث أثناء إصلاح الأنسجة وكذلك العمليات البيولوجية الأخرى. أظهرت كل من الخلايا الليفية غير المصابة ، المعزولة عن طريق الالتصاق الانتقائي ، والخلايا المتعددة الخلايا ، المعزولة والمصنفة من فئران αSMA-GFP ، قدرة على التعاقد مع الكولاجين(الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي لعزلة الخلايا الليفية باستخدام ثلاثة نهج مختلفة. (A)الطلاء التفاضلي،(B)GFP + فرز الخلايا من الخلايا الإيجابية αSMA، و(C)عزل الخلايا الليفية على أساس البزة المغناطيسية. تمثيل حقل مشرق من الخلايا في الثقافة بعد الطلاء التفاضلية. مقياس شريط = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحليل FACS للخلايا المفردة المعزولة عن قلوب فئران αSMA-GFP بعد MI. (أ)مخطط الجاتينغ التمثيلي لنظام مراقبة الأصول الميدانية الذي يبين أن خلايا GFP+ تشارك في التعبير عن CD31 أو CD45 أو AN2 من فئران αSMA-GFP المصابة بالقلوب بعد 10 أيام من احتشاء عضلة القلب (MI). (ب)التحديد الكمي الرسومي لبيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية المقدمة لقلوب ما بعد الـ MI؛ ن = 5 تجارب أجريت بشكل مستقل (***p < 0.0001 كما تم حسابها باستخدام ANOVA أحادية الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة من Tukey). وهذا الرقم مقتبس من ساراسواتي وآخرين10. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليلات نقاء الخلايا الليفية المعزولة عن قلوب الفئران غير المصابة والمجروحة. (أ)تلطيخ الفلور المناعي لتجمعات الخلايا (P0) من قلب فئران αSMA-GFP غير المصابة التي تم فرزها بواسطة FACS. كل من الخلايا غير المصابة والمنشطة التعبير عن علامات الليفية (FB)، مثل COL1α1، وفيمنتين، ولكن ليس علامة الهيماتوبوية CD45 أو علامة الفيوتيليال CD31. الخلايا المعزولة من المصابين αSMA-GFP الفئران القلب أعرب عن علامات الليفية المنشط، αSMA، والبيريوستين، والتي لم تكن موجودة في الخلايا المعزولة من قلوب الفئران غير المصابة. كانت النوى ملطخة DAPI، ن = 3 تم إجراء التجارب بشكل مستقل. مقياس شريط = 100 ميكرومتر (B) ممثل FACS تراكب الرسم البياني للخلايا الليفية غير المصابة والمنشطة (P3-P5) التي تظهر تعبير علامة الليفية MEF-SK4. للسيطرة السلبية، تم استخدام الفئران IgG، ن = 2 أجريت التجارب بشكل مستقل. (C)تغيير أضعاف النسبية من Col1α1، Pdgfrα،ونصوص Postn في الخلايا الليفية MEKSK4+ve غير المصابة، ن = 3 تم تنفيذ التجارب بشكل مستقل (* p < 0.05 كما تحسب باستخدام ANOVA في اتجاهين مع اختبار المقارنات متعددة Tukey). (أ) و (باء) مقتبسان من ساراسواتي وآخرين10. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التوصيف الوظيفي للخلايا الليفية المعزولة عن قلوب الفئران غير المصابة والمجروحة. شخصية تمثيلية لتقلص هلام الكولاجين في وجود αSMA المنشط غير المصاب والمصاب+ الخلايا الليفية (P3-P5). يمثل الرسم البياني النسبة المئوية للتغير في منطقة الجل الأولية بعد 24 ساعة و 48 ساعة من الانكماش عند احتضانها مع αSMA المنشط غير المصاب ة والمصابة+ الخلايا الليفية ، تم إجراء n = 2 تجارب بشكل مستقل. وهذا الرقم مقتبس من ساراسواتي وآخرين10. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جسم هدف الخلية التخفيف
7AAD الخلايا الميتة 1:1000
شبح صبغ البنفسجي 510 الخلايا الميتة 1:1000
APC-CD45 الخلايا الهيماتوبوية 1:200
PE-CD31 الخلايا الاندوليلية 1:200
مكافحة AN2/NG2 بيريسيتس 1:11
حمار المضادة للفئران اليكسا فلور 405 الأجسام المضادة الثانوية 1:100
الخلايا المضادة للتغذية-APC (MEFSK4) الخلايا الليفية 1:100
الجرذ IgG-APC التحكم في النمط ISOtype 1:100

الجدول 1: أصباغ القوات المسلحة الكونغولية والأجسام المضادة.

الأجسام المضادة الأولية التخفيف
α- الملساء العضلات actin (αSMA) 1:1000
الليفية بروتين محدد 1 (FSP1)1:250 1:100
COL 1α1 1:1000
بيريوستين 1:100
فيمنتين 1:200
CD31 1:250
CD45 1:250
الأجسام المضادة الثانوية التخفيف
الماعز المضادة للفأرة اليكسا فلور 488 1:200
الماعز المضادة للأرنب FITC 1:200
الماعز المضادة للأرنب Cy3 1:200
الماعز المضادة للفئران اليكسا فلور 488 1:200
الماعز المضادة للفئران اليكسا فلور 647 1:200

الجدول 2: الأجسام المضادة الأولية والثانوية للفلور المناعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخلايا الليفية هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا، تم تحديدها من قبل مجموعة متنوعة من العلامات. علامات البروتين التي تم استخدامها لتحديد الخلايا الليفية هي مستقبلات المجال discoidin 2 (DDR2)، فيفينكتين، vimentin، الكولاجين الأول والثالث، وThy115،,16،,17،,18،,19،,20. في حين تم استخدام vimentin لتحديد الخلايا الليفية القلبية غير المصابة ، تم إثبات بروتين الليفي الخاص 1 ، αSMA ، والبيريوستين لتحديد الخلايا الليفية المنشطة الناجمة عن الإصابة ، مع وجود αSMA العلامة الأكثر شيوعًا للكشف عن الخلايا الليفية المنشطة6،12،21. بالإضافة إلى ذلك، وقد اكتسبت البروتينات Tcf21 وMEFSK4 الاعتراف مؤخرا في الاعتراف على حد سواء الخلايا الليفية هادئة وجدت في أنسجة القلب غير المصابة، فضلا عن الخلايا الليفية المنشطبما في myofibroblasts وجدت في قلوب الفئرانالمصابة 21،22.

يستخدم هذا البروتوكول ثلاثة مقاربات مختلفة لعزل وإثراء الخلايا الليفية والخلايا الليفية المنشطة بما في ذلك الخلايا الليفية. يتم استخدام قدرة الخلايا الليفية على الالتزام بالبلاستيك بشكل تفضيلي في النهج الأول للعزل. بعد الهضم الأنزيمي مع liberase ، يتم بذر تعليق الخلية الواحدة للخلايا على طبق بلاستيكي للالتزام بشكل تفضيلي. عدم قدرة العديد من الخلايا غير الليفية على التمسك سطح البوليسترين من أطباق بيتري يسمح لنا لإزالة جميع وسائل الإعلام من الطبق والبقاء مع السكان نقية نسبيا من الخلايا الليفية. تحذير من استخدام هذه التقنية على الرغم من أن الخلايا الليفية سوف تلتزم بشكل تفضيلي طبق البوليسترين، بعض الخلايا الملوثة غير الليفية قد نعلق أيضا، وترك السكان غير متجانسة من الخلايا.

تستخدم تقنية العزل الثانية FACS لفصل αSMA الذي يعبر عن الخلايا الليفية من الخلايا الأخرى. في نموذج الفأر المعدل ة وراثيا المستخدمة هنا، يتم التعبير حصرا GFP جنبا إلى جنب مع αSMA، لذلك يمكن الكشف عن myofibroblasts التي تحتوي على αSMA بواسطة جهاز FACS من خلال قدرات الفلورسنت من GFP. هذا الإجراء عزل تمكننا من الحصول على مجموعة من الخلايا التي هي ما يقرب من 99٪ myofibroblast. وقد وصفت تحليلات نقاء هذه الخلايا على نطاق واسع من قبل ساراسواتيوآخرون.

تقنية العزل الثالثة هي طريقة فعالة لعزل الخلايا الليفية غير المصابة والمنشطة عن طريق الفصل المغناطيسي القائم على البزة من MEFSK4 التعبير عن الخلية. من خلال السماح لتعليق خلية واحدة لربط لمكافحة CD45 ومكافحة CD31 الخرز المغناطيسي وتصبح مشلولة في مصفوفة بسبب تأثيرات المجال المغناطيسي، وهذا سمح بفصل أي خلايا الدم وكذلك الفيوليلية التي قد تكون ملوثة عزل الخلايا الليفية. كما MEFSK4 وقد استخدمت مؤخرا كعلامة موثوق بها لتحديد الخلايا الليفية، وهو الأجسام المضادة التي من شأنها أن تربط MEFSK4 الخلايا التعبيرية قادرة على تطبيقها. بعد ربط البزة المغناطيسية للجسم المضاد ، وخلق مجمع يسمح لعزل الخلايا الليفية ، يتم تمرير مجمع خلية الخلايا المنمغنطية من خلال مصفوفة في مجال مغناطيسي ، ويتم الحصول على مجموعة من الخلايا الليفية عالية التخصيب. يجب تقييم نقاء مجموعة الخلايا الليفية المعزولة عن طريق التلطيخ المناعي ، وRTPCR ، وتحليلات قياس التدفق الخلوي.

كما هو الحال مع أي تقنية أخرى، هناك قيود مع التقنيات الموصوفة في هذه المخطوطة. الحد من بروتوكول الالتصاق الانتقائي والعزلة المغناطيسية المستندة إلى البزة هو أن هذه الأساليب لا تفرق بين الخلايا الليفية الهادئة والمنشطة. من أجل إثراء الخلايا الليفية المنشطة ، يجب إجراء العزلة بعد 8-10 أيام بعد احتشاء عضلة القلب. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم التحقق من نقاء العزلة مع علامات الليفية الأخرى. وقد ثبت MEFSK4 السلبية النقاء الليفيفقط من قبل RTPCR، فمن المستحسن لاختبار (عن طريق تحليل الخلايا المناعة وتدفق) مع علامات الليفية وعلامات أخرى تعترف تلوث أنواع الخلايا بما في ذلك hematopoietic (CD45)، الاندوثيوليال (CD31)، وpericytes (AN2). إذا كان ذلك ممكنا، يمكن استخدام علامات أخرى محددة الخلايا الليفية لمزيد من الفرز أو عزل مغناطيسيا السكان الخلايا الليفية.

استخدام الفئران αSMA-GFP لعزل وفرز myofibroblasts هو تقنية موثوق بها للحصول على السكان الخلايا الليفية تنشيط. ومع ذلك ، لوحظت نسبة مئوية لا تذكر من الخلايا الدمية والفيوذيلية في تحليل التدفق. لتحسين هذه التقنية، يجب استبعاد خلايا CD45+ve/CD31+ve وAN2+ve من فرز الخلايا GFP+ve/αSMA+ve. نظرًا لأن αSMA علامة مقبولة على نطاق واسع من الخلايا المتعددة الخلايا الليفية ، فإن نموذج فأر ة مراسل αSMA-GFP هو أداة قيمة يجب استغلالها لدراسة الخلايا المتعددة الخلايا العضلية في سياق إصابات عضلة القلب.

هناك العديد من الخطوات الهامة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار. يمكن تقليل وقت الهضم إذا تأثرت قابلية الخلية والعائد. لا ينبغي استخدام شريط التحريك لتحريك خليط الهضم ، لأن هذا يؤثر على صلاحية الخلية. يجب تأمين الأنبوب على الروك أو في حاضنة تهتز لتحريض خليط الهضم بلطف. إعادة تعليق الأنسجة المهضومة 10x مع 5 مل أو 10 مل ماصة أمر بالغ الأهمية لتفكك السليم من الخلايا.

يجب استخدام تحلل خلايا الدم الحمراء المناسبة لتعليق الخلية الواحدة إذا كانت الخلايا سيتم فرزها أو تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. لعزلة المنزّه المغناطيسية، فإن إزالة الغازات عن العازلة أمر ضروري لمنع إدخال أي فقاعات هواء في العمود. لا ينبغي إعادة استخدام العمود المستخدم لعزل خلية البزة المغناطيسية بين الخلايا المترافقة بالمواد المغناطيسية المختلفة. على سبيل المثال، يجب استخدام عمود جديد لفصل خلايا CD45+ ، والتي يجب تجاهلها بعد إلطيل خلايا CD45+ ، ثم واحدة جديدة لعزل الخلايا CD31+ . في أيدينا، ونحن لم نر تلوث pericytes في الخلايا الليفية معزولة / فرزها. ومع ذلك ، وقد ثبت MEFSK4 للاعتراف pericytes22. ولذلك فمن المستحسن استخدام خطوة إضافية لفرز / استنفاد المغناطيسي pericytes (AN2) من الخلايا المفردة. على الرغم من أن هذا البروتوكول تم التحقق من صحة في الفئران 12 أسبوع من العمر، يمكن استخدام هذه التقنية للفئران الأصغر سنا أو الأكبر سنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

يريد المؤلفون أن يشكروا الدكتور إيفو كالازيكيتش على فئران αSMA-GFP. تم دعم البحوث المبلغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة R01GM118300 (S.S.) ، المعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية في المعاهد القومية للصحة تحت رقم الجائزة R21EB019509 (P.P.Y.)، ومنحة تنمية العلماء من جمعية القلب الأمريكية تحت رقم الجائزة 17SDG33630187 (S.S.). تم إجراء تحليلات قياس التدفق الخلوي في الموارد المشتركة VUMC Flow Cytometry Shared resource التي يدعمها مركز فاندربيلت إنغرام للسرطان (P30 CA68485) ومركز أبحاث أمراض الجهاز الهضمي فاندربيلت (DK058404).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) Sigma Aldrich A9528
Bovine Serium Albumin (BSA) Sigma 9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES Life technologies 11330057
Dnase I(20U/mL) BioRad 7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ Gibco 13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technologies 16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-023-CV
1M HEPES Corning 25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder Sigma K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) Invivogen ant-mpp
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer Miltenyi 130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) Molecular Probes A1310 dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC BD Bioscience 559864 dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE BD Bioscience 553373 dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31 BD Biosciences 553370 dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45 BD Biosciences 553076 dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1 MD Bioproducts 203002 dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) Tonbo Biosciences 13-0870 dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11029 dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3 Southern Biotech 4050-02 dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC Jackson Immunoresearch Laboratories 711-165-152 dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647 Thermo-Fisher A21247 dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin Santa Cruz SC67233 dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin Sigma Aldrich V2258 dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA) Sigma Aldrich A2547 dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1) Millipore 07-2274 07-2274 dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-052-301
CD31 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) Miltenyi Biotec 130-102-900 dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads Miltenyi Biotec 130-090-855
Rat IgG-APC Miltenyi Biotec 130-103-034 dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405 Abcam ab175670 dilution = 1:100
anti-AN2/NG2 Miltenyi Biotec 130-097-455 dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter Thermo Scientific 723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish Corning 430167
10 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11E
40 µm Cell Strainer Fisherbrand 22363547
5 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11D
50 mL Conical Tube Falcon 352070
6-well Plate Corning 3506
Flow Cytometry Tubes Falcon 352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade PAL 62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit Qaigen 74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit Ambion AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit BioRad 1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  2. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  3. Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
  4. Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
  5. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
  6. Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
  7. Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
  8. Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
  9. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  10. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
  11. Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
  12. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  13. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  14. Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
  15. Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
  16. Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
  17. Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
  19. Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
  20. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
  21. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  22. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).

Tags

علم الأحياء، العدد 157، العزلة، αSMA، الفلورسينس تنشيط فرز الخلايا، الخلايا الليفية، myofibroblast، هلام الكولاجين، الفلورة المناعية، MEFSK4
عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Melzer, M., Beier, D., Young, P. P., … More

Melzer, M., Beier, D., Young, P. P., Saraswati, S. Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts. J. Vis. Exp. (157), e60909, doi:10.3791/60909 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter