iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד
30 באפריל 2011
הסידור המרחבי של חלבונים RNA מחייב על תעתיק הוא הקובע המפתח של תקנה שלאחר תעתיק. לכן, פיתחנו הפרט נוקלאוטיד UV ברזולוציה crosslinking ו immunoprecipitation (iCLIP) המאפשר מיפוי מדויק גנום רחב של אתרי הקישור של חלבון-RNA מחייב.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג מפה רחבה של טרנסקריפטום של אתרי הקישור של חלבון קושר RNA ברזולוציית נוקלאוטידים בודדת. זה מושג על ידי הקרנת UV של תאים חיים כדי להצליב קוולנטית חלבונים ו-RNA in vivo כשלב שני. חלבון קושר ה-RNA מטוהר חיסונית בתנאים מחמירים על מנת לשחזר את שברי ה-RNA המקושרים.
השעתוק ההפוך הבא מייצר CDNAs שלעתים קרובות חותכים בפפטיד המצורף, מה שמשמר את המידע על מיקום הקישור הצולב בתוך ה-RNA מתקבלות תוצאות המציגות את כל אתרי הקישור בתוך הטרנסקריפטום בהתבסס על רצף תפוקה גבוה של ספריית ה-cDNA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של RNA כגון כיצד האינטראקציה של חלבונים שונים של RNA אוניק מווסתת את עיבוד ה-RNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו מגדילים הן את הביצועים והן את הרזולוציה של המפות הרחבות של הטרנסקריפטום שלנו של אינטראקציות RNA חלבון כדי להתחיל בהליך של תאי תרבית רקמה צולבים UV.
הסר את המדיום מצלחת של 10 סנטימטרים של תאי מרפא. מוסיפים שישה מיליליטר PBS קר כקרח ומניחים את הצלחות על קרח. צלחת אחת מספיקה לשלושה ניסויים.
הסר את המכסה והקרין את התאים. ברגע שהגעתם ל-254 ננומטר עם 150 מילי-ג'אול לסנטימטר בריבוע, קצרו את התאים על ידי גירודם מהצלחות בעזרת מרים תאים והעבירו שני מיליליטר של תרחיף תאים לכל אחד משלושת צינורות המיקרו כדי לגלול את התאים. סובב אותם במהירות שיא במשך 10 שניות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן הסר את הצמד הסופינט, הקפיא את כדורי התא על קרח יבש ואחסן מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הוסף 100 מיקרוליטר חלבון, חרוזי דינה לכל ניסוי לצינור מיקרו טרי. אם עובדים עם נוגדנים לעכבר או לעז, השתמשו בחרוזי דינה של חלבון G.
שטפו את החרוזים פעמיים עם מאגר ליזה, אותו ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב הנלווה. השעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ליזה עם שניים עד 10 מיקרוגרם של נוגדנים. סובב את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות.
לאחר מכן שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 900 מיקרוליטר של מאגר ליזה והשאירו אותם בכביסה האחרונה עד שתהיה מוכן להמשיך. למשקעים חיסוניים ארמון תא תור על קרח. Resus מושעה במיליליטר אחד של מאגר ליזה ומעביר אותו לצינור מיקרו של 1.5 מיליליטר.
הכן דילול של 1 עד 500 של RNAs אחד. לאחר מכן הוסף לתא 10 מיקרוליטר יחד עם שני מיקרוליטרים של DNA טורבו. ליזאט. דגרו את הדגימות במשך שלוש דקות בדיוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, טלטול ב-1,100 סיבובים לדקה, העבירו מיד לקרח.
לאחר מכן סובב את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס ופי 22,000 מכוח הכבידה למשך 20 דקות כדי לנקות את הליזאט לאסוף בזהירות את ה-SUP natant, ולהשאיר כ-50 מיקרוליטר ליזאט עם הגלולה כדי לזרז את החרוזים. הסר את מאגר הכביסה ואז הוסף את ליזטות התאים המוכנות. סובב את הדגימות במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את חומר הסאפ ושטפו את החרוזים פעמיים עם 900 מיקרוליטר של מאגר מלח גבוה, אותו ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב הנלווה. לבסוף, שטפו את החרוזים פעמיים עם 900 מיקרוליטר מאגר כביסה. לאחר מכן המשך לדפוספורילאט והוסף מקשר לשלושת הקצוות הראשוניים של ה-RNA.
כדי לתייג את ה-RNA חמישה קצוות ראשוניים הפועלים מאחורי מגן פרספקס. הסר את הסופינט מהשטיפה האחרונה של תגובת קשירת המקשר והשהה מחדש את החרוזים בשמונה מיקרוליטר של תערובת PNK חמה. דגירה במשך חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
מוציאים את תערובת ה-PNK החמה ורואס. השעו את החרוזים ב -20 מיקרוליטר של מאגר טעינת עמודים חד פעמי. לאחר מכן דגרו את הדגימה על מערבל תרמו בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הנח מיד את הדגימה על מגנט כדי לזרז את החרוזים הריקים. טען את הדוגמאות לדף חדש של 4 עד 12%. ביס-ג'ל לפי הוראות היצרן.
כמו כן, טען חמישה מיקרוליטרים של סמן גודל חלבון צבוע מראש. הפעל את הג'ל למשך 50 דקות בחום של 180 וולט. מעבירים את קומפלקסי ה-RNA החלבוני מהג'ל לקרום ניטרוצלולוזה באמצעות מכשיר ההעברה הרטוב NOVA בהתאם להוראות היצרן.
לאחר ההעברה, יש לשטוף את הממברנה במאגר PBS. לאחר מכן עוטפים אותו בניילון סרן וחושפים אותו לסרט בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. בצע חשיפות למשך 30 דקות, שעה ולילה.
לאחר מכן, בודד את אזור הממברנה על פי קומפלקסי ה-RNA של החלבון מה-RNA הנמוך. התנסה בשימוש בצילום הרנטגן האוטומטי כמסכה. שחזר את ה- RNA מהממברנה באמצעות עיכול פרוטאינאז K ומיצוי פנול כלורופורם.
תמלל הפוך את ה-RNA באמצעות אחד מהפריימרים של AYP כדי לטהר את ה-CDNA בג'ל. מערבבים שישה מיקרוליטרים של דגימת CDNA עם שישה מיקרוליטרים של פי שניים מאגר טעינת אוריאה TBE. רגע לפני העמסת הדגימות על ג'ל.
מחממים את הדגימות ל 80 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר מכן טען את הדגימות על ג'ל אוריאה 6% TBE טרומי יחד עם סמן משקל מולקולרי נמוך. אפשר לג'ל לפעול במשך 40 דקות ב-180 וולט כמתואר על ידי היצרן באמצעות הצבע העליון והסימנים על תמיכת ג'ל הפלסטיק כדי להנחות את הכריתה.
חותכים שלוש להקות ב -120 עד 200 נוקלאוטידים, 85 עד 120 נוקלאוטידים ו-70 עד 85 נוקלאוטידים. שימו לב כי פריימר שפת הקשת ורצף L שלוש מהווים יחד 52 נוקלאוטידים של רצף הקליפ. מוסיפים 400 מיקרוליטר של te ומועכים את פרוסת הג'ל לחתיכות קטנות.
בעזרת בוכנת מזרק של מיליליטר אחד דגרו את חתיכות הג'ל בניעור ב -1, 100 סיבובים לדקה למשך שעתיים ב -37 מעלות צלזיוס. הנח שני מסננים מקדימים מזכוכית של סנטימטר אחד לתוך עמוד ספינקס של CoStar. העבירו את החלק הנוזלי של הדגימה לסיבוב העמודה למשך דקה אחת ב-13,000 סיבובים לדקה לתוך צינור של 1.5 מיליליטר.
הוסף 0.5 מיקרוליטר גליקו כחול ו -40 מיקרוליטר נתרן אצטט pH 5.5. לאחר מכן מערבבים את הדגימה. הוסף מיליליטר אחד של 100% אתנול.
מערבבים שוב ומזרזים את הדגימה למשך הלילה במינוס 20 מעלות צלזיוס. לבסוף, הקיפו את מולקולות CD NA כדי לחבר את אזור המתאם לחמשת הקצה הראשוני. לאחר מכן ליניאריזציה והגברת PCR בהתאם לפרוטוקול הכתוב הנלווה לפני ריצוף ספריית קליפס העין, ניתן לעקוב אחר הצלחת הניסוי בשני שלבים.
יש לראות את הגרף האוטו-רדיו של קומפלקס ה-RNA של החלבון לאחר העברת הממברנה ותמונת הג'ל של תוצרי ה-PCR בצילום הרנטגן האוטומטי של דגימות ה-RNA הנמוכות, רדיואקטיביות מפוזרת מעל המשקל המולקולרי של החלבון עבור דגימות RNA גבוהות. רדיואקטיביות זו ממוקדת קרוב יותר למשקל המולקולרי של החלבון. כאשר לא נעשה שימוש בנוגדנים במשקעים החיסוניים, אין לזהות אות.
בקרות חשובות נוספות לספציפיות של המשקעים החיסוניים פולטות קרינת UVE או משתמשות בתאים שאינם מבטאים את החלבון המעניין. תמונת הג'ל של מוצרי ה-PCR צריכה להדגים טווח מידות המתאים לשבר CD NA. שימו לב שהפריימרים של ה-PCR, P שלוש Celexa ו-P 5 Celexa מציגים 76 נוקלאוטידים נוספים לגודל ה-CD NA. אם לא נעשה שימוש בנוגדנים במהלך המשקעים החיסוניים, אין לזהות מוצר PCR מתאים.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל אחד מ-64 השלבים הוא קריטי ויש לבצע אותו בדיוק של מאה אחוז. ניתן לשלב את נתוני ICL באופן חישובי עם מבחנים פונקציונליים רחבים של טרנסקריפטום. זה יכול, למשל, לקבל תובנות לגבי הוויסות תלוי המיקום של עיבוד RNA.
לניתוח נתונים חישוביים, ברצוננו להתייחס לפרסומים האחרונים שלנו בשיתוף עם המכון האירופי לביואינפורמטיקה Nicholas KA ובלה זופן באוניברסיטת ליאנה. ועכשיו הגיע הזמן שתתחילו ניסויים משלכם. תהנה.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה למיפוי אתרי קישור של חלבונים קושרי RNA ברזולוציה של נוקלאוטיד בודד, תוך שימוש בשיטת UV crosslinking and immunoprecipitation ברזולוציה של נוקלאוטיד בודד (iCLIP). טכניקה זו משפרת את ההבנה של בקרה פוסט-טרנסקריפציונלית על ידי אספקת נתונים מדויקים ברמה גנומית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של RNA
- בקרה פוסט-טרנסקריפציונלית
- טכניקות למיפוי גנומי
רקע
- חלבונים קושרי-RNA ממלאים תפקידים מכריעים בבקרת עיבוד ה-RNA.
- הבנת אתרי הקשירה שלהם חיונית להבהרת תפקודיהם.
- לשיטות מסורתיות חסרה הרזולוציה הדרושה למיפוי מדויק.
- שיטת iCLIP מציעה פתרון באמצעות שילוב של קישור צולב ב-UV עם ריצוף בתפוקה גבוהה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לקבלת מפת אינטראקציות של חלבוני קישור ל-RNA בפריסה רחבה של הטרנסקריפטום.
- שיפור הרזולוציה של זיהוי אתרי הקישור.
- הנגשת המחקר של מנגנוני עיבוד RNA.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הקרנת UV של תאים חיים ליצירת קשרי הצלבה (cross-link) בין חלבונים ל-RNA.
- אימונופרסיפיטציה של מקטעי RNA המצולבים.
- שעתוק הפוך ליצירת cDNAs.
- ריצוף בסביבה של תפוקה גבוהה (High-throughput sequencing) של ספריות cDNA לזיהוי אתרי קישור.
תוצאות עיקריות
- מיפוי מוצלח של אתרי קישור של חלבוני קישור ל-RNA על פני התסריפטום.
- הדגמה של הרזולוציה והביצועים הגבוהים של השיטה.
- תובנות לגבי השילוב של חלבוני קישור ל-RNA בעיבוד RNA.
מסקנות
- שיטת ה-iCLIP משפרת משמעותית את ההבנה של אינטראקציות RNA-חלבון.
- ניתן ליישם טכניקה זו במגוון מחקרים בביולוגיה של RNA.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל שיטה זו כדי לחקור רשתות ויסות מורכבות של RNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
מיפוי מדויק של אינטראקציות של חלבוני קשירה ל-RNA ברזולוציית נוקלאוטידים מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות ויסות פוסט-טרנסקריפציונליות בשלבי הגילוי המוקדמים. iCLIP מספק נתוני קשירה כמותיים ברחבי הטרנסקריפטום התומכים בתיקוף המטרה ובפיתוח בדיקות על ידי הגדרת ממשקי RNA-חלבון פונקציונליים בסגוליות גבוהה. יכולת זו משפרת את הביטחון החיזוי בזיהוי מובילים ומפחיתה עמימות ביולוגית בתוכניות טיפוליות ממוקדות-RNA.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי הגדרה מדויקת של אתרי אינטראקציה של חלבונים קושרי RNA לאורך כל התסריפטום.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה ישירה של מעורבות המטרה (target engagement) בהקשרים תאיים טבעיים.
- ערך חיזוי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי זיהוי אתרי קישור ברזולוציה של נוקלאוטיד בודד, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מקשרים עקיפים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: יוצר פרופילי קישור כמותיים וסטנדרטיים המתאימים להשוואת ביצועי בדיקות (assay benchmarking) ולהכנה לסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מייצר ספריות cDNA הניתנות לשחזור עם אתרי קישור צולב (cross-link) מוגדרים, מה שמאפשר שימוש חוזר וניתן להרחבה של הפלטפורמה עבור מטרות של חלבונים קושרי RNA.
- מוכנות הבדיקה: מסייע בהכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך הערכה המשכית של מודולטורים המשפיעים על אינטראקציות RNA-חלבון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות רלוונטיות למחלה באמצעות מיפוי של דינמיקת חלבונים קושרי RNA בהקשרים פתופיזיולוגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר התאמה של ביומרקרים תרגומיים באמצעות קורלציה בין תפוסת אתרי קישור לבין תוצאות פונקציונליות של עיבוד RNA.
- קידום מותאם סיכון: מספק מידע להמשכיות פרה-קלינית על ידי מתן תובנות מכניסטיות לגבי רשתות בקרה של RNA המושפעות מתרכובות מובילות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת iCLIP משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת מפות קישור ברזולוציה גבוהה המנחות כל שלב.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי זיהוי אינטראקציות ישירות של חלבונים קושרי RNA בדיוק של נוקלאוטיד בודד.
- סריקה: מספקת נתוני קישור כמותיים המוכנים לניסוי, המאפשרים הערכה אמינה של תרכובות ומידול של קשר מבנה-פעילות.
- אנליטיקה: מספקת פלטי מדידה הכוללים תדירות של אתרים מצלבים, העשרה של מוטיבי קישור ורזולוציה מיקומית לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאי הגילוי להמשכיות פרה-קלינית באמצעות דינמיקת אתרי קישור המיושרת למסמני ביולוגיים במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת ניתנת לשימוש חוזר לאפיון מגוון מטרות של חלבונים קושרי RNA בתחומי טיפול ובסוגי מטרות שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה, הפחתת עמימות מכניסטית במנגנוני בקרה של RNA.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של בדיקות קישור בכל רחבי הטרנסקריפטום בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של go/no-go, יעילות הון בתעדוף מטרות, והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות המכוונות ל-RNA.
- השפעה על הפורטפוליו: החלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נתוני מעורבות מטרה ישירים וב độ-רזולוציה גבוהה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של RNA, שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) והכנת ספריות לריצוף מהדור הבא (next-generation sequencing).
- תלוי בתשתית לקשירה צולבת באמצעות UV, ביכולות שטיפה קפדניות ובפלטפורמות ריצוף בעלות רגישות גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי הקשירה הצולבת, תיקוף של נוגדנים ותהליכי ביואינפורמטיקה לזיהוי אתרי חיתוך (cross-site detection).
- כולל שיקולי התאמה עבור שכיחויות משתנות של חלבונים קושרים RNA, יעילויות קשירה צולבת והקשרים של לוקליזציה תת-תאית.
- כולל מגבלות מעשיות כגון דרישות לכמות RNA קלט, שונות ביעילות הקשירה הצולבת ומורכבות ביואינפורמטית בזיהוי אתרי חיתוך.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
UV Cross-linking of Tissue Culture Cells
2:10
Bead Preparation
2:53
Cell Lysis and Partial RNA Digestion
3:47
Immunoprecipitation
4:26
RNA 5' End Labelling
5:08
SDS-PAGE and Membrane Transfer
6:27
Gel Purification of cDNA
8:44
Representative Results
10:00
Conclusion
