iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג מפה רחבה של טרנסקריפטום של אתרי הקישור של חלבון קושר RNA ברזולוציית נוקלאוטידים בודדת. זה מושג על ידי הקרנת UV של תאים חיים כדי להצליב קוולנטית חלבונים ו-RNA in vivo כשלב שני. חלבון קושר ה-RNA מטוהר חיסונית בתנאים מחמירים על מנת לשחזר את שברי ה-RNA המקושרים.

השעתוק ההפוך הבא מייצר CDNAs שלעתים קרובות חותכים בפפטיד המצורף, מה שמשמר את המידע על מיקום הקישור הצולב בתוך ה-RNA מתקבלות תוצאות המציגות את כל אתרי הקישור בתוך הטרנסקריפטום בהתבסס על רצף תפוקה גבוה של ספריית ה-cDNA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של RNA כגון כיצד האינטראקציה של חלבונים שונים של RNA אוניק מווסתת את עיבוד ה-RNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו מגדילים הן את הביצועים והן את הרזולוציה של המפות הרחבות של הטרנסקריפטום שלנו של אינטראקציות RNA חלבון כדי להתחיל בהליך של תאי תרבית רקמה צולבים UV.

הסר את המדיום מצלחת של 10 סנטימטרים של תאי מרפא. מוסיפים שישה מיליליטר PBS קר כקרח ומניחים את הצלחות על קרח. צלחת אחת מספיקה לשלושה ניסויים.

הסר את המכסה והקרין את התאים. ברגע שהגעתם ל-254 ננומטר עם 150 מילי-ג'אול לסנטימטר בריבוע, קצרו את התאים על ידי גירודם מהצלחות בעזרת מרים תאים והעבירו שני מיליליטר של תרחיף תאים לכל אחד משלושת צינורות המיקרו כדי לגלול את התאים. סובב אותם במהירות שיא במשך 10 שניות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הסר את הצמד הסופינט, הקפיא את כדורי התא על קרח יבש ואחסן מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הוסף 100 מיקרוליטר חלבון, חרוזי דינה לכל ניסוי לצינור מיקרו טרי. אם עובדים עם נוגדנים לעכבר או לעז, השתמשו בחרוזי דינה של חלבון G.

שטפו את החרוזים פעמיים עם מאגר ליזה, אותו ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב הנלווה. השעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ליזה עם שניים עד 10 מיקרוגרם של נוגדנים. סובב את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות.

לאחר מכן שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 900 מיקרוליטר של מאגר ליזה והשאירו אותם בכביסה האחרונה עד שתהיה מוכן להמשיך. למשקעים חיסוניים ארמון תא תור על קרח. Resus מושעה במיליליטר אחד של מאגר ליזה ומעביר אותו לצינור מיקרו של 1.5 מיליליטר.

הכן דילול של 1 עד 500 של RNAs אחד. לאחר מכן הוסף לתא 10 מיקרוליטר יחד עם שני מיקרוליטרים של DNA טורבו. ליזאט. דגרו את הדגימות במשך שלוש דקות בדיוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, טלטול ב-1,100 סיבובים לדקה, העבירו מיד לקרח.

לאחר מכן סובב את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס ופי 22,000 מכוח הכבידה למשך 20 דקות כדי לנקות את הליזאט לאסוף בזהירות את ה-SUP natant, ולהשאיר כ-50 מיקרוליטר ליזאט עם הגלולה כדי לזרז את החרוזים. הסר את מאגר הכביסה ואז הוסף את ליזטות התאים המוכנות. סובב את הדגימות במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.

השליכו את חומר הסאפ ושטפו את החרוזים פעמיים עם 900 מיקרוליטר של מאגר מלח גבוה, אותו ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב הנלווה. לבסוף, שטפו את החרוזים פעמיים עם 900 מיקרוליטר מאגר כביסה. לאחר מכן המשך לדפוספורילאט והוסף מקשר לשלושת הקצוות הראשוניים של ה-RNA.

כדי לתייג את ה-RNA חמישה קצוות ראשוניים הפועלים מאחורי מגן פרספקס. הסר את הסופינט מהשטיפה האחרונה של תגובת קשירת המקשר והשהה מחדש את החרוזים בשמונה מיקרוליטר של תערובת PNK חמה. דגירה במשך חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

מוציאים את תערובת ה-PNK החמה ורואס. השעו את החרוזים ב -20 מיקרוליטר של מאגר טעינת עמודים חד פעמי. לאחר מכן דגרו את הדגימה על מערבל תרמו בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

הנח מיד את הדגימה על מגנט כדי לזרז את החרוזים הריקים. טען את הדוגמאות לדף חדש של 4 עד 12%. ביס-ג'ל לפי הוראות היצרן.

כמו כן, טען חמישה מיקרוליטרים של סמן גודל חלבון צבוע מראש. הפעל את הג'ל למשך 50 דקות בחום של 180 וולט. מעבירים את קומפלקסי ה-RNA החלבוני מהג'ל לקרום ניטרוצלולוזה באמצעות מכשיר ההעברה הרטוב NOVA בהתאם להוראות היצרן.

לאחר ההעברה, יש לשטוף את הממברנה במאגר PBS. לאחר מכן עוטפים אותו בניילון סרן וחושפים אותו לסרט בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. בצע חשיפות למשך 30 דקות, שעה ולילה.

לאחר מכן, בודד את אזור הממברנה על פי קומפלקסי ה-RNA של החלבון מה-RNA הנמוך. התנסה בשימוש בצילום הרנטגן האוטומטי כמסכה. שחזר את ה- RNA מהממברנה באמצעות עיכול פרוטאינאז K ומיצוי פנול כלורופורם.

תמלל הפוך את ה-RNA באמצעות אחד מהפריימרים של AYP כדי לטהר את ה-CDNA בג'ל. מערבבים שישה מיקרוליטרים של דגימת CDNA עם שישה מיקרוליטרים של פי שניים מאגר טעינת אוריאה TBE. רגע לפני העמסת הדגימות על ג'ל.

מחממים את הדגימות ל 80 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר מכן טען את הדגימות על ג'ל אוריאה 6% TBE טרומי יחד עם סמן משקל מולקולרי נמוך. אפשר לג'ל לפעול במשך 40 דקות ב-180 וולט כמתואר על ידי היצרן באמצעות הצבע העליון והסימנים על תמיכת ג'ל הפלסטיק כדי להנחות את הכריתה.

חותכים שלוש להקות ב -120 עד 200 נוקלאוטידים, 85 עד 120 נוקלאוטידים ו-70 עד 85 נוקלאוטידים. שימו לב כי פריימר שפת הקשת ורצף L שלוש מהווים יחד 52 נוקלאוטידים של רצף הקליפ. מוסיפים 400 מיקרוליטר של te ומועכים את פרוסת הג'ל לחתיכות קטנות.

בעזרת בוכנת מזרק של מיליליטר אחד דגרו את חתיכות הג'ל בניעור ב -1, 100 סיבובים לדקה למשך שעתיים ב -37 מעלות צלזיוס. הנח שני מסננים מקדימים מזכוכית של סנטימטר אחד לתוך עמוד ספינקס של CoStar. העבירו את החלק הנוזלי של הדגימה לסיבוב העמודה למשך דקה אחת ב-13,000 סיבובים לדקה לתוך צינור של 1.5 מיליליטר.

הוסף 0.5 מיקרוליטר גליקו כחול ו -40 מיקרוליטר נתרן אצטט pH 5.5. לאחר מכן מערבבים את הדגימה. הוסף מיליליטר אחד של 100% אתנול.

מערבבים שוב ומזרזים את הדגימה למשך הלילה במינוס 20 מעלות צלזיוס. לבסוף, הקיפו את מולקולות CD NA כדי לחבר את אזור המתאם לחמשת הקצה הראשוני. לאחר מכן ליניאריזציה והגברת PCR בהתאם לפרוטוקול הכתוב הנלווה לפני ריצוף ספריית קליפס העין, ניתן לעקוב אחר הצלחת הניסוי בשני שלבים.

יש לראות את הגרף האוטו-רדיו של קומפלקס ה-RNA של החלבון לאחר העברת הממברנה ותמונת הג'ל של תוצרי ה-PCR בצילום הרנטגן האוטומטי של דגימות ה-RNA הנמוכות, רדיואקטיביות מפוזרת מעל המשקל המולקולרי של החלבון עבור דגימות RNA גבוהות. רדיואקטיביות זו ממוקדת קרוב יותר למשקל המולקולרי של החלבון. כאשר לא נעשה שימוש בנוגדנים במשקעים החיסוניים, אין לזהות אות.

בקרות חשובות נוספות לספציפיות של המשקעים החיסוניים פולטות קרינת UVE או משתמשות בתאים שאינם מבטאים את החלבון המעניין. תמונת הג'ל של מוצרי ה-PCR צריכה להדגים טווח מידות המתאים לשבר CD NA. שימו לב שהפריימרים של ה-PCR, P שלוש Celexa ו-P 5 Celexa מציגים 76 נוקלאוטידים נוספים לגודל ה-CD NA. אם לא נעשה שימוש בנוגדנים במהלך המשקעים החיסוניים, אין לזהות מוצר PCR מתאים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל אחד מ-64 השלבים הוא קריטי ויש לבצע אותו בדיוק של מאה אחוז. ניתן לשלב את נתוני ICL באופן חישובי עם מבחנים פונקציונליים רחבים של טרנסקריפטום. זה יכול, למשל, לקבל תובנות לגבי הוויסות תלוי המיקום של עיבוד RNA.

לניתוח נתונים חישוביים, ברצוננו להתייחס לפרסומים האחרונים שלנו בשיתוף עם המכון האירופי לביואינפורמטיקה Nicholas KA ובלה זופן באוניברסיטת ליאנה. ועכשיו הגיע הזמן שתתחילו ניסויים משלכם. תהנה.