Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nucleocapsid Annealing-medieret Electrophoresis (NAME) Indhold Tillader hurtig identifikation af HIV-1 nucleocapsid inhibitorer

Published: January 19, 2015 doi: 10.3791/52474
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2The RNA Institute, SUNY Albany

Abstract

RNA eller DNA foldet i en stabil tredimensional foldning er interessante mål i udviklingen af ​​antitumor eller antivirale lægemidler. I tilfælde af HIV-1, virale proteiner involveret i reguleringen af ​​virusaktivitet genkende flere nukleinsyrer. Nukleocapsidproteinet NCp7 (NC) er et centralt protein regulerer flere processer i virusreplikation. NC er i virkeligheden en chaperone destabilisere sekundære strukturer af RNA og DNA og lette deres annealing. Inaktivering af NC er en ny tilgang og et interessant mål for anti-HIV-behandling. N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (navn) assay blev udviklet til at identificere molekyler stand til at inhibere smelte- og annealing af RNA og DNA foldet i termodynamisk stabile tredimensionale konformationer såsom hårnålestrukturer af tjære og cTAR elementer af HIV ved nukleokapsidproteinet af HIV-1. Den nye assay anvender enten recombinant eller syntetisk protein og oligonukleotider uden behov for deres tidligere mærkning. Analysen af ​​resultaterne opnået ved standard polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) efterfulgt af konventionel nukleinsyre farvning. Protokollen rapporteret i dette arbejde beskriver, hvordan man udfører NAME assay med fuld-længde protein eller dets trunkeret version mangler den grundlæggende N-terminale domæne, såvel kompetent nukleinsyrer chaperoner, og hvordan man vurderer inhiberingen af ​​NC chaperone-aktivitet ved en threading interkalator. Desuden kan NAME udføres i to forskellige tilstande, nyttigt at få indikationer på den formodede virkningsmekanisme af de identificerede NC-hæmmere.

Introduction

Nukleocapsidproteinet NCp7 (NC) af human immundefekt virus type 1 (HIV-1) er en lille, basisk protein, der er tæt forbundet med genomisk RNA i modne infektiøse virus, spiller en afgørende rolle i virusreplikation som en cofaktor under revers transkription , genom anerkendelse, og emballage. 1-3 NC fungerer som en nukleinsyre anstandsdame katalyserer destabilisering af stabile nukleinsyrestrukturer og annealing af komplementære sekvenser. Dens nukleinsyre aggregere aktivitet findes primært i de 11 aminosyrer N-terminalt domæne, mens duplex destabiliserende aktivitet er blevet kortlagt til sine zinkfinger strukturer (12-55 peptid). 4 positivt ladede protein sænker elektrostatisk barriere annealingreaktionen og øger den hastighed, ved hvilken to separate komplementære sekvenser mødes.

Nukleinsyrer foldet i stabil konformation kræver chaperonen aktiviteter NC til facilitate deres annealing 5 Dette er især vigtigt i revers transkription, hvor NC er kritisk i streng transfer events:. i minus streng overførsel minusstrengen stopper DNA, blot retrotranskriberet, skal overføres og annealet til en komplementær sekvens i R regionen ved 3 'enden af RNA-genomet skabelon. 6 Selv termodynamisk begunstiget, denne reaktion ikke forekommer i vid udstrækning i fravær af NC på grund af tilstedeværelsen af den stabile struktur af trans aktivering responsive region (TAR) RNA i R regioner der skal være knyttet til dens DNA-kopi (cTAR DNA). 7 cTAR og TAR er faktisk meget strukturerede regioner med en karakteristisk hårnåle-konformation. NC protein denaturerer disse hårnåle, og fremmer minus-streng overførsel ved at øge hastigheden af ​​intermolekylære annealing mellem de komplementære nukleinsyrestrenge. Mekanismen for NC annealing af tjære og cTAR er blevet grundigt undersøgt, og debeskrevet som TAR annealing assay i flere forskningsartikler og den foreslåede ordning er afbildet i fremragende anmeldelser. 8-11 Sammenfattende NC destabiliserer den sekundære struktur af stabile RNA såsom TAR-RNA, destabiliserer den sekundære struktur af dens komplementære sekvens, cTAR-DNA og fremmer annealingreaktionen af RNA / DNA fører til TAR / cTAR heteroduplex formation. 10,11 Som et resultat, er trin streng-overførsel under HIV-replikation begunstiget. 12

NC er et attraktivt mål for udviklingen af nye antivirale midler, idet potentiel interferens fremkaldt af små molekyler mod NC ville resultere i en reduktion af revers transkription af det virale genom som følge af en kompromitteret NC aktivitet. 2,13 Denne metode kunne sidste ende føre til udviklingen af ​​vellykkede anti-HIV-midler. I løbet af en screening for NC hæmmere 14 udviklede vi et assay stole på de velkendte egenskaberaf nukleocapsid til effektivt destabilisere og Anneal komplementære oligonukleotider. 10,11 Vi kaldte det N ucleocapsid En nnealing- M ediated E lectrophoresis (navn) assay. NAME assay bruger NC at mediere annealing mellem stabilt strukturerede kopier af komplementære nukleinsyrer, i vores tilfælde af oligonukleotidet svarer til den apikale del af en TAR-RNA-sekvens med dens komplementære DNA-sekvens (cTAR) til opnåelse af hybrid TAR / cTAR heteroduplex . Analysen af ​​TAR / cTAR annealing reaktion i nærvær af NC kan undersøges ved nativ polyacrylamidgelelektroforese (PAGE).

Denne protokol viser, hvordan man udfører NAME assay til hurtigt at anneale ved stuetemperatur oligonucleotider foldet i stabile hårnålestrukturer, hvordan man kan analysere resultatet af reaktionen og eventuel fejlfinding af eksperimentet. Der ikke anmodes radioaktiv mærkning af nukleinsyre, og Detectipå oligonukleotidprimere bånd kan udføres ved konventionelle farvningsmetoder. Assayet, der anvender enten det rekombinante protein med fuld længde eller et trunkeret syntetisk version af NC, tillader identifikation af gevindskæring interkalatorer hæmmer NC, en aktivitet vist sig at korrelere med en stærk binding til RNA og DNA. 14

Protocol

1. Fremstilling af materiale, nukleinsyrer og proteiner

  1. Nucleic Acids
    1. Autoklaver de 1,5 ml rør og gemme dem i en steril beholder. Udfør hvert skridt sterile filter tips til at fjerne kontaminerende stoffer dvs nukleaser fra laboratorie hjælpematerialer.
    2. Forbered Tris-HCI 10 mM pH 7,5 i DEPC-behandlet vand og filtreres med et 0,22 um porestørrelse.
    3. BEMÆRK: oligonukleotid kaldes "TAR" svarer til den korte (29-mer) RNA-sekvens 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 '15, mens cTAR er dens DNA komplementær sekvens 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3'.
      1. Opløse både TAR og cTAR i Tris buffer ovennævnte (1.1.2.) For at gøre 100 um stamopløsninger. Store cTAR stamopløsning ved -20 ° C (alikvoter kan opbevares i måneder under disse betingelser). For langtidsopbevaring af RNA, gør 20 pi alikvoter af TARstamopløsning, tørre hver alikvot ved hjælp af en vakuumkoncentrator centrifuge og opbevare dem ved -80 ° C. Frisk før brugen, resuspender hver TAR alikvot i 20 pi DEPC-behandlet vand.
        BEMÆRK: Working TAR alikvoter kan opbevares ved -20 ° C i to uger.
  2. NC-protein og (12-55) NC-peptid
    1. Forbered fuldlængde rekombinant NC protein som rapporteret. 16. Opbevar stamopløsning i aliquoter ved -20 ° C. Bestem den nøjagtige proteinkoncentration med en UV-Vis spektrofotometer ved anvendelse af en ekstinktionskoefficient ved 280 nm på 6410 M-1 cm-1.
    2. Resuspender syntetisk (12-55) NC peptid i Tris-HCI 10 mM pH 7,5 og opbevares stamopløsning i aliquoter ved -20 ° C. Bestem den korrekte peptid koncentration på et UV-Vis spektrofotometer under anvendelse af en ekstinktionskoefficient ved 280 nm på 5.700 M-1 cm-1.
      BEMÆRK: (12-55) NC-peptid blev opnået HPLC renset og lyophilized ud af en opløsning indeholdende to ækvivalenter zinkchlorid.
  3. Forbindelse 1
    1. Omkring 1 mg af det lyofiliserede forbindelse 1 afvejes under anvendelse af en analytisk vægt og opløse det i 100 pi 100% DMSO, belejligt vejet, til opnåelse af en høj koncentration (≈10 mM) stamopløsning. Bestem den nøjagtige forbindelseskoncentration på et UV-Vis spektrofotometer bruge sin ekstinktionskoefficient (ved 354 nm: 11387 M-1 cm-1). Opbevar stamopløsning i mørke ved -20 ° C før brug.

2. Opsætning af Gel Apparater og Støbning af gelen

  1. For at opsætte gelen, skylles to plader (en lang og en kortere) med 70% ethanol, lad dem tørre, og derefter placere to 1 mm afstandsstykker langs de lange kanter på længere plade; dække det med den korte plade, og sørg for at bringe de to plader i bunden.
  2. At kaste gelen Følg instruktionerne fra supplier (forskellige leverandører bruger lidt forskellige apparater, sandwich klemmer og stakke leveres af hver støbning apparater). I alle tilfælde skal du sørge for, at klemmer, stakke og pakninger er rene, og fjerne spor af acrylamid efterladt af tidligere brugere.
  3. Placer samlet gel sandwich i støbning stå og følge specifikke instrukser af leverandøren.
    BEMÆRK: Normalt en ren silikonepakning nederst støbning slot sikrer en god tætning og hjælper til at undgå lækager, når hælde gelen.
  4. For at kontrollere for utætheder, hæld destilleret vand med en pipette mellem glaspladerne. Tilsæt vand til at fylde sandwich og vente nogle minutter for at sikre, at der ikke lækager opstår. Hvis sandwich er samlet korrekt, fjerne vandet og indsætte et filter papir mellem de to glas tørre glassene. Fjern papiret, og nu sandwich er klar til gelstøbning.
  5. Hæld gelen ved stuetemperatur (RT, 25 ° C). Da polyacrylamid er yderst neurotoksisk, brug handsker. Ose kontinuerlig 12% polyacrylamidgeler i ikke-denatureringen (native) betingelser for at udføre NAME assay.
    1. Gelopløsningen laves 12%: bland 12 ml 40% acrylamid / bisacrylamid (19/1) opløsning, 4 ml TBE 10x buffer (10x: Tris-HCI 890 mM, borat 890 mM, EDTA 20 mM) og 24 ml MilliQ vand . Tilføj 400 pi APS og 50 pi TEMED umiddelbart før brug. Bland opløsningen og hurtigt at bruge en pipette til at hælde opløsningen ned mellem glasplader. Indførelse kammen mellem glaspladerne, undgå bobler. Tilføj gelopløsning at fylde sandwich fuldstændigt.
  6. Lad gelen polymerisere i 45 minutter til 1 time. Umiddelbart før prøvepåsætning fjernes kammen langsomt og skyl brøndene grundigt med destilleret vand.
  7. Efter polymeriseringen og brønde skylning trin, følge de specifikke anvisninger, som leverandøren at placere gel sandwich i apparatet til lodret gelelektroforese. Hvis et kølesystem er til stede, skal du sørge for at placere gel system i correkte position afkøling kerne.
  8. Hvis systemet er designet til at håndtere mere end en gel, men kun én gel skal køres, vedhæfte en gel sandwich som buffer dæmning til afkøling kerne på den anden side for at danne den komplette øvre bufferkammer.
    NB: hvis dæmningen ikke er placeret korrekt, vil den øvre buffer lække eventuelt standser gel løb.
  9. Forbered 2,5 L af TBE løbende buffer (1x: Tris-HCI 89 mM, borat 89 mM, EDTA 2 mM) i deioniseret vand. Indsat ca. 500 ml TBE-buffer for den øvre bufferkammer og hæld resten i den nederste bufferkammeret. Hæld de resterende 500 ml TBE-buffer i det øvre bufferkammer.
  10. Låget lægges på toppen af ​​det nedre bufferkammeret, således at anoden og katoden er i den korrekte position.
  11. Tilslut køling kerne, hvis den findes, til en vandhane ved hjælp slanger. Fyld kerne med ledningsvand, der vil fungere som en køleplade under elektroforese, og lad ledningsvand cirkulere gennem kernen under udvalgterophoresis.

3. nucleocapsid Annealing-medieret Electrophoresis (NAME) Indhold

  1. Fremstilling af buffere
    1. Forbered TNMg puffer (1x: Tris-HCI 10 mM, NaCI 20 mM, Mg (CLO 4) 2 1 mM, pH 7,5) i DEPC-behandlet vand og filtreres med et 0,22 um porestørrelse.
      BEMÆRK: TNMg buffer kan opbevares ved 4 ° C i op til 7 dage. For de bedste folde og annealing resultater, anbefaler vi brug af frisk gjort buffere.
    2. Gelopløsningen Loading Buffer indeholdende SDS (GLB SDS: Tris-HCI 100 mM, EDTA 4 mM, 50% w / v glycerol, 2% vægt / vol SDS, 0,05% w / v bromphenolblåt) i DEPC-behandlet vand.
      BEMÆRK: GLB hjælper til at spore, hvor langt oligonucleotider prøver kører ind i gelen, og gør det muligt at synke prøverne ind i gelen. Tilsætning af SDS til GLB er et afgørende skridt for den optimale succes NAME assay. Hvis dette trin ikke følges, er det ikke muligt at skelne mellem nucleinsyrer band i GEl (figur 2).
  2. Styrer forberedelse
    1. Fortynd serielt de oligonukleotider stamopløsninger og bruge frisk gjort 10 uM løsninger til at forberede 10 pi af en 1 uM opløsning af TAR. Forbered på samme måde, hver for sig, 10 pi af en 1 uM cTAR i TNMg 1x buffer. Varm hvert rør til 95 ° C i 5 minutter og lad det derefter køle af til stuetemperatur, for tjære og cTAR at påtage sig deres stamme-bule-loop strukturer.
    2. Forbered 1 uM opløsning af hybrid TAR / cTAR som kontrol. Bland 1 pi 10 pM TAR med 1 pi 10 pM cTAR i TNMg 1x, i et totalt volumen på 10 pi. Denaturere oligonucleotider ved at opvarme røret til 95 ° C i 5 minutter og overlade det til langsomt at afkøle til stuetemperatur for at TAR at anneale til dens komplementære sekvens cTAR og danne den dobbeltstrengede hybrid TAR / cTAR.
    3. Når opløsningerne er afkølet til stuetemperatur, udføre en kort centrifugering centrifugering. Tilsæt 3 pi GLB SDS, pipette each løsning inden i røret 3 gange og lægge røret på is. Hold kontrolprøverne støt på is, indtil lastning skridt.
  3. Prøver forberedelse til at analysere NC protein og (12-55) NC-peptid-aktivitet
    1. Brug 2,5 pi frisklavet 4 uM oligonukleotid løsning for hver prøve. Forberede altid lidt overskydende mængde af hver opløsning for at forhindre pipetteringsfejl. Fold 32,5 pi 4 pM opløsning af tjære og særskilt af cTAR i TNMg 1x buffer som rapporteret til fremstilling kontrol ovennævnte (trin 3.2.1.).
    2. Stamopløsningen af ​​både NC protein og (12-55) NC-peptid til 80 uM løsning med MilliQ vand fortyndes.
    3. Når TAR og cTAR løsninger afkølet til stuetemperatur, udføre en kort centrifugering centrifugering af begge rør og begynde udarbejdelsen af ​​de prøver rør.
    4. Forbered 12 tomme 0,5 ml autoklaveres rør. Placer 3 rækker 4 rør i rack til lab prøver. Hver række viser henholdsvis prøverne til analyse the fuld længde NC-proteinet, til prøver uden protein og prøverne analysere (12-55) NC-peptid-aktivitet.
    5. Udskift altid tips hver gang en anden reagens anvendes.
    6. Tilføj i hvert rør 2,5 pi foldet TAR og 2,5 pi foldet cTAR. Tilføj 4 pi DEPC-behandlet vand til prøverne til analyse af NC og (12-55) NC. Tilsæt 5 pi DEPC-behandlet vand til de andre prøver.
    7. Tilsæt 1 pi 80 pM NC eller 1 pi 80 pM (12-55) NC til prøverne for henholdsvis NC eller (12-55) NC-analyse.
    8. Tilføj umiddelbart 3 pi GLB SDS til tid 0 min prøver (rapporteret som 0 'i figur 1), pipettering af opløsningen inden hvert rør 3 gange, og endelig sætte røret på is. Gentag dette trin for alle prøver og kontroller. Hold prøverne støt på is, indtil lastning skridt.
    9. Efter 15 min, 30 min og 1 time inkubation ved stuetemperatur tilsættes 3 ​​pi GLB SDS, pipette opløsningen inde each rør 3 gange og lægge røret på is. Gentag dette trin for alle prøver og kontroller, henholdsvis, og holde på is, indtil lastning skridt.
    10. Fjern låget gel apparatet. Load 13 pi af hver prøve i brøndene dannet som tidligere beskrevet ved støbning af gelen med et godt dannende kam. Læg prøverne i den rækkefølge rapporteret i figur 1.
    11. Sæt låg gel apparatet. Fastgør ledningerne gel apparatet til strømforsyningen. Kontroller, at elektroderne er sat i de korrekte holdere i strømforsyningen.
    12. Tænd og køre gelen i 2 timer og 30 minutter ved en konstant spænding på 200 V, indtil farvestoffet har migreret til 1,5 cm over bunden af ​​gelen.
  4. Forberedelse af prøver til analyse anthraquinon aktivitet på NC og (12-55) NC
    1. Forbindelsen 1 stamopløsning fortyndes. Forbered 10 pi 500 pM, 250 pM, 50 pM, 5 pM fortynding af forbindelse <strong> 1 i MilliQ vand.
    2. Forbered kontrolprøver som rapporteret ovenfor (punkt 3.2.).
    3. Brug 2,5 pi frisklavet 4 uM oligonukleotid løsning for hver prøve. Forberede altid lidt overskydende mængde af hver opløsning for at forhindre pipetteringsfejl. Fold 27,5 pi 4 pM opløsning af tjære og særskilt af cTAR i TNMg 1x buffer som ovenfor nævnt (trin 3.2.1.).
    4. Stamopløsningen af ​​både NC-protein og (12-55) NC peptid til 80 uM opløsning i vand fortyndes.
    5. Når TAR og cTAR løsninger afkølet til stuetemperatur, udføre en kort centrifugering centrifugering af begge rør og begynde at udarbejde prøverne.
    6. Forbered 20 tomme 0,5 ml autoklaveres rør. Placer 2 rækker med 10 tuber, som hver i rack til lab prøver.
    7. Udskift altid tips hver gang en anden reagens anvendes.
    8. Tilføj alle rør i den første række med 2,5 pi foldet TAR. Tilføj alle rør i den anden række med 2,5 pi foldet cTAR.
      9. 1 fortynding (stigende koncentration fra 5 pm til 500 uM fortynding) til TAR og til cTAR. Udskift forbindelsen med vand i prøverne til analyse af NC og (12-55) NC i fravær af forbindelse. Inkuber prøverne i 15 minutter ved stuetemperatur.
    9. Efter 15 min inkubation blande cTAR prøver (rør af anden række) med korrespondent TAR prøver (rør af første række).
    10. Tilføj 1 pi 80 pM NC eller 1 pi 80 pM (12-55) NC til prøverne for NC eller (12-55) NC analyse hhv.
    11. Efter 15 min inkubation tilsættes 3 ​​pi GLB SDS, pipette hvert rør 3 gange og lægge røret på is. Gentag dette trin, henholdsvis ved hjælp af prøver til NC og (12-55) NC-analyse. Hold prøverne støt på is, indtil lastning skridt.
    12. Fjern låget gel apparatet. Load 13 pi af hver prøve i brøndene. Læg prøverne i den rækkefølge rapporteret i figure 3B.
    13. Sæt låg gel apparatet. Fastgør ledningerne gel apparatet til strømforsyningen. Kontroller, at elektroderne er sat i de korrekte holdere i strømforsyningen.
    14. Tænd og køre gelen i 2 timer og 30 minutter ved en konstant spænding på 200 V, indtil farvestoffet har migreret til 1,5 cm over bunden af ​​gelen.
  5. Forberedelse af prøven: Oligo-præinkubation tilstand vs NC-præinkubation tilstand
    1. Fortynd forbindelsen 1 stamopløsning. Forbered 10 pi 500 pM, 250 pM, 50 pM, 5 pM fortynding af forbindelse 1 i MilliQ vand.
    2. Forbered kontrolprøver som rapporteret ovenfor (punkt 3.2.).
    3. Brug 2,5 pi 4 pM oligonukleotid løsning til hver prøve. Forberede altid lidt overskydende mængde af hver opløsning for at forhindre pipetteringsfejl. Fold 27,5 pi 4 pM opløsning af tjære og særskilt af cTAR i TNMg 1x buffer som ovenfor nævnt (trin 3.2.1.).
    4. Stamopløsningen af ​​både NC-protein og (12-55) NC peptid til 80 uM opløsning i vand fortyndes.
    5. Når TAR og cTAR løsninger afkølet til stuetemperatur, udføre en kort centrifugering centrifugering af begge rør og begynde at udarbejde prøverne.
    6. Udskift altid tips hver gang reagenser ændres, eller hvis der er rørt anden væske eller opløsning i reagensglas.
    7. Fra dette trin på sørg for tydeligt mærke og adskille prøver til de to forskellige Præinkubering procedurer.
      1. Oligo-præinkubation tilstand
        1. Forbered 10 tomme 0,5 ml autoklaveres rør. Placer 2 rækker med 5 rør i rack til lab prøver.
        2. Tilføj i hvert rør af den første række 2,5 pi foldet TAR. Tilføj i hvert rør i den anden række 2,5 pi foldet cTAR.
        3. Tilsæt 2 pi af den passende forbindelse 1 fortynding (stigende koncentration fra 5 pm til 500 uM fortynding) til TAR og til cTAR.Udskift forbindelsen med vand i prøverne til analyse af NC i fravær af forbindelse. Inkuber prøverne i 15 minutter ved stuetemperatur.
        4. Efter 15 min inkubation tage cTAR prøver (anden række) og sætte dem med de korrespondent TAR prøver (første række).
        5. Tilsæt 1 pi 80 pM NC til hver prøve og inkuber prøverne i 15 minutter ved stuetemperatur.
        6. Efter 15 min inkubation tilsættes 3 ​​pi GLB SDS, pipette hvert rør 3 gange og lægge røret på is. Hold prøverne støt på is, indtil lastning skridt.
      2. NC-præinkubation tilstand
        1. Forbered 5 tomme 0,5 ml autoklaveret rør og placere dem i rack til lab prøver.
        2. Tilføj i hvert rør 4 pi af den passende forbindelse 1 fortynding (stigende koncentration fra 5 pM til 500 pM fortynding). Udskift forbindelsen med vand i prøverne til analyse af NC i fravær af forbindelse.
        3. Tilføj i hvert rør 1 pi 80 μM NC og inkuberes prøverne i 15 minutter ved stuetemperatur.
        4. Bland 15 pi foldet TAR med 15 pi foldet cTAR i et rør og bruger denne TAR + cTAR opløsning i det næste trin.
        5. Efter 15 minutters inkubation tilsættes til hver prøve 5 pi TAR + cTAR mix opløsning og inkuber prøverne i 15 minutter ved stuetemperatur.
        6. Efter 15 min inkubation tilsættes 3 ​​pi GLB SDS, pipette hvert rør 3 gange og lægge røret på is. Hold prøverne støt på is, indtil lastning skridt.
          BEMÆRK: Fra trin 3.5.8 på, kan analysen udføres med alle prøverne (Genoptag fra 3.5.7).
    8. Fjern låget gel apparatet. Load 13 pi af hver prøve i brøndene. Læg prøverne i den rækkefølge rapporteret i figur 4.
    9. Sæt låg gel apparatet. Fastgør ledningerne gel apparatet til strømforsyningen. Kontroller, at elektroderne er sat i de korrekte holdere i magt supply.
    10. Tænd og køre gelen i 2 timer og 30 minutter ved en konstant spænding på 200 V, indtil farvestoffet har migreret til 1,5 cm over bunden af ​​gelen.

4. Fjernelse af Gel og Gel farvning

  1. Efter elektroforese slukke for strømmen, og tag de elektriske ledninger. Sluk for vandhanen af ​​kølesystemet og afbryd slanger fra kernen.
  2. Fjern låget, og hvis systemet blev afkølet, fjernes køling kerne og hæld bufferen fra begge kamre.
  3. Forsigtigt adskille gel sandwich fra apparatet og fjerne alle klemmer fra glaspladerne. For at fjerne gelen fra pladerne, skubbe en af ​​afstandsstykkerne ud til siden af ​​pladerne og drej den forsigtigt at trække op og væk den øverste glasplade. Tag fat to hjørner af gel og løft det forsigtigt for at fjerne den fra glasset.
  4. Gelen anbringes i en egnet beholder med den ønskede nukleinsyrer farvningsopløsning for30-45 min under omrøring.
  5. Efter farvning gelen på en transilluminator imaging system til at detektere nukleinsyrer fluorescenssignal i gelen system.

Representative Results

Figur 1 viser et repræsentativt resultat af nukleokapsidproteinet Annealing Mediated elektroforese (NAME) assay udføres i) med fuld-længde rekombinant protein, ii) uden proteinet, dvs. blanding cTAR + TAR og inkubering op til 1 time ved stuetemperatur, og iii ) det samme assay udført med (12-55) NC, et syntetisk peptid der mangler de 11 aminosyrer af N-terminal domæne. Den præ-foldede TAR og cTAR blev blandet og dannelsen af den annealede heteroduplex TAR / cTAR blev overvåget i nærvær af fuldlængde rekombinant NC (venstre baner i figur 1), i fravær af protein (centrale baner i figur 1 ), og i nærvær af det trunkerede (12-55) NC peptid (højre baner i figur 1). Kontrol er: foldet cTAR, foldede TAR, og afhærdet hybrid (TAR / cTAR), opnået ved termisk denaturering af de stabilt foldede strukturer TAR til cTAR efterfulgt af deres langsomme annealing. 14

Evnen af ​​NC at denaturere to stabile nukleinsyresekvenser i den udvidede heteroduplex helix er tydeligt: ​​NC-proteinet i fuld længde fører straks til dannelse af TAR / cTAR hybrid: 0 'angiver den minimale tid passerer mellem tilsætning af NC til prøverne og tilsætning af gel loading buffer, som stopper reaktionen; fuldstændig dannelse er allerede opnået efter 15 'inkubationstid. Stigningen i intensiteten af ​​den annealede heteroduplex parallelt fald i intensiteten af ​​de foldede cTAR og tjære oligonukleotider. Heteroduplex formation opnås også i nærvær af den afkortede form, dvs. (12-55) NC, bekræfter den biologiske aktivitet af det syntetiske peptid. I mangel af proteinet eller peptidet heteroduplex formation ikke overholdes, og tjære og cTAR oligonucleotider vil ikke anneale ved stuetemperatur i heteroduplex (figur 1). Ialle forsøg, den hurtige dannelse af ustabile mellemprodukter ("mellemliggende komplekser" i figur 1), der reducerer tiden overholdes, i overensstemmelse med den foreslåede af streng udveksling gennem hårnåle af cTAR og tjære indtil de korrekte nukleinsyrer foldemekanisme. 17

En mulig fejlfinding af eksperimentet er manglen på SDS i Gel Loading Buffer. I fravær af SDS i GLB resultatet af reaktionen er vist i figur 2 og sammenlignet med resultatet med GLB + SDS. Den præ-foldede TAR og cTAR blev blandet og inkuberet i 3 timer ved stuetemperatur for i 3 timer ved 37 ° C med rekombinant fuld længde NC protein. Efter inkubation blev prøverne opdelt i to: til halvdelen gel loading buffer uden SDS (GLB) blev tilsat, mens den anden halvdel GLB var med SDS (GLB SDS). Prøver blev påført på gelen, og positionen af ​​nukleinsyrerne båndene blev visualiseret efter gelen køres affarvestof farvning. Når NC var til stede, men prøverne blev fyldt med GLB blev alle nukleinsyrer bands flyttet op: dette er forventet og indikerer en stærk binding mellem proteinet og nukleinsyrer. Resultaterne med GLB SDS er vist i den yderste højre af gelen: tilsætning af SDS denaturerer proteinet og frigiver nukleinsyrer fra den stabilt kompleks med proteinet, hvilket tillader sammenligning med kontrollerne.

NAME assay anvendes til at vurdere evnen af threading interkalatorer at stabilisere dynamiske nukleinsyrestrukturer og inhiberer NC chaperone-aktivitet. 14 Threading interkalatorer er plane aromatiske molekyler substitueret med voluminøse sidekæder placeret i den modsatte steder i ringsystemet, såsom anthraquinon vist i figur 3A. 18 Disse interkalatorer er i stand til tråd gennem den dobbelte helix af nukleinsyrer endelig lokalisere deres sidekæder i hver rille af dobbelthelix. 19,20

Figur 3B viser resultaterne af NAME assayet i nærvær af forbindelse 1, en ​​kendt threading interkalator, 18 i nærvær af fuldlængde NC eller den trunkerede peptid. I begge tilfælde er dannelsen af ​​TAR / cTAR hybrid af NC reduceres ved at øge koncentrationen af ​​interkalator, mens på samme tid, mængden af ​​fri tjære og cTAR stiger. Den trunkerede form af proteinet mangler den N-terminale hale (12-55NC) er mere følsom over for inhibering af dets aktivitet: Denne forskel blev bekræftet med alle de testede hidtil forbindelser.

NAME assay kan udføres på to måder, enten ved præ-inkubering af testforbindelsen med NC, efterfulgt af tilsætning af de foldede oligonucleotider (NC-præinkubation tilstand), eller ved præinkubering testforbindelsen i 15 minutter med de foldede nukleinsyresekvenser substrater efterfulgt af tilsætning af NC og en yderligere inkubering i 15 minutter (oligo-preincubation tilstand). Selv om den samlede inkubationstid er den samme i de to forskellige tilstande, at præinkubering med de foldede oligonukleotider før tilsætning af NC giver mere tid til trådning af interkalatorer i den foldede nukleinsyre. Dette resulterer i en stærkere stabilisering af deres dynamiske strukturer og i en lettere hæmning af NC chaperone aktiviteter. Analysen af NAME assay i de to tilstande øger derfor forskelle i virkningsmekanismen af NC-inhibitorer som vist i figur 4: når forbindelse 1 blev analyseret ved navn i oligo-præinkubation (figur 4, bane til venstre) det viser potent inhibering af NC-medieret annealing, mens der observeres meget lavere inhibering i NC-præinkubation tilstand (figur 4, banerne til højre). Bemærk venligst, til bestemmelse af hæmmende koncentrationer samtidig screening sæt beslægtede forbindelser med denne analyse og i disse betingelser, hver erfaling skal udføres mindst in triplo under anvendelse tætliggende koncentrationer (især omkring IC50 værdi). 14

Figur 1
Figur 1:. NAME assay med fuld længde NC og med afskåret (12-55) NC Foldet TAR og cTAR, hver 1 uM, blev inkuberet med rekombinant NC eller med (12-55) NC (oligoer / NC = 1 / 8) til 0 min, 15 min, 30 min og 1 time. TAR og cTAR inkuberet i fravær af protein (0 min, 15 min, 30 min og 1 time) blev anvendt som negativ kontrol. Foldede TAR, foldet cTAR og hybrid TAR / cTAR opnået efter termisk denaturering efterfulgt af in vitro annealing blev anvendt som kontroller. Reaktionerne blev derefter stoppet ved hjælp af GLB SDS. Prøver blev opløst på en 12% polyacrylamidgel i TBE 1x; Efter elektroforese nukleinsyrer på gelen blev farvet og registreret på en transilluminator.

Figur 2
Figur 2:. Effekt af SDS i gel loading buffer (GLB), når man analyserer TAR / cTAR annealing af NC TAR og cTAR, forhånd, før de i TNMg 1x, blev inkuberet med fuld længde rekombinante NC (oligo'er / NC = 1/8) for 3 time ved stuetemperatur eller ved 37 ° C. GLB eller GLB SDS blev derefter tilsat til de inkuberet med NC prøver. Kontrol: TAR, cTAR og udglødet hybrid TAR / cTAR (hver 1 uM). Elektroforese blev udført under anvendelse af en 12% polyacrylamidgel i TBE 1x; Efter elektroforese nukleinsyrer på gelen blev farvet og registreret på en transilluminator. Dette tal er blevet ændret fra figur S4 af:. Sosic, A. et al Design, syntese og biologisk evaluering af tjære og cTAR bindemidler som HIV-1 nucleocapsid- hæmmere MedChemComm 4, 1388-1393, doi:. 10,1039 / c3md00212h (2013) .

"> Figur 3
Figur 3: (A) Kemisk struktur af gevindskæring interkalator 1. (B) Virkning af threading interkalator 1 vurderet ved NAME assay. Foldede TAR og cTAR hver 1 uM, blev inkuberet i nærværelse af de angivne koncentrationer af forbindelsen 1 med fuld længde NC eller med (12-55) NC, hver 8 uM. Foldede TAR, foldet cTAR og den forlængede heteroduplex TAR / cTAR blev anvendt som kontroller. Reaktionerne blev derefter stoppet ved hjælp af GLB SDS. Prøver blev opløst på en 12% polyacrylamidgel i TBE 1x; Efter elektroforese nukleinsyrer på gelen blev farvet og registreret på en transilluminator.

Figur 4
Figur 4: Oligo-præinkubation versus NC-præinkubationsmetoden tilstande: effekter på NAME assay Oligo-præinkubation mod.e: foldet TAR og foldede cTAR hver 1 uM, blev præinkuberet med de angivne koncentrationer af gevindskæring interkalator 1 til 15 min, og derefter i yderligere 15 minutter i nærvær af fuldlængde NC (8 uM) NC-præinkubation. mode: de angivne koncentrationer af gevindskæring interkalator 1 blev præinkuberet med fuld længde NC (8 uM) i 15 minutter og derefter i yderligere 15 minutter i nærvær af foldede TAR og foldes cTAR, hver 1 uM. Foldede TAR, foldet cTAR og den forlængede heteroduplex TAR / cTAR blev anvendt som kontroller. Alle reaktioner blev endeligt stoppet ved hjælp af GLB SDS. Prøver blev opløst på en 12% polyacrylamidgel i TBE 1x; Efter elektroforese nukleinsyrer på gelen blev farvet og registreret på en transilluminator.

Discussion

Navn er et assay, som gør det muligt at hurtigt at vurdere inhibering af chaperone aktivitet nukleokapsidproteinet af HIV-1, et interessant mål i søgningen af ​​hidtil ukendte anti-HIV-lægemidler. NC annealer hurtigt og ved stuetemperatur nukleinsyrer hvis stabil foldning ellers ville kræve termisk denaturering ved høj temperatur, efterfulgt af omhyggelig annealing. Analysen kan udføres med enten fuld længde NC eller med afskåret (12-55) NC: i begge tilfælde de to nukleinsyrer (RNA og dets komplementære DNA-kopi) er udglødet hurtigt. Dette er i overensstemmelse med litteraturen observation med det trunkerede NC peptid: annealing initieres af en effektiv smeltning af stilken af ​​cTAR efterfulgt af interaktion af dens komplementære apikale loop, som er en svag NC bindingssted, med den komplementære sekvens af TAR apikale loop, ender gennem flere ustabile mellemprodukter til den udvidede udglødet hybrid. 21

NC er et meget stabilt protEin og få problemer, mens de udfører navn kunne forekomme. Det er meget vigtigt imidlertid at tilføje frisklavet SDS i Gel Loading Buffer anvendes til at standse reaktionen: Hvis dette ikke opnås, vil gelen ikke viser nukleinsyresekvenser bands ved de korrekte positioner. Faktisk NC er en nukleinsyre-bindende protein, så korrekt at visualisere TAR / cTAR heteroduplex ved gelelektroforese SDS skal være til stede i Gel Loading Buffer at denaturere proteinet og frigøre det fra dets tætte kompleks med nukleinsyrer. Dette er også en mulig fejlfinding af eksperimentet, dvs. dannelsen af forskudte bånd i gelen løb. Denne effekt er særlig tydelig, når fuldlængde NC blev anvendt som i figur 2, og er forbundet med tilstedeværelsen af det stærkt basiske N-terminal hale, der har en stærk aggregerende virkning på nukleinsyrer.

Tilstedeværelsen af ​​terminalen grundlæggende hale gør annealingreaktionen sværere skal inhiberes, som vistn i figur 3 ved hjælp af forbindelse 1, en ​​repræsentativ threading interkalator, dvs. en interkalator særligt effektivt at stabilisere hårnåle-strukturer af tjære og i cTAR. Faktisk er denne type af interaktion med nukleinsyrer stillede når buler og sløjfer afbryde dobbeltspiral kontinuitet, hvilket muliggør en lettere trådning af voluminøse substituenter i basepar. Stabilisering af tjære og cTAR disse nucleinsyre syrebindemiddel tidligere analyseret ved bestemmelse af stigning i smeltetemperaturen af de to oligonukleotider. 14 Endvidere stigning i smeltetemperatur korrelerer med inhibering af annealing katalyseret af HIV-1 NC, fører til reduceret dannelse af heteroduplex TAR / cTAR og indikerer, at gevindskæring interkalatorer er en interessant klasse af bindemidler til dynamiske strukturer af RNA, såsom TAR element. 14

Virkningsmekanismen påberåbes disse kompounds kan valideres yderligere ved at udføre NAME assay i forskellige alternative formater, som vist i Figur 4: i tilfælde af interkalatorer inhiberingen af udglødet heteroduplex er forbedret, når lægemidlet er inkuberet med to foldede oligoer. Forbindelser, der handler med forskellig virkningsmekanisme, såsom direkte bindemidler for NC-proteinet, vil være mindre påvirket af de forskellige forinkubering mode. NAME assay udført i de to metoder kan derfor anvendes til at screene biblioteker af forbindelser til identifikation af NC inhibitorer og også til at vurdere den formodede virkningsmekanisme af de positive hits under søgningen efter anti-HIV-lægemidler rettet mod NC. Det er klart, at brugen af disse teknikker alene, når hævder for en specifik virkningsmekanisme af identificerede NC-inhibitorer er ikke tilstrækkeligt, og andre egnede biokemiske assays er nødvendige for at opretholde arbejdshypotese. 14

Endelig skal det understreges, at NAME bruger megetoprensede enzymer, enten rekombinante eller syntetiske, giver værdifulde oplysninger om "in vitro" inhibering af NC af de testede forbindelser. Dette er den "styrke og svaghed" af analysen: Navnet kan godt supplement virtuel screening og molekylær modellering tilgange i de indledende trin i forskningsprogrammer, der gør det muligt hurtigt at opbygge og analysere struktur og aktivitet og til sidst omdirigere syntesen og udviklingen af ​​lægemidler. Men som andre biokemiske assays anvendes i lægemiddeludvikling projekter i HIV, NAME vil ikke give oplysninger om virkningerne af formodede inhibitorer i virusinficerede celler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. Metabion International AG Store the stock  solution at -20 °C 
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.   Metabion International AG Store the stock aliquot at -80 °C 
(12-55)NC peptide EspiKem srl Store the stock solution at -20 °C
1.5 ml tubes Eppendorf 0030 120 086 Autoclave before use
0.5 ml tubes Eppendorf 0030 121 023 Autoclave before use
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µl Sarstedt 701,130,210
Biosphere Filter Tips 2-20 µl Sarstedt 70,760,213
Biosphere Filter Tips 200 µl Sarstedt 70,760,213
Syringe Filter 0.22 µm Biosigma srl 51,798
Ethanol Carlo Erba 414631
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich 71725-50G
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-1L
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 71376-1KG
Boric Acid Sigma-Aldrich B0252-2.5KG
Ethylenediaminetetraacetic Acid Sigma-Aldrich E5134-500G
Magnesium Perchlorate Sigma-Aldrich 222283-100G Store the 1 M solution at -20 °C
Glycerol Sigma-Aldrich 49770-1L
Bromophenol Blue GE Healthcare Life Sciences 17-1329-01
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-100ML
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A7460-500G Prepare the 10% solution freshly before use
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) Merck Millipore 1006401000 Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting
Tris ultrapure Applichem A1086,1000
DEPC-treated water Ambion AM9922
Centrifuge 5415R Eppendorf 22,621,408
NanoDrop 1000 spectrometer Thermo Scientific
UV-VIS spectrometer Lambda 20 Perkin Elmer
Protean II xi Cell Bio-Rad 165-1803
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
SybrGreen II RNA Gel Staining Lonza 50523 Make the 1/10,000 dilution in TBE 1x. Store it in the dark at 4 °C for two weeks.
Geliance 600 Imaging System Perkin Elmer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Druillennec, S., et al. A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).
  2. Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus. Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).
  3. Thomas, J. A., Gorelick, R. J. Nucleocapsid protein function in early infection processes. Virus Res. 134, 39-63 (2008).
  4. Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function. RNA Biol. 7, 724-734 (2010).
  5. Zeng, Y., et al. Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).
  6. Basu, V. P., et al. Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription. Virus Res. 134, 19-38 (2008).
  7. Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA. J Virol. 71, 5178-5188 (1997).
  8. Godet, J., Mely, Y. Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein. RNA Biol. 7, 687-699 (2010).
  9. Darlix, J. L., et al. Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).
  10. Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1. Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).
  11. Vo, M. -N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).
  12. Beltz, H., et al. Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis. J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).
  13. Mori, M., et al. Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1. Curr Top Microbiol Immunol. , Forthcoming Forthcoming.
  14. Sosic, A., et al. Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors. MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).
  15. Tabarrini, O., et al. Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives. Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).
  16. Hagan, N., Fabris, D. Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element. Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).
  17. Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease. Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).
  18. Zagotto, G., et al. Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates. Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).
  19. Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution. Chem Biol. 10, 663-672 (2003).
  20. Gooch, B. D., Beal, P. A. Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides. J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).
  21. Kanevsky, I., et al. Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).

Tags

Immunology HIV-1 nukleocapsidprotein NCp7 TAR-RNA DNA oligonucleotider annealing gelelektroforese NAME
Nucleocapsid Annealing-medieret Electrophoresis (NAME) Indhold Tillader hurtig identifikation af HIV-1 nucleocapsid inhibitorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sosic, A., Cappellini, M.,… More

Sosic, A., Cappellini, M., Scalabrin, M., Gatto, B. Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors. J. Vis. Exp. (95), e52474, doi:10.3791/52474 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter