流式细胞仪分析小鼠主动脉内流的免疫细胞

Summary

本文介绍一个基于流式细胞仪的方法进行调查的主动脉免疫组成。该文件还说明了一个额外的技术，允许单独审视周围的外膜和血管壁。这种方法打开执行主动脉白细胞表型分析，适用于动脉粥样硬化研究的几种免疫检测的可能性。

Abstract

动脉粥样硬化是一种慢性炎症过程大中型船只的特点是形成泡沫细胞，免疫细胞，血管内皮细胞和平滑肌细胞，血小板，细胞外基质，具有广泛坏死富含脂质核心组成的斑块和周围组织纤维化¹先天免疫和适应性免疫反应的武器是参与动脉粥样硬化的启动，发展和^持久2，3是一个显着的证据机构，不同亚群的免疫细胞，如巨噬细胞，树突状细胞，T和B淋巴细胞，在目前的健康，易发生动脉粥样硬化^小鼠 4主动脉。此外，免疫细胞被发现在周围，这表明这个组织的重要作用，在动脉粥样^硬化的主动脉外膜2。

一段时间以来，不同类型的免疫细胞，它们的激活状态，和主动脉壁内细胞成分的定量检测RT - PCR和免疫组织化学方法对动脉粥样硬化的研究是有限的。作了一些尝试执行流式细胞仪利用人体的主动脉，和一些问题，如高自体荧光，已^报告 5,6 。人类动脉粥样硬化斑块1胶原酶消化，收集游离细胞和CD14的染色+ /表面CD11c +突出的巨噬细胞源性泡沫细胞。在这项研究中，一个“模拟”通道使用，以避免假阳性染色^。6坏死性材料，在消化过程中积累了大量的碎片，产生在主动脉样品的自体荧光上升。要解决这个问题，阴性和阳性对照小组已经提出，但只有双染色可以应用于这些样本。我们已经开发出一个新的流式细胞仪为基础的方法，分析免疫细胞的组成和特征的活化，增殖，免疫细胞分化的健康，易发生动脉粥样硬化主动脉。此方法使主动脉壁的免疫细胞组成的调查，并打开使用广谱的免疫学方法对这种疾病的免疫方面的调查的可能性。

Protocol

1。分离小鼠主动脉

机构IACUC委员会批准的程序是必需的工作与小鼠。

1. 准备加入肝素钠1000个单位，50毫升PBS和反相混合管heparinzed PBS。准备一个空的收集管的血液和集合管中，PBS为每个要收集的主动脉。所有管置于冰上。
2. Heparinize一个注射器吸取血（1000 U / ml的肝素钠0.1毫升），准备手术工具（两对弯钳，一双解剖剪刀，和一双的microshears），并为解剖解剖阶段。
3. 安乐死鼠标使用二氧化碳，在核准的商会，美国国立卫生研究院和机构IACUC委员会关于啮齿类动物安乐死的政策。将鼠标解剖阶段之前检查的有效性。
4. 简要地用70％乙醇浸泡鼠标和鼠标固定清扫阶段。鼠标通过心脏穿刺吸取血。
5. 打开腹部和胸部腔。使用一个25克针的10毫升注射器，完全用PBS含有肝素的2％，彻底清除血液从心脏穿刺血管的血管灌注。确保没有主动脉组织内的血液。应进行灌注，慢慢地与小的压力，以确保所有斑块在血管壁保持不变。
6. 解剖并取出内脏器官，泌尿生殖系统器官，膈肌和脾，使肾脏，心脏和主动脉完好无损。
7. 仔细解剖脂肪组织和腹主动脉旁淋巴结离主动脉，使主动脉和外膜完好。收集包括整个主动脉主动脉弓，升，降，胸，腹部分。将收集管中，用PBS的离体主动脉。在隔离过程中，尽量保持船只的湿润。

2。单细胞悬液的制备

1. 创建一个1X主动脉分解酶原液（ADES）（125 U / mL胶原酶型XI，透明质酸类型60 U / ml的1 - S，60 U / ml的DNA酶我，和我，在2.5毫升450 U / mL胶原酶类型PBS中，修改加尔金娜等^7）。所有的酶都是由Sigma - Aldrich公司。将股票酶液在冰上。
2. 从集合中删除包含主动脉管的PBS。加入2.5毫升的1X的ADE每个主动脉。切成小块的主动脉，以方便酶消化或保持整体主动脉不变。的主动脉孵育1小时1X酶的解决方案，在37 ° C（慢摇是可选的）。
3. 1小时的潜伏期后，准备从消化主动脉主动脉除了剪切和70微米的细胞过滤器通过流式细胞仪进入5毫升聚丙烯管（BD猎鹰）单细胞悬液。颗粒离心细胞（400xg，5分钟，4℃）。
4. 重悬细胞，流式细胞仪缓冲液（PBS，用1％BSA和0.05％NaN _的 3补充）1毫升和确定多少细胞是目前使用台盼蓝，血球，和光镜下的细胞悬浮液在主动脉。消化后获得的细胞总数将取决于对小鼠的年龄和饮食或动脉粥样硬化的严重程度。

3。流式细胞仪染色

1. 标签适当数量的新流式细胞仪管。在一般情况下，流式细胞仪检测实验应该有一个非彩色控制管，单一颜色的管，适当的荧光减一控制（FMO） ^的 8，相应的同型对照，实验管设置。既然有可以离体主动脉白细胞数量有限，脾脏白细胞可用于执行单一控制染色。
2. 我们用一个标准的流式细胞仪协议染色主动脉细胞悬液。简单地说，转移0.5 - 1 × 10 ⁶细胞成流式细胞仪管（S）的主动脉细胞悬液等分。新增离心1毫升流式细胞仪缓冲液和颗粒细胞。调迁从颗粒细胞中取出上清液。
3. 准备实验管，荧光减一管，和同型管FC块解决方案和抗体鸡尾酒。 FC流式细胞仪缓冲块（14.2μg/ml，克隆2.4G2）添加100μL管和手指轻弹，或轻轻涡旋悬浮细胞。 15-20分钟，在室温下孵育样本。
4. 准备抗体染色，染色亚型或鱼类统营处控制染色鸡尾酒。初步滴定实验确定最佳的抗体浓度。在FC块的存在，增加抗体鸡尾酒^{（100ul/0.5-1.0x10} 6细胞）的样品管。孵育20-30分钟，在4 ° C黑暗环境中。
5. 流式细胞仪缓冲1ml到每个管，涡旋混合，并沉淀，离心细胞。重复此过程，更多的时间。
6. 倒出上清液和重悬300μL的2％的煤灰颗粒细胞。流式细胞仪上运行的样本。
   • 注：通常情况下的抗CD45抗体（常见的白细胞抗原标记）被添加到所有的样本中，以^门 CD45 + ^白细胞后7此外，CD45的鱼类统营处和同型对照应该是最初^使用放置CD45 +白细胞门。 CD45的表达，可以改变其中白细胞。
   • 注：为了表达表面抗原或低的事件抗原检测密度低，使用“明亮的荧光，如R -藻红蛋白（PE）或变藻蓝蛋白（APC）”。此外，罕见的事件可以被检测到几个匹配的主动脉汇集在一起​​;然而，如果使用超过一百万个细胞，每个测试使用的抗体量应增加比例。
   • 注：为了确保有最小中分离出来的主动脉血液污染，因此在主动脉细胞悬液，在一些额外的染色实验TER - 119，红细胞（RBC）的表达抗原执行。红细胞数量在血液中白细胞（WBC）的大约10 × 10 ⁶细胞/μL8x10的³细胞/μL。主动脉样品的TER - 119表达的基础上，血源性样品中的白血细胞的比例可以计算的。通常情况下，我们已经在主动脉样品的血源性白细胞小于0.02％。 （图）
   • 注意：由于酶处理可能会影响表面抗原的表达，酶消化的阻力应为利益的抗原决定的。简单地说，周围淋巴结（PLN）或脾小块孵育在37 ° C或1小时没有酶的鸡尾酒1小时后，抗​​原的表达，流式细胞仪检测。酶的鸡尾酒有多个表面抗原（ 图^2）7没有影响。在另一些情况下，酶处理抗原表达的一个重大损失。这个问题可以规避使用替代细胞标记。
   • 注：活/死细胞活力染色可以执行第4步后，如果需要的话。通常使用活/死可以解决的死细胞染色试剂盒（Invitrogen公司，分子探针）。要活/死染料染色的细胞，创建一个加入PBS和涡1毫升重新溶解活/死染料加入1μl混合1X活/死的解决方案。加入100-200μl1X活/死染料的生活/死亡单，鸡尾酒，鱼类统营处和同型对照样品。孵育的样品在室温为10分钟，在黑暗中的染料。单一的控制管活/死应在56℃孵育° C黑暗的为10分钟，以杀死细胞热休克环境中。洗净用1毫升PBS和沉淀，离心细胞的细胞。在第5步恢复协议。
   • 注：细胞内的抗原和细胞因子的细胞内染色与此协议兼容。简单来说，细胞内染色可以使用BD Pharmingen公司，eBioscience公司，或Caltag实验室的细胞固定/通透试剂 - 根据感兴趣的抗原。为了修复和通透细胞内染色的细胞，固定/通透步骤执行后，制造商的指示后，细胞染色步骤（第3条第5步）。细胞内的洗涤步骤，在第6步（第3条第6步）恢复我们的协议。

4。流量隔离周围的外膜和血管壁的流式细胞仪分析

由于白细胞可以移植到主动脉外膜以及主动脉壁内动脉粥样硬化斑块外膜和主动脉白细胞流式细胞仪研究开发一种隔离和执行这两个解剖部位流式细胞仪的协议^9。简要之前，整个主动脉消化与主动脉外膜部分被消化和删除其余船只ADES（第2，第2步）。一旦外膜被删除，并预留，其余主动脉消化的ADE解放白细胞从血管壁。

• 主动脉外膜隔离协议

1. 以下1X的ADE（第2条第1步）的准备，准备为2.5毫升/ 1X主动脉外膜消化酶液（AADES）（781.25 ü胶原酶II和14.0625 ü弹性蛋白酶2.5mls PBS（沃辛顿生化公司，新泽西州莱克伍德的主动脉上，直到用冰^））9将原液。
2. 从集合中删除包含主动脉管的PBS。加入2.5毫升的1X AADES每个主动脉。不要切成小块的主动脉。 1X外膜酶液的主动脉孵育10-20分钟，在37 ° C。
3. 10-20分钟的消化之后，部分消化的主动脉1X AADES转移到用新鲜PBS的培养皿中。非常仔细，使用两弯钳，剥离外膜层远离FROM主动脉作为一个单元。
   • 注意：较长的消化时间，使其更易于去除外膜;但是，如果外膜消化，它会撕裂。
4. 当外膜被完全删除，转移的外膜和主动脉管单独的流式细胞仪。新增的PBS 1ml至外膜管，管置于冰上。 1X主动脉分解酶液加入2.5毫升的主动脉管40分钟，主动脉，并在37 ° C。
   • 注：为了促进消化酶，主动脉可分为较小的部分，在这一点上最多。
5. 40分钟的消化之后，放置在冰主动脉管，剪切的主动脉和外膜分开，通过流式细胞仪进入5毫升聚丙烯管（BD猎鹰）70微米的细胞过滤器，并准备从主动脉和外膜单细胞悬液。颗粒离心细胞（400xg，5分钟，4℃）。返回到第2条第4步和恢复的协议。

5。代表性的成果

在这里，我们目前的数字表明流式细胞仪染色分析免疫成分的全主动脉，主动脉血管壁和周围的主动脉外膜。首先，我们展示了一个有代表性的流式细胞仪图显示一个TER - 119全血和离体主动脉细胞悬液（ 图1）染色。 TER - 119阳性红细胞占18％主动脉细胞悬液，这表明，只有0.014％，从主动脉细胞悬浮液中分离出的细胞是血源性细胞。这是一个重要的控制实验，清楚地表明，消化船只，但不循环外周血为主动脉细胞悬液分析的最白细胞的来源。此外，为验证方法，我们评估主动脉解离脾细胞表面抗原的酶鸡尾酒（ 图 2）的影响。酶鸡尾酒几个抗原，包括CD45，CD19 +，CD3 +，TCRαβ，TCRγδ和其他几个表面抗原的表达没有影响。

CD45的结合活/死的可行性染料和适当的同型对照染色用于检测和分闸的主要群体的利益，并排除在分析过程中的细胞碎片。在图3，现场主动脉CD45 ⁺白细胞干扰素的百分比来确定的_门 Υ+ T细胞内两个年轻的 APOE汇集^{主动脉- / -}小鼠。为了强调这种方法的通用性，使用门控图3中提出的计划， 我们目前在图代表从两个ApoE基因的细胞内染色CD68 +细胞CD11b +巨噬细胞和^{IFNγ+TCRαβ+细胞} - / -小鼠的西方饮食喂养12周。正如预期的那样在西方饮食喂养ApoE基因 ， ^{- / -}主动脉，主动脉内的大多数白细胞，巨噬细胞（40％CD68 +细胞CD11b +）或其他髓系细胞（细胞^CD11b + CD68低和CD11b + CD68 -）。此外，Th1细胞组成的TCRαβT细胞（ 图4）浸润主动脉的主要部分。由于主动脉白细胞和白细胞亚群的整体比例取决于鼠标的年龄和动脉粥样硬化的严重程度不同，关心的重大人口的最佳浇注战略应凭经验确定

为了证明隔离流式细胞仪染色的主动脉外膜的可行性，我们^目前代表CD45 +主动脉和外膜细胞悬浮液中白细胞染色（ 图 5 ）。简单地说，三岁的ApoE基因 ^{- / -}小鼠主动脉被消化和汇集如上所述（第2和第4条）。浸润的^CD45 +白细胞检测在外膜的细胞悬液（18％），其余主动脉（11％）的细胞悬液。

图1。TER - 119染色消化主动脉细胞悬液。主动脉灌注心脏穿刺用PBS含2％肝素。然后在主动脉消化在37 ° C，1小时的酶鸡尾酒主动脉细胞悬液和血液样本（作为阳性对照）与反TER - 119 - PE ABS染色​​和流式细胞仪分析。 TER - 119阳性红细胞占18％主动脉细胞悬浮表明，只有0.014％，从主动脉隔离所有白细胞可能是血源性白细胞中的所有细胞。

图2。酶鸡尾酒疗法CD45（顶部）或CD19（底部）对淋巴细胞的表达没有影响 。 + / CD19 ⁺淋巴细胞的百分比。资料是对CD45 ⁺白细胞门。

图3浇注战略分析主动脉白细胞中分离出两个主动脉和汇集从容易发生动脉粥样硬化ApoE基因 ^{- / -}小鼠和主动脉细胞悬液的制备如上所述。细胞悬浮液染色CD45（PerCP），TCRαβ（FITC），γ干扰素（eFluor 450），和活/死的Aqua，并使用一个Cytek DXP的8色升级BD流式细胞仪刀魂分析。简言之，CD45 ⁺白细胞门（二）进一步分析（CF）。从死细胞活/死的Aqua染色（D）和FSC的阴谋（五）为基础的分析。现场主动脉白细胞，然后TCRαβ和IFNγ表达（F）的研究。

图4。细胞内的抗原和细胞因子的细胞内染色细胞悬液的制备从一个整体 ^{的ApoE基因} - / -主动脉和脾。在主动脉（A）和脾（B，C）的细胞悬浮液染色CD45，CD11b的，和CD68或同型对照使用BD Cytofix / Cytoperm™试剂盒（BD Biosciences公司）。细胞上的CD45 ⁺白细胞gated和碎片被排除在外的基础上正向和侧向散射配置文件。细胞内IFNγ染色，主动脉和脾细胞悬浮培养与高尔基停止，PMA和离子霉素彗星为辅的RPMI 1640五小时，如前面描述的。刺激单主动脉（D）和脾脏（E，F）的细胞悬浮液随后，TCRαβCD45（PerCP）（FITC），CD3（APC - Cy7）染色，过死的Aqua和IFNγ（eFluor 450，E）或亚型（IgG1的eF450，女）。 T细胞（DF）的门生活CD45 + CD3 +白细胞（CD45 +活/死的Aqua）和TCRαβ和IFNγ检查。

图5。孤立的小鼠主动脉外膜和主动脉血管壁的代表形象代表流式细胞仪计数器情节演示^的 CD45 +存在T细胞外膜和主动脉壁岁 ^{ApoE基因- /} -小鼠。 SSC的侧向散射。要消除碎片和坏死组织的自体荧光，情节对FSC> 750门。为了避免额外的自体荧光的大门也被设置为南南合作<3500 <3500，FSC双峰。百分比表示CD45 ⁺细胞的大门。

Discussion

在这里，我们提出了一个基于流式细胞仪检测的免疫细胞组成的小鼠主动脉的调查方法。这种方法的主要优点是能够分析主动脉免疫细胞在单细胞水平和表征主动脉白细胞的激活状态。这种方法不仅限于小鼠主动脉和我们（未发表数据）和^其他 10用这种方法来分析人体标本，如乳内动脉，主动脉瓣和冠状动脉。这种方法的一个限制是恢复单一主动脉小鼠主动脉白细胞数量相对较少。虽然从单一的动脉粥样硬化主动脉恢复白细胞数量是足够的流式细胞仪检测实验，细胞丰度低，可能很难检测到在一个单一的主动脉细胞悬液。如果必要的话，这个问题是可以规避使用2-4流式细胞仪染色的主动脉合并样品。此外，由于酶处理可能会影响表面抗原的表达，酶处理的阻力应为所有感兴趣的抗原决定的。之前我们已经验证了几个抗原的标记，这是由^酶消化7的影响。但是，未经测试的抗体克隆，应确认使用流式细胞仪检测^实验 7前的调查。

竞争继转移归位检测是一个功能强大的方法来分析动力学和机制的炎症部位的白细胞招聘。我们成功地应用于流流式细胞仪分析受体小鼠主动脉的主动脉调查白细胞迁移的机制。分析最近增殖细胞，加入溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）在体内可以被用来作为一个优秀的增殖细胞标记。以下流式细胞仪分析，以检测抗原特异性T细胞在受体小鼠的主动脉与应用这项技术。

有越来越多的证据表明，主动脉外膜在动脉粥样硬化起着重要作用。免疫组织化学染色的主动脉与周围的外膜提供有关分析组织内白细胞本地化的基本数据，但在白细胞亚群的细致刻画的一些限制。我们开发的分析和主动脉周围的外膜分开⁹这个激动人心的新流式细胞仪为基础的技术，结合完善的组织学和分子为基础的技术，允许一个基于流式细胞仪的方法，将有助于确定可能存在的差异，表型和外膜和血管壁的居住白细胞的功能特点。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase XI	Sigma-Aldrich	C7657
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
DNase I, type 2	Sigma-Aldrich	D4527
Collagenase I	Sigma-Aldrich	C0130
Collagenase II	Worthington Biochemical	LS004174
Elastase	Worthington Biochemical	LS002292