Name: iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: למד את שיטת iCLIP למיפוי אינטראקציות חלבון-RNA ברזולוציית נוקלאוטיד בודד ברחבי התרנסקריפטום. טכניקה זו משפרת את ההבנה של רגולציה לאחר תעתוק באמצעות שילוב של צלב UV וריצוף גבוה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לכל חברי במעבדות Ule, לאסקומב וזופאן לדיון סיוע ניסיוני. אנו מודים ג&#39;יימס Hadfield ואת ניק מתיוס עבור סידור תפוקה גבוהה. ברצוננו לציין כי השיטה המתוארת כאן iCLIP מניות בכמה צעדים עם פרוטוקול CLIP המקורית, שפותחה על ידי ג&#39;נסן קירק ו JU במעבדה של רוברט דרנל. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה האירופית למחקר מענק 206,726-קליפ JU וגם לטווח ארוך גבולות תוכנית אנוש המדע מלגה כדי JK

<ol><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+regulation%3A+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> RNA. 14, 802-813 (2008).</li>
<li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+right+RNA%3A+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1071-1082 (1999).</li>
<li>Brooks, S. A., Rigby, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+mRNA+ligands+bound+by+the+RNA+binding+protein+hnRNP+A2+utilizing+a+novel+in+vivo+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique.</a> Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).</li>
<li>Mili, S., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reassociation+of+RNA-binding+proteins+after+cell+lysis%3A+implications+for+the+interpretation+of+immunoprecipitation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses.</a> RNA. 10, 1692-1694 (2004).</li>
<li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302, 1212-1215 (2003).</li>
<li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+A+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37, 376-386 (2005).</li>
<li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456, 464-469 (2008).</li>
<li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).</li>
<li>Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-tracked+approach+to+analyze+RNA-protein+crosslinking+sites+in+native%2C+nonlabeled+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Methods. 26, 170-181 (2002).</li>
<li>König, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מאז פרוטוקול iCLIP מכיל מגוון רחב של תגובות אנזימטיות צעדים טיהור, זה לא תמיד קל לזהות בעיה כאשר ניסוי נכשל. כדי לשלוט על סגוליות של זיהו RNA צולבות קישור לאתרים, אחד או יותר שולטת שלילי יש לשמור לאורך כל הניסוי להשלים ומנתח חישובית הבאים. בקרות אלה יכולים להיות המדגם ללא נוגדנים, הלא צולבים תאים או immunoprecipitation מתאי בנוקאאוט או רקמה. באופן אידיאלי, ניסויים אלו השליטה לא צריך לטהר את כל מתחמי חלבון-RNA, ולכן צריך לתת שום אות על ג&#39;ל SDS-PAGE, ואין מוצרים לזיהוי לאחר הגברה PCR. תפוקה גבוהה רצף של ספריות אלה לשלוט צריך לחזור רצפים ייחודיים מעט מאוד. תאים מציאה אינם מומלצים כביקורת ריצוף, שכן רצפים וכתוצאה מכך עדיין מתאימות צולבות קישור לאתרים של אותו חלבון, אשר מטוהרים מתאי מציאה בכמויות קטנות יותר. אמצעי זהירות צריך גם לנקוט כדי למנוע זיהום עם מוצרי ה-PCR מניסויים קודמים. הדרך הטובה ביותר כדי לצמצם בעיה זו היא מרחבית נפרד צעדים לפני ואחרי-PCR. באופן אידיאלי, הניתוח של מוצרי ה-PCR וכל השלבים הבאים יש לבצע בחדר נפרד. יתר על כן, כל חבר צריך להשתמש במעבדה קובע את buffers ו ריאגנטים אחרים. בדרך זו, מקורות זיהום ניתן לזהות בקלות.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

A correction to the article iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution was made.

Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

עבור ג&#39;ל אלקטרופורזה והעברת הממברנה אנו ממליצים לא הוא השימוש XCell SureLock ® Mini-Cell ו XCell II ™ כתם מודול ערכת CE Mark (Invitrogen, EI0002), אשר תואם את השימוש minigels precast שונים שצוינו בכל פרוטוקול . מספר המותג והסדר של כל החומרים המשמשים מוזכר במהלך הפרוטוקול. רשימה של אנזימים שימוש בפרוטוקול מוצג בטבלה שלהלן. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> חלבון Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> להשתמש חלבון G עבור נוגדן עכבר או עז </td></tr><tr><td> RNase אני </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> פעילות יכול לשנות מן אצווה אצווה </td></tr><tr><td> T4-RNA האנזים אני </td><td> חוד </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> חוד </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> רוש </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> כתב עילי III הפוך transcriptase </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentre </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ SuperMix אני </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> זו תערובת PCR נותן את התוצאות הטובות ביותר בידיים שלנו </td></tr></table>

iclip - transcriptome רחב מיפוי של חלבון-rna אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

הרכב ייחודי הסדר המרחבי של RNA מחייב חלבונים (RBPs) על תעתיק המדריך היבטים מגוונים של תקנה שלאחר תעתיק 1. לכן, צעד חיוני לקראת הבנה תקנה תמליל ברמה המולקולרית היא להשיג מידע מיקומית על אתרי הקישור של RBPs 2. חלבון-RNA אינטראקציות ניתן ללמוד בשיטות ביוכימיות, אך גישות אלה אינן כתובת RNA מחייב בהקשר הסלולר המקורית שלו. ניסיונות ראשוניים ללמוד חלבון-RNA מתחמי בסביבה הסלולרי שלהם מועסקים טיהור זיקה או immunoprecipitation בשילוב עם תצוגת ההפרש או ניתוח microarray (RIP-Chip), 3-5. גישות אלה היו מועדים בזיהוי אינטראקציות עקיפה או שאינם פיזיולוגיים 6. על מנת להגביר את הספציפיות ופתרון מיקומית, אסטרטגיה המכונה CLIP (UV cross-linking ו immunoprecipitation) הוצג 7,8. CLIP משלב cross-linking UV של חלבונים ומולקולות RNA עם ערכות טיהור קפדני כולל ג&#39;ל אלקטרופורזה denaturing polyacrylamide. בשילוב עם תפוקה גבוהה טכנולוגיות רצף, CLIP הוכח ככלי רב עוצמה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-RNA בקנה מידה הגנום כולו (המכונה CLIP-היטים או CLIP-seq) 9,10. לאחרונה, PAR-CLIP הוצג המשתמשת אנלוגים ribonucleoside photoreactive עבור cross-linking 11,12. למרות הספציפיות הגבוהה של נתונים המתקבלים, ניסויים CLIP לעתים קרובות ליצור ספריות cDNA של מורכבות רצף מוגבל. זה נובע בחלקו לכמות מוגבלת של שיתוף מטוהרים RNA ושני התגובות יעיל RNA קשירת הדרוש לשם הכנת הספרייה. בנוסף, תחל הרחבת מבחני ציינו כי cDNAs רבים לחתוך בטרם עת על 13 נוקליאוטידים crosslinked. CDNAs מקוצץ כאלה הם איבדו במהלך פרוטוקול סטנדרטי CLIP ספריה הכנה. פיתחנו לאחרונה iCLIP (נוקלאוטיד יחיד-CLIP רזולוציה), אשר לוכדת את cDNAs מקוצץ ידי החלפת אחד מולקולאריים הצעדים יעיל RNA קשירת עם circularization יעיל יותר cDNA intramolecular (איור 1) 14. חשוב לציין, רצף cDNAs מקוצץ מספק תובנות לגבי המיקום של אתר cross-הקישור ברזולוציה של נוקלאוטיד. אנו ליישם בהצלחה iCLIP ללמוד hnRNP ארגון C החלקיקים בקנה מידה הגנום כולו ולהעריך את תפקידה בתקנה שחבור 14.

הסידור המרחבי של חלבונים RNA מחייב על תעתיק הוא הקובע המפתח של תקנה שלאחר תעתיק. לכן, פיתחנו הפרט נוקלאוטיד UV ברזולוציה crosslinking ו immunoprecipitation (iCLIP) המאפשר מיפוי מדויק גנום רחב של אתרי הקישור של חלבון-RNA מחייב.

iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

ההרכב הייחודי והסידור המרחבי של חלבוני קישור ל-RNA (RBPs) על גבי תמליל מכוונים את ההיבטים המגוונים של הבקרה הפוסט-טרנסקריפציונית...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג מפה של אתרי הקישור של חלבון קושר RNA לכל אורך הטרנסקריפטום ברזולוציה של נוקלאוטיד בודד. דבר זה מושג על ידי הקרנת UV של תאים חיים כדי ליצור קשרי צלב קוולנטיים בין חלבונים ל-RNA in vivo כשלב שני. החלבון קושר ה-RNA מטוהר באופן אימונולוגי תחת תנאים מחמירים כדי להפיק את מקטעי ה-RNA שנוצרו בהם קשרי צלב.שעתוק הפוך הבא מייצר cDNA שנוטה להיקטע במיקום הפפטיד המחובר, דבר המשמר את המידע על מיקום הקשירה הצולבת בתוך ה-RNA. התוצאות המתקבלות מראות את כל אתרי הקישור בתוך התעתוק (transcriptome) על בסיס ריצוף בסביבתו גבוהה (high throughput sequencing) של ספריית ה-cDNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של ה-RNA, כגון האופן שבו יחסי הגומלין בין חלבוני RNA שונים מווסתים את עיבוד ה-RNA. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הגברת הביצועים והרזולוציה של מפות אינטראקציות חלבון-RNA ברחב התעתוק. כדי להתחיל, נבצע את הליך הקשירה הצולבת ב-UV לתאי תרבית רקמה.הסיר את המצע מתוך צלחת בקוטר 10 סנטימטרים של תאי healer. הוסף שש מיליליטר של PBS קר במי קרח והנח את הצלחות על קרח. צלחת אחת מספיקה לשלושה ניסויים.הסיר את המכסה והקרן את התאים. לאחר הקרנה באורך גל של 254 nanometers עם 150 millijoules per centimeter squared, אסוף את התאים על ידי גירודם מהצלחות באמצעות cell lifter. העבר 2 mL של תרחיף תאים לכל אחד משלושה מיקרו-מבחנות כדי לשקיע את התאים. סבב אותם במהירות מקסימלית למשך 10 שניות בטמפרטורה של 4 °C.לאחר מכן הסירו את ה-supinate snap, הקפיאו את משקעי התאים על קרח יבש ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 °C עד למועד השימוש. הוסיפו 100 µl של protein A dyna beads לכל ניסוי למבחנה זעירה (micro tube) חדשה. אם אתם עובדים עם נוגדנים מעכבר או מעז, השתמשו ב-protein G dyna beads.שטפו את החרו지를 פעמיים עם באפר ליזיס (lysis buffer), שניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב המצורף. השעיקו מחדש את החרוזים ב-100 microliters של באפר ליזיס עם שתי עד 10 micrograms של נוגדן. סובבו את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות.לאחר מכן, שטפו את החרוזיים שלוש פעמים עם 900 µl של לysis buffer והשאירו אותם בשטיפה האחרונה עד שתהיו מוכנים להמשיך. לצורך immunoprecipitation של תאי Thor, הניחו אותם על קרח. השעו אותם ב-1 mL של lysis buffer והעבירו אותם למיקרו-מבחנה של 1.5 mL.הכינו דילול של 1:500 של RNAs one. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL יחד עם 2 µL של turbo DNAs ל-cell.Lysate. דגרו את הדגימות למשך שלוש דקות בדיוק ב-37 °C, תוך ניעור ב-1,100 rpm, והעבירו מיד לקרח.לאחר מכן, סבבו את הדגימות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ובכוח צנטריפוגלי של 22,000 ×g למשך 20 דקות כדי להשקיע את השקיעות. אספו בזהירות את העלנוסף (supernatant), והשאירו כ-50 µL מהליזאט עם המשקע כדי להשקיע את החרוזים. הסירו את בופר השטיפה, ולאחר מכן הוסיפו את ליזאטי התאים שהוכרו. סובבו את הדגימות למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.השליכו את סוכן ה-SUP ושטפו את החרוצים פעמיים עם 900 microliters של בופר מלח גבוה (high salt buffer), שניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב המצורף. לבסוף, שטפו את החרוצים פעמיים עם 900 microliters של בופר שטיפה (wash buffer). לאחר מכן, המשיכו לדה-פוספורילציה ולהוספת לינקר לקצוות ה-three prime של ה-RNA.כדי לסמן את הקצוות החמישיים (5') של ה-RNA, עבדו מאחורי מגן פרספקס. הסירו את העלייה מהשטיפה האחרונה של תגובת הליגציה של המקשר (linker) והשביו שנית את החרו지를 ב-8 µL של תערובת PNK חמה. דגרו למשך חמש דקות ב-37 °C.הסר את תערובת ה-PNK החמה והשתמש בה שוב. השהה את החרוזים ב-20 µL של תמיסת טעינה לג'ל (page loading buffer) בריכוז 1X. לאחר מכן, דגרי את הדגימה בטרמו-מיקסר בטמפרטורה של 70 °C למשך 10 דקות.הנח מיד את הדגימה על מגנט כדי להשקיע את החרו지를 הריקים. טען את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE בריכוז של 4% עד 12% בהתאם להוראות היצרן.בנוסף, טענו 5 µL של סמני גודל חלבון צבועים מראש. הריצו את הג'ל למשך 50 דקות במתח של 180 V. העבירו את קומפלקסאות החלבון-RNA מהג'ל לממברנת ניטרוסלולוז באמצעות מכשיר ההעברה הרטוב NOVA, בהתאם להוראות היצרן.לאחר ההעברה, שטפו את הממברנה בבופר PBS. לאחר מכן, עטפו אותה בניילון נצמד וחשפו אותה לסרט בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. בצעו חשיפות למשך 30 דקות, שעה אחת ולילה שלם.בשלב הבא, בודדו את אזור הממברנה בהתאם לקומפלקסים של חלבון ו-RNA מה-RNAs הנמוכים. בצעו את הניסוי תוך שימוש באוטורדיוגרף כמסכה. השחריו את ה-RNA מהממברנה באמצעות עיכול ב-proteinase K ומיצוי בפנול-כלורופורם.בצעו תעתוק הפוך של ה-RNA באמצעות אחד מפריימרי ה-AYP כדי לטהר את ה-CDNA באמצעות ג'ל. ערבבו שש מיקרוליטרים (6 µL) של דגימת CDNA עם שש מיקרוליטרים (6 µL) של תמיסת טעינה TBE urea בריכוז פי 2. בצעו זאת רגע לפני טעינת הדגימות על הג'ל.חממו את הדגימות ל-80 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, העמיסו את הדגימות על ג'ל urea 6%TBE מוכן מראש, יחד עם ס marker של משקל מולקולרי נמוך. הניחו לג'ל לרוץ במשך 40 דקות במתח של 180 volts, כפי שתיאר היצרן, תוך שימוש בצבע העליון ובסימונים על תמיכת הג'ל מפלסטיק כדי להנחות את החיתוך.גזרו שלושה פסים באורכים של 120 עד 200 נוקלאוטידים, 85 עד 120 נוקלאוטידים ו-70 עד 85 נוקלאוטידים. שימו לב כי ה-arc lip primer ורצף ה-L three יחד מהווים 52 נוקלאוטידים מרצף ה-clip. הוסיפו 400 µL של te ומעכו את פרוסת הג'ל לחתיכות קטנות.בעזרת בוכנה של מזרק של 1 ml, דגרו את פיסות הג'ל תוך써 ניעור ב-1,100 סל"ד למשך שעתיים ב-37 °C. הניחו שני מסנני זכוכית מקדימים של 1 cm בעמודת CoStar spinx. העבירו את החלק הנוזלי של הדגימה לעמודה וסבבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-13,000 סל"ד אל תוך מבחנה של 1.5 ml.הוסיפו 0.5 µL של glyco blue ו-40 µL של sodium acetate pH 5.5. לאחר מכן, ערבבו את הדגימה. הוסיפו 1 mL של 100% ethanol.ערבבו שוב והשקיעו את הדגימה למשך לילה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לבסוף, בצעו מעגול (circularize) של מולקולות ה-CD NA כדי לחבר את אזור האדפטור לקצה ה-five prime. לאחר מכן, בצעו ליניאריזציה מחדש והגברה באמצעות PCR לפי הפרוטוקול הכתוב המצורף לפני ריצוף ספריית ה-eye clip; ניתן לעקוב אחר הצלחת הניסוי בשני שלבים.בצילום הרדיוגרף של קומפלקס החלבון-RNA לאחר העברה לממברנה ובתמונת הג'ל של תוצרי ה-PCR, עבור דגימות בעלות ריכוז RNA נמוך, יש להבחין בפעילות רדיואקטיבית מפוזרת מעל המשקל המולקולרי של החלבון; עבור דגימות בעלות ריכוז RNA גבוה, פעילות רדיואקטיבית זו תהיה ממוקדת יותר קרוב למשקל המולקולרי של החלבון. כאשר לא נעשה שימוש בנוגדן בשלב האימונו-משקבית (immunoprecipitation), לא אמור להיראות אות כלשהו.בקרות חשובות נוספות לסגוליות של immunoprecipitation כוללות או הקרנה של UV או שימוש בתאים שאינם מבטאים את החלבון הנחקר. תמונת הג'ל של תוצרי ה-PCR צריכה להראות טווח גדלים התואם לפרקציית ה-CD NA. שימו לב כי הפריימרים של ה-PCR, P three Celexa ו-P five Celexa, מוסיפים 76 נוקלאוטידים נוספים לגודל של ה-CD NA. אם לא נעשה שימוש בנוגדן במהלך ה-immunoprecipitation, לא אמור להיווצר תוצר PCR תואם.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שכל אחד מ-64 השלבים הוא קריטי ויש לבצעו בדיוק של מאה אחוזים. ניתן לשלב נתוני ICL באופן חישובי עם בדיקות תפקודיות של כלל התמלילים (transcriptum wide). הדבר יכול, למשל, לספק תובנות לגבי הבקרה של עיבוד RNA התלויה במיקום.עבור ניתוח נתונים חישובי, אנו ממליצים לעיין בפרסומינו האחרונים שנכתבו בשיתוף פעולה עם Nicholas KA מהמכון האירופי לביואינפורמטיקה ועם bla zupan מאוניברסיטת Liana. וכעת הגיע הזמן שתתחילו בניסויים שלכם. תהנו.

iclip-transcriptome-wide-mapping-protein-rna-interactions-with

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

תעתיקי רנ"א כפופים תקנה posttranscriptional נרחב כי הוא מתווך על ידי מספר רב של טרנס משחק RNA מחייב חלבונים (RBPs). כאן אנו מציגים שיטה להכליל לזהות במדויק בקנה מידה רחב transcriptome האתרים RNA מחייב של RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

כאן, אנו מפרטים את השיטה של S equen של P סורלן crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH), אשר מאפשר מיפוי גנום רחב של interramolecular ו intermolecular RNA-RNA אינטראקציות in vivo . SPLASH ניתן ליישם את המחקר RNA אינטראקציות של אורגניזמים כולל שמרים, חיידקים ובני אדם.

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

אנו מציגים גישות ניסיוניות של RNA-interactors לימוד של זוגיות גדילי RNA מחייב חלבון קינאז מופעל RNA (PKR) במהלך מחזור התא יונקים באמצעות תאים הלה. שיטה זו משתמשת פורמלדהיד קומפלקסים crosslink RNA-PKR, immunoprecipitation להעשיר PKR מכורך RNAs. אלה RNAs ניתן לנתח נוסף דרך רצף תפוקה גבוהה או לרביעיית-PCR.

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול eCLIP כדי לקבוע מטרות של RNA הגדולות של מועמדים RBP בתוך בנות.

משופרת Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) שיטה לזיהוי יעיל של רנ א חלבון מאוגד ב העכבר בתוך הראש

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעשיר את אתרי ה-RNA האנדוגניים או "עקבות" של RNA: מכלולי חלבון (RNP) מתאי יונקים. גישה זו כוללת שני immunoprecipitations של RNP תת יחידות, ולכן המכונה RNA immunoprecipitation בטנדם (RIPiT).

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

כאן אנו מציגים פרוטוקול קליפ-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq עם טיהור דגל-ביוטין טנדם כדי לקבוע את מטרות RNA של חלבונים מחייבים RNA (RBPs) בתאים יונקים.

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

למד את שיטת iCLIP למיפוי אינטראקציות חלבון-RNA ברזולוציית נוקלאוטיד בודד ברחבי התרנסקריפטום. טכניקה זו משפרת את ההבנה של רגולציה לאחר תעתוק באמצעות שילוב של צלב UV וריצוף גבוה.

iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

גלה סרטונים נוספים