Summary
Получение чистой популяции фибробластов имеет решающее значение для изучения их роли в восстановлении ран и фиброза. Описанный здесь подробный метод для изоляции фибробластов и миофибробластов от невредимых и поврежденных сердцах мыши с последующей характеристикой их чистоты и функциональности с помощью иммунофлюоресценции, RTPCR, флуоресценции при содействии сортировки клеток, и коллагеновый гель сжатия.
Abstract
Сердечный фиброз в ответ на травму является физиологической реакцией на заживление ран. Были предприняты усилия по изучению и целевой фибробластных подтипов, которые смягчают фиброз. Тем не менее, фибробластисследования исследования были затруднены из-за отсутствия универсально приемлемых фибробластных маркеров для выявления тихих, а также активированных фибробластов. Фибробласты являются гетерогенной популяцией клеток, что затрудняет их изоляцию и характеристику. Представленный протокол описывает три различных метода обогащения фибробластов и миофибробластов от невредимых и травмированных мышей сердца. Использование стандартного и надежного протокола для изоляции фибробластов позволит изучить их роли в гомеостазе, а также модуляцию фиброза.
Introduction
Сердечные фибробласты, клетки мезенхимального происхождения, играют значительную роль в поддержании электрической проводимости и механических сил в сердце в дополнение к поддержанию сердечной архитектуры во время гомеостаза1. После травмы, эти клетки активируются, расширяются и производят внеклеточные матрицы (ECM) белки2. Многие доклинические исследования показали фибробластов в качестве критических клеточных регуляторов, которые поддерживают структурную целостность поврежденного сердца3, а также основные клетки-эффекторы, ответственные за бесконтрольное производство и осаждение белков ECM, что приводит к жесткому образованию рубцов исердечной недостаточности 4. Фибробласты являются неоднородной группой клеток, что затрудняет вскрытие их репаративной функции от профиброзных неадаптивных свойств. Недавно была определена функциональная неоднородность двух различных подтипов фибробластов после травмы миокарда, что указывает на возможность изоляции различных подтипов фибробластов и изучения их роли в заживлении ран5.
Получение чистой популяции фибробластов имеет решающее значение в делении их функциональной роли в ремонте и фиброзе. Тем не менее, наличие нескольких фибробластных маркеров, которые признают другие типы клеток, делает его сложным, чтобы изолировать существенно чистую популяцию фибробластов6. Несколько элегантных исследований разработали умные способы изолировать сердечные фибробласты от невредимых и травмированных миокарда. Наиболее популярным и устоявшимся методом обогащения фибробластов является селективная адгезия после ферментативного пищеварения7.
Кроме того, флуоресценция активированных клеток сортировки (FACS) фибробластов на основе поверхностных антигенов клеток была успешно описана8. В исследовании, после ферментативного пищеварения, мезенхимальные клетки были отсортированы как линейные-отрицательные (Lin: Ter119-CD45-CD31)и gp38-положительный (gp38)от сердца мыши. Gp38+ve клетки были подтверждены фибробласты на основе их совместного выражения col1 "1 и других мезенхимальных маркеров. Хотя большинство переваривания тканей завершена после вскрытия желудочка в чашке Петри, недавнее исследование исследовало использование прямого фермента иглы перфузии левого желудочка, чтобы изолировать миоциты и не миоциты, которые включают фибробласты9. Фибробласты были затем изолированы селективной сливки в этом случае.
Этот протокол описывает изоляцию и обогащение фибробластов тремя методами. Первый метод, включающий селективное сливование фибробластов после ферментативного пищеварения. Второй метод используется в первую очередь изолировать травмы индуцированной альфа-гладкой мышцы, выражающие myofibroblasts. Третий метод включает в себя последовательное, магнитное истощение фермент-переваренной сердечной суспензии гематопогетических и эндотелиальных клеток. После истощения фибробласты/миофибробласты выделены на основе присутствия антигена MEFSK4 с использованием магнитных бусинок. Недавно MEFSK4 был описан как антиген, присутствующий на тихих, а также активированных фибробластов, что делает его подходящим маркером для идентификации и изоляции фибробластов. Естественно, все описанные здесь методы имеют уникальные ограничения. Поэтому настоятельно рекомендуется проверить чистоту изолированной популяции клеток с помощью анализа потока, иммуноанализа и полуколичественного ПЦР в реальном времени. Тем не менее, эти методологии могут быть расширены, и дополнительные маркеры могут быть добавлены для того, чтобы исключить другие загрязняющие популяции до использования фибробластов и миофибробластных популяций для важнейших экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование строго соответствует рекомендациям, содеяняёмым в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Комитет по институциональному уходу и использованию животных Университета Вандербильта утвердил протокол (протокольный номер: M1600076-01).
1. Рассечение сердца
- Подготовка решения
- Буфер KHB
- Используя перемешивание бар, медленно растворить 9,4 г Krebs-Henseleit буфера (KHB) порошок в 900 мл воды DDI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер будет осаждать, если перемешивают слишком быстро или слишком долго. Буфер KHB должен быть холодным во время изоляции фибробластов. - Добавьте 2,9 мМ CaCl2 и 24 mM NaHCO3. Отрегулируйте рН до 7,2-7,3 и разбавьте до объема 1 л с dH2O.
- Используя стерильный фильтр (0,22 мкм), храните при 4 градусах По Цельсию до 4 недель. Держите на льду или при 4 градусах По Цельсия в течение длительности изоляции.
- Используя перемешивание бар, медленно растворить 9,4 г Krebs-Henseleit буфера (KHB) порошок в 900 мл воды DDI.
- Коктейль для пищеварения коллагенеза
- Приготовьте коктейль для пищеварения в день фибробластной изоляции. Определить соответствующий объем пищеварения коктейль в зависимости от количества сердец; 5 мл коктейля на 1 сердце.
- Приготовьте смесь коллагеназа (см. Таблица материалов)и DNase I в соответствии с инструкциями производителя.
- Для 20 мл всего коктейля пищеварения добавьте 17,5 л DNase I, 180 л 1 M HEPES и 500 л коллагеназы к пустой конической трубке 50 мл.
- Добавьте достаточный объем раствора сбалансированной соли Хэнка (HBSS) с Ca2 и Mg2,5, чтобы получить общий объем 20 мл.
- Резерв лизации красных кровяных телец (РБК)
- Определить общий объем, необходимый на основе количества сердец (5 мл/сердце). Разбавить 10x РБК лисис овый буфер до 1x с помощью dH2O.
- Фибробласт СМИ: 10% FBS в DMEM F-12
- Добавьте 10% FBS в DMEM-F12 с L-глютамином и HEPES. Добавьте 10 U/mL пенициллина/стрептомицина, 2,5 мкг/мл противогрибковых, и 2,5 мкг/мл микоплазмы профилактика (см. Таблица материалов). Хранить при 4 градусах по Цельсию.
- Буфер KHB
- Вскрытие сердца
- Подготовьте 6 хорошо пластины на льду с 2 мл холодного KHB в колодец для хранения сердца во время вскрытия. Используйте автоматические хирургические ножницы и щипцы.
- Эвтаназия мышей в возрасте 12 недель и старше от передозировки изофлуран, и следовать с вывихом шейки матки.
- Кроме того, для активированной фибробластной изоляции, индуцировать инфаркт миокарда у 12 недельных мышей путем перевязки коронарной артерии10. Эвтаназия мышей 8-10 дней после травмы.
- Спрей тела с 70% этанола и ориентироваться так брюшной стороне сталкивается с экспериментатором. Прикрепите или ограничиваем придатки для предотвращения помех.
- Вырезать брюшной кожи и мышцы открыты, но избежать пирсинга печени. Вырезать вертикально к грудине, и осторожно открыть грудную клетку, избегая пирсинга сердца. Продолжайте прорезать грудную клетку, чтобы разоблачить сердце.
- Используя щипкания, аккуратно поднимите сердце из груди, отрезав любые легкие или излишки ткани, прикрепленные к внешней стороне сердца. Снимите желудочек и поместите в один колодец 6 хорошо пластины с холодной KHB. Продолжайте вскрывать сердца таким образом, пока все образцы не будут выделены.
- Энзиматная диссоциация сердца
- Используя щипчи, неоднократно сжимайте и агитируют сердце в КХБ, чтобы удалить избыток крови. Перенесите сердце в чистую стерильную10 см 2 пластины. Используя одно краевое лезвие, быстро фарш сердца на мелкие кусочки.
- Добавьте 1 мл коктейля для пищеварения коллагеназа и продолжайте измельчать до тех пор, пока кусочки не будут достаточно малы, чтобы передать с помощью микропипетта мощностью 1 мл. Перенесите части в коническую трубку 50 мл с микропипетом 1 мл. Вымойте тарелку 2x с 2 мл коктейля с пищеварением коллагенеза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрезка часть пипетки отзыв может помочь собрать большие куски сердца, которые в противном случае могут застрять в кончике пипетки. - Инкубировать коническую трубку при 37 градусах По Цельсию в течение 30 минут с раскачиванием или возбуждением. Безопасная трубка по мере необходимости. Отрежь 10x с трубкой 5 мл до тех пор, пока содержимое не станет однородным, и инкубируйте коническую трубку при 37 градусах По Цельсию в течение 15 минут с вращением или возбуждением.
- Отдохните 10x с трубой 10 мл до однородной. Премьер 40 мкм ячейки ситечко путем смачивания фильтра с 1-2 мл буфера KHB на вершине новой 50 мл конической трубки. Добавьте 25 мл буфера KHB в суспензию пищеварения, отдохните и профильтруйте через загрунтованный ситечко 40 мкм. Изменение фильтра по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как фильтрация замедляется, слегка нажав трубки или с помощью 1 мл микропайпет, чтобы сделать подвеску из нижней части фильтра может помочь подвески клетки пройти через частично заблокирован 40 мкм ячейки ситечко. - Центрифуга при 400 х г и 4 кв 10 мин. Удалите супернатант и отдохните гранулу в 1x буфере лиза РБК (5 мл/сердце). Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре (RT).
- Центрифуга при 400 х г и RT в течение 10 мин. Удалить супернатант затем промыть, переопродлив гранулы в 1 мл буфера KHB.
- Добавьте 9 мл буфера KHB и процедите через загрунтованный 40 мкм-ситечко в новую коническую трубку 50 мл. Центрифуга при 400 х г и RT в течение 10 мин.
- Удалите супернатант, повторно в 1 мл фибробластных носителей или PBS, и определить номер ячейки. Фибробласты могут быть изолированы тремя различными методами, описанными ниже.
2. Изоляция фибробластов от одноклеточной подвески
- Изоляция фибробластов: дифференциальное покрытие(рисунок 1)
- Подготовка 6-колодцов пластины, добавив 2 мл фибробластных носителей в скважину и закрученного пластины для покрытия нижней части скважины.
- Resuspend клетки в 1 мл средств массовой информации на сердце. Плита 1 мл клеточной подвески в хорошо, что одно сердце (теоретически) в настоящее время покрытием в скважине. Например, шесть сердец будут вновь в 6 мл носителей, а затем покрыны в шесть скважин с 1 мл клеточной подвески на скважину.
- Вихревая пластина равномерно распределяет клетки. Добавьте дополнительные 1-2 мл носителя на скважину при общем объеме до 5 мл на скважину и инкубировать при 37 градусах По цельсии на 4 ч.
- Фибробласты будут разделены селективной сливкой после 4 ч. Удалить неприкрепленные и мертвые клетки путем удаления носителей. Вымойте прикрепленные клетки с 2 мл PBS и добавить 2-4 мл стерильных фибробластных носителей в скважине. Инкубировать при 37 градусах Цельсия до слияния. Меняйте носители каждые 2–4 дня.
- Фибробласт изоляции: FACS с помощью модели мыши репортер GFP (Рисунок 1)
- Буфер FACS
- Подготовка 15 мл 5% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в dPBS без Ca2 "и Mg2". Хранить на льду или при 4 градусах Цельсия.
- Решение блокировщика FC
- Приготовьте блокировщик FC 0,5 л (очищенный антимык CD16/CD32) в 25 Л. FACS (1:50 разбавления). Для одного образца требуется 25 Зл блокаторного раствора FC. Хранить на льду или при 4 градусах По Цельсию.
- Подготовка образцов и окрашивание антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавления антител могут быть подготовлены заранее, но это может привести к воздействию света или температуры.- Подготовка 7AAD или Ghost красителя фиолетовый 510, что в 2 разбавления в буфере FACS. Смотрите таблицу 1 для антител и разбавлений.
- Resuspend 500,000 свежеизолеваемых клеток в 25 Зл блокатор решение для предотвращения неспецифических связывания региона антитела ФК к рецептору FC. Инкубировать в течение 5 мин на RT.
- Добавьте 7AAD или Ghost красителя фиолетовый 510 антитела к окончательному объему 25 Зл клеточной подвески. Инкубировать в течение 30-60 минут на льду в темноте.
- Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
- Повторное удаление гранул в рекомендуемом цитометрии потока объем образца faCS буфера (300 л) и передачи в поток цитометрии трубки.
- Fluorescence-активированная сортировка клеток (FACS)
ПРИМЕЧАНИЕ: GFP-ЗСМА репортер мышей были вклад д-р Иво Kalajzic11. Эта мышь выражает GFP под альфа-гладкой мышечной клетки (ЗСМА) промоутер. ЗСМА используется в качестве маркера активированных фибробластов (миофибробластов)12.- При активированной фибробласте (ЗСМА, выражающей миофибробластную) изоляцию, индуцируйте инфаркт миокарда у 12-недельных мышей ГФП-ЗСМА с помощью вывязки коронарных артерий. Пожертвуйте мышам8-10 дней после травмы.
- После одноклеточной подвески из поврежденных мышей сердца, сортировать фибробласты SMAЗве для зеленого флуоресцентного белка (GFP). Используйте неокрашенные неповрежденные фибробласты для установки фонового сигнала в канале GFP после компенсации.
- Ворота для живых клеток GFPve, gating для 7AAD-ve /GFPциве клетки или Ghost красителя фиолетовый 510-ve/GFPве клетки и сортировать GFP, выражающие зСМАзве myofibroblasts.-ve Сбор клеток в фибробластных носителях.
- Буфер FACS
- Фибробластизоляция: изоляция фибробластов на основе магнитного биса(рисунок 1)
- Буфер равновесия
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда готовьте свежий буфер для изоляции.- Подготовка 0,5% BSA и 2 мМ EDTA в PBS. Дега буфер, перемешивая раствор при присоединении вакуума к крышке контейнера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перемешивание удаляет избыток газа из раствора, который затем удаляется через вакуум, так что пузырьки не будут засорять колонку разделения при использовании.
- Подготовка 0,5% BSA и 2 мМ EDTA в PBS. Дега буфер, перемешивая раствор при присоединении вакуума к крышке контейнера.
- Магнитная маркировка: CD45 - гематопоитические клетки+
- Центрифуга изолированных клеток из сердца мышей на 500 х г в течение 5 мин, а затем удалить супернатант.
- Отрежь пеллетклетки в 1 мл буфера равновесия. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Centrifuge подвески ячейки, как указано выше, и resuspend клеточной гранулы в 90 мл очного буфера на 1 х 107 общих ячеек. Добавьте 10 qL CD45и магнитных шариков на 1 х 107 общих ячеек. Хорошо перемешайте и инкубировать не менее 15 мин при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте клетки, добавив 2 мл буфера равновесия на 1 х 107 общих ячеек, затем центрифуги на 500 х г в течение 10 минут при 4 "C.
- Удалить супернатант, рассчитывать клетки с помощью гемоцитометра и повторно до 1 х 107 всего ячеек в 2 мл буфера равновесия. Если более 107 ячеек присутствуют, масштаб буферливо. Пройдите клетки через фильтр 40 мкм, чтобы предотвратить скопление клеток от засорения матрицы столбца разделения.
- Магнитное разделение: CD45 - гематопоитические клетки+
- Поместите колонку разделения в магнитное поле подходящего сепаратора и уравновештинную колонку с не менее 3 мл PBS.
- Соберите немаркированные ячейки в проточном потоке (FT) и вымойте столбец 3x с 3 мл буфера равновесия. Сбор смается с FT. Удалите столбец из сепаратора. Поместите колонну на коническую трубку 15 мл.
- Промыть магнитно помечены CD45и клетки путем pipetting 5 мл буфера равновесия на колонку и твердо погружая клетки с поршенем поставляется с колонкой.
- Centrifuge eluent, а также FT / мыть фракции на 500 х г. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Магнитная маркировка и разделение: CD31- эндотелиальные клетки
- Повторите протокол для CD45- магнитной маркировки и разделения (разделы 2.3.2-2.3.3), за исключением использования CD31и магнитных бусин оки для инкубации с FT и мытьчасти части от изоляции CD45.+
- Магнитная маркировка и разделение: MEFSK4- фибробласты
- Повторите протокол для CD45- магнитной маркировки с помощью антифидер-APC антитела MEFSK4 вместо магнитных бусинок. Centrifuge FT и мыть части из CD31изоляции на 500 г в течение 5 минут, а затем удалить супернатант. Приостановите действие клеточной гранулы в 1 мл буфера равновесия и подсчитайте клетки с помощью гемоситометра.
- Добавьте 10 зл и л антифидер-APC MEFSK4 на 1 х 107 клеток. Инкубировать не менее 15 мин при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте MEFSK4 связанные клетки антител, добавив 5 мл буфера равновесия на 1 х 107 общих ячеек, затем центрифуги на 500 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и повторно в анти-APC бусы, используя тот же объем MEFSK4 анти-feeder-APC антитела используются. Инкубировать на льду в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию.
- Центрифуга при 500 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант, resuspend в 2 мл буфера равновесия на 1 х 107 общих ячеек, и приступить к магнитному разделению, как описано ранее (раздел 2.3.3). Магнитно разделенные MEFSK4qve/ CD45-ve/CD31-ve фибробласты могут быть использованы для анализа чистоты и других приложений вниз по течению.
- Буфер равновесия
3. Анализ чистоты и функциональности изолированного населения Фибробласта
- Анализ чистоты популяции FACS: анализ клеток SMA-GFP(рисунок 2)
- Resuspend свежеизолированных клеток в 25 Зл блокаторного раствора Fc для предотвращения неспецифических связывания антител. Инкубировать в течение 5 мин на RT.
- Дополнительно: добавьте 25 зл 7AAD или Ghost красителя фиолетовый 510 к суспензии клеток. Инкубировать в течение 30-60 минут на льду в темноте.
- Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин.
- Повторное удаление гранул в 50 злбуферах FACS. Добавьте CD31-PE, CD45-APC и антитела AN2/NG2 непосредственно к клеточной подвеске. Инкубировать в течение 15 мин на льду(таблица 1).
- Вымойте, повторно приостановив в 1 мл FACS буфера. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин.
- Добавить осла анти-крысы AlexaFluor 405 вторичного антитела к клеткам помечены неконъюгированных первичных антител. Инкубировать 30 мин на льду.
- Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин.
- Resuspend гранулы в рекомендуемом потоке цитометрии образец объем буфера FACS (300 л) и передачи на помечены поток цитометрии трубки для анализа потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ FACS для характеристики выражения антигена MEFSK4 на изолированных фибробластах описан в разделе 3.3.
- Анализ чистоты фибробластов: иммунофлуоресценция(рисунок 3A)
- Семена 30000 первичных фибробластов (P0-P1) в хорошо на крышки помещены в 24 хорошо пластины и культуры до 80% слияния. Или концентрируйте+ отсортированные клетки CD45 и CD31+ (30 000 клеток на скважину) на крышке цитоспином при 400 х х г (метод, используемый для вешнейных клеток непосредственно и равномерно на крышку в 24 скважине пластины).
- Исправить клетки с холодным ацетоном в течение 15 мин. Вымойте 3 раза с PBS.
- Блок слайдов в 10% козьей сыворотки. Инкубировать слайды с первичными антителами на ночь(Таблица 2).
- Вымойте слайды 3x в PBS. Инкубировать вторичные антитела для 2 h(Таблица 2).
- Counterstain слайды, и монтировать с одной капли DAPI в медленно угасающих монтажных носителей.
- Анализ чистоты популяции FACS: MEFSK4 зондирование(Рисунок 3B)
- Resuspend свежеизолированных клеток в 25 Л FC блокатор решение для предотвращения неспецифических связывания антител. Инкубировать в течение 5 мин на RT.
- Дополнительно: добавьте 25 зл 7AAD или Ghost красителя фиолетовый 510 к суспензии клеток. Инкубировать в течение 30-60 минут на льду в темноте.
- Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин.
- Повторное удаление гранул в 50 злбуферах FACS. Добавьте антитела MEFSK4 непосредственно в суспензию клеток. Инкубировать в течение 15 мин на льду (таблица 1).
- Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин.
- Добавить крысу IgG-APC в клетки(Таблица 1). Инкубировать 30 мин на льду.
- Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин.
- Resuspend гранулы в рекомендуемом потоке цитометрии образец объем буфера FACS (300 л) и передачи в поток цитометрии трубки для анализа потока.
- Анализ чистоты Фибробласта: полуколичественный rtPCR в реальном времени(рисунок 3C)
- Изоляция РНК и полуколичественные ПЦР в реальном времени
- После обогащения фибробластов изолировать РНК с помощью комплекта изоляции РНК (см. Таблица материалов). Следуйте инструкциям производителя.
- Завершите синтез первой нити ДНК с помощью набора синтеза кДНА (см. Таблица материалов),следуя инструкциям производителя.
- Выполняйте полуколичественные ПЦР в реальном времени.
- Анализ функциональности Фибробласта: анализ контрактности коллагенового геля(рисунок 4)
- Коллагена раствор
- Подготовка 20 мМ HEPES и 44 мМ NaHCO3 в DMEM. Добавьте 1,67 мг крысиного коллагена типа 1 на 1 мл DMEM с HEPES и NaHCO3.
- TGF-дополненный DMEM
- Подготовка 10% FBS в DMEM дополненантибиотики и противогрибковые. Добавьте TGF к окончательной концентрации 1 нг/мл.
- Клеточная/коллагеновая смесь и покрытие
- Подготовьте суспензию клетки (P3-P5) и определите необходимый объем для получения 3,3 х 105 ячеек.
- Добавьте объем подвески с 3,3 х 105 клетками, чтобы достаточно растворколлагена, чтобы получить 1 мл общего объема.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крысиный коллаген типа 1 концентрация должна теперь быть 1,5 мг/мл. - В 48 хорошо пластины, семена 300 л клеточного коллагена смесь в хорошо (1 х 105 клеток / хорошо). Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15-20 мин до гелеобразного.
- Используйте иглу 30 G, чтобы помочь отделить гель от стенок колодца. Добавьте 600 л TGF и FBS, дополненные DMEM к каждой скважине. Изображения на светоотражающем сканере на 24 ч и 48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты иммунофлуоресценции были проведены на цитометрии потока машина оснащена тремя лазерами (405 нм, 488 нм, и 640 нм). Данные были приобретены с помощью программного обеспечения для получения данных потока(Таблица материалов). Дальнейший анализ данных был проведен с использованием программного обеспечения для анализа данных потока. AlexaFluor 405 и Ghost Dye Violet 510 были взволнованы 405-нм лазером и собраны с помощью фильтра 450/50 BP и 525/50 BP, соответственно. GFP и PE были взволнованы 488 нм лазером и собраны с помощью фильтров 530/30 BP и 575/26 BP, соответственно. Либо APC или AlexaFluor 647 был взволнован 640 нм лазером и собран с помощью фильтра 670/14 BP. Все эксперименты по сортировке клеток проводились на цитометрии-машине потока(Таблица материалов),оснащенной четырьмя лазерами (405 нм, 488 нм, 561 нм и 640 нм). 7-AAD был взволнован с помощью 561 нм лазера и собраны с 670/14 BP фильтра. GFP и Ghost Dye Violet 510 были собраны с использованием тех же комбинаций лазера/фильтра, которые описаны выше. Все эксперименты по сортировке использовали сопло 100 мкм с конфигурацией давления 17 psi для повышения жизнеспособности целевых ячеек.
- Коллагена раствор
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема flow gating, демонстрирующая изоляцию миофибробластов с помощью мышей-репортеров ЗСМА-ГФП
Неповрежденные сердца не показали никаких обнаруживаемых GFPи клеток в модели мыши репортера SMA-GFP; следовательно, они были использованы для создания ворот для фонового сигнала канала GFP после компенсации(рисунок 2). Клетки SMAбыли отсортированы на основе наличия экспрессии GFP из поврежденного левого желудочка через 10 дней после МИ. Небольшой процент эндотелиальных (GFP/CD31) клеток; SD - 3,8% и 0,0164; n No 5) и гематоподытические (ГФПЗ/CD45) клетки; SD - 3,18% и 0,0112; n No 5) клетки также выразили GFP в раненых сердцах мыши SMA-GFP(рисунок 2A). Тем не менее, GFP/CD31-/CD45- клетки не выражали AN2, перицитный маркер.
Неповрежденные (quiescent) и поврежденные (активированные, «SMA»GFP) клетки, выраженные фибробластными маркерами
При анализе с помощью анализа анализом IF-аналитики, изолированные от мышей SMA-GFP, высежеванные из мышей SMA-GFP, коллагена типа 1 альфа-1 (COL1'1), виментин и периостин. Неповрежденные фибробласты, изолированные селективным сливом, выражали виментин, но не демонстрировали выражение активированных фибробластных маркеров: ЗСМА, периостин и COL1 ' 1(рисунок 3А). Оба неповрежденных и активированных фибробластов выразил MEFSK4 антиген при анализе анализа потока(рисунок 3B). Магнитно изолированные клетки MEFSK4've из невредимых мышей сердца выразили маркеры фибробластов: Col1a1, pdgfrи, и периостин. В отличие от этого, магнитно изолированные CD45 и CD31 положительные клетки имели незначительное выражение фибробластных маркеров.
Фибробласты и миофибробласты продемонстрировали способность заразиться коллагеном
В клеточной культуре на жестком пластике, фибробласты, как было показано, контракт коллагена гели в присутствии TGF, демонстрируя их функциональные возможности сокращения13,14. Это в пробирке характеристика фибробластов очень похожа на сокращение соединительной ткани, что происходит во время ремонта тканей, а также других биологических процессов. Оба неповрежденных фибробластов, изолированных селективной сливки, и миофибробласты, изолированные и отсортированные из мышей ЗСМА-ГФП, продемонстрировали способность к контракту коллагена (Рисунок 4).
Рисунок 1: Схема изоляции фибробластов с использованием трех различных подходов. (A) дифференциальное покрытие, (B) Сортировка клеток GFP, положительных клеток, и (C)магнитная бисная изоляция фибробластов. Представитель яркого поля клеток в культуре после дифференциального покрытия. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: АНАЛИЗ FACS одиночных клеток, выделенных из сердца мышей SMA-GFP после MI. (A) Представитель FACS gating схема демонстрации GFP-клеток совместного выражения CD31, CD45, или AN2 от мышей ЗСМА-GFP ранения сердца 10 дней после инфаркта миокарда (MI). (B) Графическая количественная оценка представленных данных FACS для пост-MI сердца; n 5 экспериментов были выполнены независимо (кв.п. зли; 0,0001, как рассчитывается с помощью одностороннего ANOVA с тестом tukey на несколько сравнений). Эта цифра адаптирована из Saraswati и др.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Анализ чистоты фибробластов, изолированных от неповрежденных и травмированных мышей сердца. (A) Иммунофлуоресценция окрашивания клеточных популяций (P0) из сердца невредимых, или раненых мышей ЗСМА-GFP отсортированы FACS. Как неповрежденные, так и активированные клетки выражают фибробластные (FB) маркеры, такие как COL1'1 и vimentin, но не гематопойетический маркер CD45 или эндотелиальный маркер CD31. Клетки, изолированные от травмированных mice-sMA-GFP, выражали активированные фибробластные маркеры, ЗСМА и периостин, которые не присутствовали в клетках, изолированных от невредимых сердец мышей. Ядра были окрашены DAPI, n No 3 эксперименты были выполнены независимо. Шкала бар No 100 мкм. (B) Представитель FACS наложения гистограммы невредимых и активированных фибробластов (P3-P5) с указанием фибробластов маркер MEF-SK4. Для отрицательного контроля была использована крыса IgG, n No 2 эксперименты были проведены независимо. (C) Относительная разовая смена Col1'1, Pdgfr ,и Postn стенограммы в невредимых MEKSK4've фибробластов, n No 3 эксперименты были выполнены независимо (P lt; 0,05, как рассчитывается с помощью двустороннего ANOVA с Tukey в нескольких сравнений тест). (A) и (B) адаптированы из Saraswati et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Функциональная характеристика фибробластов, изолированных от невредимых и травмированных мышей сердца. Представительная фигура сокращения коллагена геля при наличии+ неповрежденных и травмированных активированных фибробластов (P3-P5). График представляет собой процентное изменение в исходной области геля после 24 ч и 48 ч сокращения при инкубации с невредимыми и поврежденными активированными зСМАи фибробластами, n no 2 эксперименты были выполнены независимо. Эта цифра адаптирована из Saraswati и др.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Антитела | Целевая ячейка | Разбавления |
| 7AAd | Мертвые клетки | 1:1000 |
| Призрачный краситель фиолетовый 510 | Мертвые клетки | 1:1000 |
| APC-CD45 | Гематопоитические клетки | 1:200 |
| PE-CD31 | Эндотелиальные клетки | 1:200 |
| анти-AN2/NG2 | Перициты | 1:11 |
| Осел анти-крыса Alexa флюор 405 | Вторичные антитела | 1:100 |
| Антикормяные клетки-APC (MEFSK4) | Фибробластов | 1:100 |
| Крыса IgG-APC | Изотипный контроль | 1:100 |
Таблица 1: FACS красители и антитела.
| Первичные антитела | Разбавления | |
| Гладкий мышечный актин (ЗСМА) | 1:1000 | |
| Фибробластспецифический белок 1 (FSP1)1:250 | 1:100 | |
| COL 1'1 | 1:1000 | |
| Периостин | 1:100 | |
| Виментин | 1:200 | |
| CD31 | 1:250 | |
| CD45 | 1:250 | |
| Вторичные антитела | Разбавления | |
| Коза анти-мышь Alexa Fluor 488 | 1:200 | |
| Коза анти-кролик-FITC | 1:200 | |
| Коза анти-кролик-Cy3 | 1:200 | |
| Коза анти-крыса Alexa Fluor 488 | 1:200 | |
| Коза анти-крыса Alexa Fluor 647 | 1:200 | |
Таблица 2: Иммунофлуоресценция первичных и вторичных антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Фибробласты представляют собой неоднородную группу клеток, идентифицированную разнообразным набором маркеров. Белковые маркеры, которые были использованы для идентификации фибробластов являются рецептор домена дискоидин 2 (DDR2), фибронектин, виментин, коллаген I и III, и Thy115,16,17,18,19,20. В то время как vimentin был использован для выявления невредимых quiescent сердечных фибробластов, фибробластов специфический белок 1, ЗСМА, и периостин было показано, чтобы определить травмы индуцированных активированных фибробластов, с ЗСМА является наиболее распространенным маркером для обнаружения активированных фибробластов6,12,21. Кроме того, белки Tcf21 и MEFSK4 получили недавнее признание в признании как тихих фибробластов, найденных в невредимой сердечной ткани, а также активированных фибробластов, включая миофибробласты, найденные в поврежденных сердцах мыши21,22.
Этот протокол использует три различных подхода к изоляции и обогащению фибробластов и активированных фибробластов, включая миофибробласты. Способность фибробласта преимущественно придерживаться пластика используется в первом подходе к изоляции. После ферментативного пищеварения с либеразой, одноклеточная подвеска клеток посеяна на пластиковой тарелке, чтобы преференциально придерживаться. Неспособность многих нефибробластных клеток придерживаться полистироловой поверхности блюд Петри позволяет нам удалить все носители из блюда и остаться с относительно чистой популяцией фибробластов. Предостережение использования этой техники, хотя фибробласты будут преимущественно придерживаться полистирола блюдо, некоторые загрязняющие нефибробластные клетки могут также приложить, оставляя неоднородной популяции клеток.
Второй метод изоляции использует FACS для отделения ЗСМА, выражающего миофибробласты от других клеток. В модели трансгенной мыши, используемой здесь, GFP выражается исключительно вместе с ЗСМА, поэтому миофибробласты, содержащие ЗСМА, могут быть обнаружены машиной FACS с помощью флуоресцентных возможностей GFP. Эта процедура изоляции позволяет нам получить популяцию клеток, которая составляет примерно 99% миофибробластов. Анализ чистоты этих клеток был подробно описан Saraswati и др.10.
Третий метод изоляции является эффективным способом изолировать как невредимые, так и активированные фибробласты с помощью магнитного разделения на основе биса экспрессирующей клетки MEFSK4. Позволяя одноклеточной подвеске связываться с анти-CD45 и анти-CD31 магнитными бусинами и становиться обездвиженные в матрице из-за эффектов магнитного поля, это позволило отделить любой гематопойетических, а также эндотелиальных клеток, которые, возможно, загрязненных фибробластной изоляции. Поскольку MEFSK4 недавно был использован в качестве надежного маркера для выявления фибробластов, антитело, которое будет связываться с MEFSK4 экспрессирующих клеток может быть применен. После привязки магнитного биса к антителу, создавая комплекс, позволяющий изоляцию фибробластов, магнитно-бис-клеточный комплекс проходит через матрицу в магнитном поле, и получается высокообогащенная популяция фибробластов. Чистота изолированной популяции фибробластов должна оцениваться с помощью иммуностоинга, РТПЦР и анализа цитометрии потока.
Как и в любой другой технике, существуют ограничения с методами, описанными в этой рукописи. Ограничение селективного протокола адгезии и магнитной изоляции на основе биса заключается в том, что эти методы не различают тихие и активированные фибробласты. Для того, чтобы обогатить активированные фибробласты, изоляция должна быть выполнена 8-10 дней после инфаркта миокарда. Кроме того, важно проверить чистоту изоляции с другими фибробластными маркерами. MEFSK4-положительная чистота фибробластов была продемонстрирована только RTPCR, рекомендуется тестировать (путем иммуносохранения и анализа цитометрии потока) с другими фибробластными маркерами и маркерами, которые распознают загрязняющие типы клеток, включая гематопоитическое (CD45), эндотелиальных (CD31) и перицитов (AN2). Если это возможно, другие фибробластные специфические маркеры могут быть использованы для дальнейшего сортировки или магнитно изолировать популяцию фибробластов.
Использование мышей ЗСМА-ГФП для изоляции и сортировки миофибробластов является надежным методом получения активированной популяции фибробластов. Тем не менее, незначительный процент гематопоитических и эндотелиальных клеток наблюдается в анализе потока. Для улучшения этого метода, сортировка клеток CD45-ve/CD31-ve и AN2've должна быть исключена из сортировки клеток GFP.ve/SMA.ve.+ve Так как ЗСМА является широко признанным маркером миофибробластов, модель мыши репортера ЗСМА-GFP является ценным инструментом, который должен быть использован для изучения миофибробластов в контексте травм миокарда.
Есть несколько важных шагов по устранению неполадок, которые должны быть приняты во внимание. Время пищеварения может быть уменьшено, если жизнеспособность клетки и выход влияет. Перемешивание бар не следует использовать для перемешивания пищеварения смеси, так как это влияет на жизнеспособность клеток. Трубка должна быть закреплена на рокер или в встряхивая инкубатор, чтобы агитировать пищеварения смесь мягко. Приостановка переваренной ткани 10x с 5 мл или 10 мл пипетки имеет решающее значение для надлежащей диссоциации клеток.
Правильный лизис красных кровяных телец одноклеточной подвески должен быть использован, если клетки будут отсортированы или проанализированы цитометрией потока. Для изоляции магнитного буса, дегазтирование буфера имеет важное значение для предотвращения введения любых пузырьков воздуха в столбце. Колонка, используемая для изоляции магнитных бисовых клеток, не должна использоваться повторно между различными магнитными клетками, конъюгированными бисом. Например, новый столбец должен быть+ использован для разделения клеток CD45, которые должны быть отброшены после elution клеток CD45, а затем еще один новый для изоляции клеток+ CD31.+ В наших руках мы не видели загрязнения перицитов в изолированных/отсортированных фибробластах. Тем не менее, MEFSK4 было показано, признать перицитов22. Поэтому рекомендуется использовать дополнительный шаг, чтобы разобраться / магнитно истощения перицитов (AN2) из одиночных клеток. Хотя этот протокол проверяется на мышах 12 недель, этот метод может быть использован для молодых или пожилых мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотят поблагодарить д-ра Иво Калайджича за мышей «SMA-GFP». Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения (NIH) под номером премии R01GM18300 (S.S.), Национальным институтом биомедицинской визуализации и биоинженерии NIH под номером премии R21EB019509 (P.P.Y.), и Грант развития ученого Американской ассоциации сердца под наградой номер 17SDG33630187 (S.S.). Анализции цитометрии потока были выполнены в VUMC Flow Cytometry Общий ресурс, который поддерживается Вандербильт Ингрэм онкологический центр (P30 CA68485) и Вандербильт пищеварительной болезни научно-исследовательский центр (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
References
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D.
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
- Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
- Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
- Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
- Goldsmith, E. C., et al.
- Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
- Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
- Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
- Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Pinto, A. R., et al.
