Summary
本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。
Abstract
事前に再配置されたT細胞受容体(TCR)とそのエピジェネティックな若返りの継承は、誘導多能性幹細胞(iPSC)由来T細胞を養子T細胞療法(ACT)の有望な供給源にする。しかし、iPSCから再生されたT細胞を産生するための古典的なインビトロ法は、自然的または末期的に分化したT細胞のいずれかをもたらし、これは、典型的かつ機能的にナイーブT細胞とは異なる。最近、新しい三次元(3D)胸腺培養システムが開発され、増殖能力、記憶形成を含むナイーブT細胞様機能表現型を持つCD8αβ+抗原特異的T細胞の均質なサブセットを生成する。、および生体内の腫瘍抑制。このプロトコルは、異常な発達の運命を回避し、iPSC由来の子宮内移民(iTE)として指定された臨床的に関連するiPSC由来T細胞の生成を可能にすると同時に、必要なその後の機能を解明するための強力なツールを提供します。胸腺選択後のT細胞の成熟のために。
Introduction
養子T細胞療法(ACT)は、進行癌患者の一部に有効な治療法とすることができる。残念ながら、多くの患者は腫瘍回帰を経験せず、転移した細胞は注入後も持続しない。これは、注入されたT細胞の品質に起因する可能性がある。ACTマウスモデルは、ナイーブまたはそれ以下の分化された中心記憶T細胞と比較して、末端分化エフェクター細胞は生体内持続性1の不十分さのためにあまり強力ではないことを示し、臨床データ2によっても支持される観察、 3.
現行のACTの有効性を改善する取り組みとして、T細胞由来多能性幹細胞(T-iPSC)が広範囲に研究されている4,5.T細胞をT-iPSCに再プログラムし、T細胞に再分化すると、TCR遺伝子の再配置構成はT-iPSCに継承され、その後再分化されたT細胞が継承されます。従って、T-iPSCが無制限のインビトロ膨張を受ける能力は、このような細胞が腫瘍抗原特異的T細胞から設計された場合に、新生原特異的T細胞受容体(TCR)を担う未熟なT細胞の効率的な再生を可能にする6 、7.しかしながら、T-iPSCを成熟したT細胞に分化させる正確な方法は、分化性の低い表現型と抗腫瘍効力を有する癌抗原特異的T細胞の産生を可能にする、解明されたままである。
OP9マウス間質細胞の共培養を用いたT-iPSC分化は、ヒトノッチリガンドDLL1を過剰発現させ、インビトロ6、7でT細胞を産生する確立された方法である。マウスとヒトにおいて、この共培養システムはiPSCを一貫して区別することができ、それによって未熟なT細胞系統段階6、7まで胚盤胞期から発達事象を要約することができる。これらのバイオテクノロジーの進歩にもかかわらず、CD4+CD8+二重陽性(DP)段階後の生理学的分化は、達成することは依然として困難である。その理由の一つは、生体内CD4+CD8-およびCD4-CD8+単一陽性(SP)T細胞が胸腺に生成され、外来抗原特異性を持つT細胞の成熟と選択を担う器官であるが、自動反応性8ではありません。これらの選択的プロセスは、それぞれ正と負の選択として定義されます。しかし、胸腺のT細胞を成熟させるために必要な分子機構のほとんどはまだ完全に理解されていないため、このプロセスをインビトロで再構築することは困難です。この生理的ハードルを克服するために、いくつかのグループは、抗CD3抗体またはアゴニストペプチドを使用してTCR複合体を刺激している。これらのインビトロ技術は、腫瘍抗原特異性を保持しながら、CD3、CD8αβ、TCRαβ、およびCD62Lのような主要なT細胞マーカーを発現する細胞産物を生成する。残念ながら、これらの外血的方法によって生成されたT細胞は、不完全な陽性選択、生来のような特徴、TCR非特異的死滅、記憶形成の不能、およびおよび及びおよび及び生体内8、9、10、11における非持続性抗腫瘍効果。これらの異常は、このような細胞が、治療用途に使用される場合、リンパ腫および皮膚および骨の異常を含む様々な副作用を引き起こすかもしれないという懸念を提起している12,13,14.
インビトロ分化系で現在欠落している生理シグナルを再現するために、腫瘍抗原特異的T-iPSCは、採取された胸腺を用いて分化した。T細胞の胸腔内発達を研究するために設計された古典的な胎児胸腺臓器培養(FTOC)系は、甲状腺教育を完了したT細胞を正常に産生した3D培養システムを用いて改善された。iPSC由来の胸腺移民(iTE)として指定されたこれらの胸腺後T細胞は、ナイーブ様特性15を示した。iTEは、確立されたB16黒色腫腫瘍に対するマウスモデルにおいて増殖、記憶形成、および適切な抗腫瘍効果を示した。この資料では、3D 培養システムを使用したこの新しい FTOC システムのプロトコルについて詳しく説明します (図1)。
Protocol
すべての動物実験は、国立がん研究所(NCI)の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、NIHガイドラインに従って行われました。
1. iPSCとの共培養のためのOP9/DLL1細胞の調製
- OP9培地における培養OP9/DLL1細胞(α-最小必須培地[α-MEM]+20%非熱不活性化胎児ウシ血清[FBS]+1xペニシリン連鎖筋リン+アスコルビン酸[50 ng/mL]およびモノチオグリセロール[100 nM])を37°Cで培養した。OP9/DLL1細胞が80~95%の合流性に達した場合は、1xマグネシウム、カルシウム、フェノール赤フリーリン酸緩衝生理食塩分(以下、PBSといいます)で1回洗浄してください。
- 0.05%トリプシンの4 mLを追加し、37°Cで5分間インキュベートします。次いで、OP9培中の4mLを添加し、ピペッティングにより細胞層を解離し、単一のセル懸濁液を作る。
- 100 μm セル ストレーナーを介して 50 mL 円錐管にセル懸濁液を移します。4°Cで5分間300xgで遠心分離機を、上清を吸引し、OP9培体の12mLで再中断する。
- OP9/DLL1細胞懸濁液のプレート2 mLを新しい10cm細胞培養ペトリ皿に加え、OP9培地の8mLを追加します。2~3日ごとに繰り返します。
注:FBSおよび培養条件の質は、iPSC分化をサポートする能力を失うことなくOP9/DLL1細胞の膨張を維持するために重要である。したがって、細胞分化および老化を防ぐために、80%の合流性で一貫してFBSと通過の多くを事前に評価することをお勧めします。また、OP9/DLL1細胞の十分な冷凍ストックを作り、4~6週間ごとに新しいストックを解凍することも重要です。
2. 未熟T細胞へのiPSCの体外分化
-
0日目に、OP9/DLL1コンフルエント料理でiPSC共培養を開始します。
- トリプシン化による単一細胞懸濁液としてiPSCを収穫し(37°Cで0.05%トリプシンで5分)、細胞を回収し、遠心分離機を4°Cで5分間300xgで回収する。
- OP9培体の10mL当たり1.0 x 105 iPSCで細胞を吸引し、再中断する。プレート 1.0 x 105 iPSC を CONフルエント OP9/DLL1 10 cm 皿に付けます。
注:OP9/DLL1 10cmの料理は、90~100%の合流率に達するとiPSC分化に使用されます。合流の違いは、iPSC分化の効率に影響を与える可能性があります。
- 3日目に、古いメディアを吸引し、新鮮なOP9メディアの10 mLに置き換えます。
-
6日目に、通過細胞。
- PBSの10 mLで各10 cmコンフルエントOP9皿を洗います。皿あたり0.05%トリプシンの3 mLを追加し、室温(RT)で3-5分間インキュベートします。
- OP9培体の4mLを追加し、穏やかなピペッティングで細胞を収集します。100 μm のセル ストレーナーと遠心分離機を 300 x gで 4 °C で 5 分間渡します。上清を捨てる。
- 分化媒体の10mLで細胞を再懸濁(5 ng/mLマウスFlt3リガンド[FLT3L]および5 ng/mLマウスIL-7を用いてOP9培地およびプレートセル懸濁液を新しい10cm OP9/DLL1コンフルエント皿に置き換える。
- 9日目に、古いメディアを吸引し、新鮮な分化メディアの10 mLに置き換えます。
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iPSCコロニーで心筋細胞が観察された11日目に、ピペッティングによって非付着細胞を機械的に剥離し、100μmの細胞ストレーナーを通して濾過する。300 x gで5分間4°Cでスピンします。
- 上清を吸引し、分化媒体の24 mLで再中断する。confluent OP9/DLL1 6ウェルプレート(4 mL/ウェル)にiPSCをプレートします。
-
15日目に、すべての非付着細胞を収集し、40 μmセルストレーナーを通して濾過します。
- 300 x gで5分間4°Cでスピンします。
- ステップ2.5.1を繰り返して、3~4日ごとに非付着細胞の通過を続けます。
3. iTEを生成する3D胸腺臓器培養
- マウスの胎児胸腺ローブを収穫し、前述の16としてデオキシグアノシン(dGUO)治療による内因性リンパ球の展開。
- dGUO処理の7日目に、4つの新しい10cmの皿を取り、完全な媒体の20 mLでそれぞれを満たします(ロスウェルパーク記念研究所メディア1640 [RPMI 1640]+10%FBS +1x L-アラニル-L-グルタミン+1xナトリウムピルビン酸+1x必須必須アミノ酸を含む1x最小必須培地(MEM-NEAA)+1xペニシリン連鎖マイシン+[1:1000]2-メルカプトエタノール)
- 胸腺ローブを持つすべてのニトロセルロース膜を1つの10センチメートルの皿に移します。個々の葉を鉗子で膜から取り外し、メディアに浸かるようにします。膜を捨てるRTで1時間インキュベートします。
- 胸腺ローブを完全なメディアで新しい10cmの皿に移し、RTで1時間インキュベートします。
- 鉗子を使用して、甲状腺ローブを皿に固定し(一度に1つずつ)、もう一方の手で中央に100〜200 μmの深い切開を行い、ローブの直径の半分を拡張して、T細胞前駆子の葉への移動を容易にする。
- 完全な分化媒体で満たされた新しい10cmの皿に胸腺ローブを移す(完全な媒体+ 5 ng/mLマウスIL-7 + 5 ng/mLマウスFLT3L+ 5 ng/mL SCF)。
- 必要に応じて、下部および上位のグリッドを持つ 3D 培養プレートを使用する場合は、両方のグリッドを滅菌 PBS で塗りつぶして、吊り下げ滴の蒸発と乾燥を防ぎます。
- ステップ3.6から1つのdGuo処理された胸葉を含む完全な培地の30 μLを3D培養プレートの各ウェルに移します。
- OP9/DLL1共培養(16~21日目)(ステップ2.6.2)から非付着性T系統細胞(iPSC由来未熟T細胞)を集め(ステップ2.6.2)、20μL培地当たり2-5 x 103 T系細胞で再中断する。
- 3D培養プレートの各胸葉に20μLのT系統細胞懸濁液を加えます。5%CO 2で37°Cで一晩インキュベートします。
- P200ピペを30μLに設定し、各井戸から数回ピペッティングした後、甲状腺ローブを囲むすべての細胞を取り除く後、メディアを吸引します。メディアを破棄し、30 μL の完全なメディアを追加します。この手順を5~7回繰り返し、ローブに移行しない余分な未熟なT細胞を除去します。その後、メディアの25~30 μLを毎日変更します。
- 4~5日目に始まるローブの周りにiPSC由来の胸腺移民(iTE)のハローの形成を光顕微鏡で確認する。
- ローブの中断なしでメディアをピペッティングすることにより、毎日iTEを収集します。毎日メディアを変更し、約12日間まで収集を続けます。
- 収穫されたiTEは、分子解析(図2、図3、図4、図5)または生体内移植実験に使用する準備ができています。
4. 抗原提示細胞の調製(APC)
- 頸部脱臼によるC57BL/6マウスを犠牲にし、上述したようにラボソーカーマットの上に置きます。
- 脾臓を取り出し、100 μm のセル ストレーナーの上に置く。12 mLシリンジプランジャーを使用して脾臓をストレーナーに圧縮し、単一の細胞懸濁液を作ります。
- 無菌の40 μmセルストレーナーを介して細胞懸濁液を移す。懸濁液を300 x gで5分間4°Cで遠心分離し、細胞をペレットする。
- 上清を吸引し、赤血球(RBC)を排除するために、塩化カリウム(ACK)リシスバッファーの2 mLで細胞ペレットを再中断する。RTで5分間インキュベートします。
- 10 mLのPBSを添加してACKリシスバッファーをクエンチする。4°Cで5分間300xgで遠心分離によって細胞をペレットする。
- 上清を吸引し、完全な培養剤の10 mLで細胞ペレットを再懸濁し、10 cmの無菌ペトリ皿に移す。
- 細胞増殖を防ぐために照射装置(γ放射線)を用いて3500ラッドの脾細胞を照射する。
- 照射した細胞を直ちに37°Cインキュベーターに戻し、一晩培養する。
- 照射されたセルを APC として使用するか、セルバンカーで凍結します。
5. 抗原を使ったAPCのパルス
- ノイバウアーヘモサイトメーターとトリパンブルー染料を使用して、ライブ照射APCをカウントします。ペプチド(hgp100)またはヌクレオタンパク質でAPCを37°Cで30分間インキュベートします。
- 余分なペプチドを除去するために、PBSの10 mLでAPCを2回洗浄します。
- iTE をカウントし、100 IU IL-2 および 5 ng/mL IL-7 を持つ完全なメディアで 1:1 の比率で APC と混合します。アリコット100μLの細胞混合物(総濃度:1x 106細胞/mL)を、37°Cで48時間の超低アタッチメントUボトム96ウェルプレートおよび培養の各ウェルに入れる。
- 48時間後、マルチチャンネルピペットを使用して新しいプレートに細胞を移し、その後2~3日ごとに通過する。
-
3日目に細胞内抗体を染色してサイトカイン分泌プロファイルを分析し、フローサイトメトリー(図3)で分析する。
- タンパク質輸送阻害剤の0.67 μL/mLを追加し(例えば、GolgiStop)、サイトカインの細胞内蓄積を高めるために6時間37°Cでインキュベートします。10 mLのPBSで洗浄します。
- 3 mLの冷たい(4°C)PBSで細胞を再中断し、ゆっくりと冷たい4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液の1 mLを追加します。
- 10分後、4°Cで5分間300xgで細胞をスピンダウンし、上清を捨て、10 mLのPBSで洗浄します。
- 1 mL PBS + 1% FBS + 0.1% ニオニオン界面活性剤で細胞を再中断し、10〜15分間4°Cに置きます。
- 抗体を追加し、光からサンプルを保護し、30分間4°Cに置きます。
- 4°Cで5分間300xgで細胞をスピンダウンし、上清を捨て、10mLのPBSで洗浄する。
- 4°Cで5分間300xgで細胞をスピンダウンし、PBSの1 mLで細胞を再中断します。 細胞は流れ細胞計で分析する準備ができている。
Representative Results
共培養胎児胸腺を切除し、iPSC由来のT系統細胞が甲状葉に移行できるかどうかを分析した。未播種対照ローブは、内因性CD3+細胞を展開したアストロサイト様胸腺上皮ウェブ17を特徴とする組織アーキテクチャを有していた。一方、iPSC由来の未熟T細胞を播種した胸腺葉は、CD3+単核細胞で再始動し、iPSC由来の未熟T細胞を葉への移行を示す(図2A)。
その後、胸腺微小環境内に移行して成熟したT細胞は、その後iTEとして出力される。その発話性の特徴付けを試験するために、C57BL6胸腺細胞、Pmel iPSC由来未熟T細胞(外チル)、および胸葉(iTE)から出る細胞のフローサイトメトリック解析を行った。OP9/DLL1上の骨外T細胞は、陽性選択マーカーMHC-Iの発現なしにCD4+CD8+(DP)T細胞およびCD8αSP T細胞を示したが、iTEはCD8αSP MHC-I+T細胞表現型の明確な集団を有し、それらのことを示した。 胸腺葉から出る前に肯定的な選択を通して成功した通過。iTEは一貫してMHC-IおよびCD62Lを発現し、高増殖能力、サイトカイン産生、末梢生存、およびリンパホーミング18、19、20に関連するマーカーである。この表現型は、胸腺20における単一陽性T細胞の最も成熟した集団であるM2 SP胸腺細胞と一致しており、これはiTEが正常な胸腺発達プログラムを介して移行したことを示唆している(図3)。iTE生成の効率を監視するために、個々の胸葉から出ていた細胞を単離した。7日目、胸腺ローブは1 x 103ライブCD8SP CD45.1+ CD3+ iTE/日の平均を生成しました(図3B)。iTE産生の同様の速度は、3D胸腺共培養の6日目から12日目まで観察される。
サイトカインの抗原依存性活性化と分泌を分析し、子宮内教育を受けたiPSC由来未熟T細胞の機能特性を観察した。無関係なペプチド(ヌクレオタンパク質)の存在下で、Pmel-iTEはTNF-α、IL-2、またはIFN-γのかなりの量を放出しなかった。Pmel T細胞(hgp100)のコグネイトペプチドを用いて刺激すると、Pmel-iTEはTNF-αおよびIL-2の堅牢な量を放出し、同時に低量のIFN-γ(図4)を産生し、そのコグネイトペプチドを認識できることを示す。自然最近の胸腺移民(RTE)に似たプロファイルを持つエフェクターサイトカインを分泌する。
子宮内膜教育の有無にかかわらずOP9/DLL1で分化したiPSC由来T系統細胞間の転写物の違いを調べるために、RNA-seq分析をこれら2つの集団に対して行い、比較した。OP9/DLL1(DP)および一次ナイーブCD8+Pmel T細胞を用いて分化したDP T系統細胞のそれと。T細胞オントジェニー、胸腺細胞活性化、および記憶形成において重要な役割を果たす102個の遺伝子の発現を、15、20、21、22を分析した。これらの4つの研究集団の主成分分析は、非チル的に生成されたDPとCD8SP T細胞が一緒にクラスター化し、iTEがナイーブT細胞に近いクラスター化していることを示した(図5)。これらのデータは、iTEが骨外法によって生成されたT系統細胞よりもナイーブT細胞に近い表現型を持っていることを示している。
図 1:OP9/DLL1および3D胸腺培養を用いたiTEへのiPSCの分化の概略図プロトコルには、3 つの別々の差別化手順が含まれます。(左)op9/DLL1上の造血系統細胞(0~6日目)、造血系統細胞からサイトカインを用いたOP9/DLL1の未熟なT細胞(6日目~16~21日目)、未熟T細胞(16~21日目)へ(右)3D胸腺培養システムを用いてiTE。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: iPSC由来の未熟なT細胞に播種した胸腺ローブの免疫組織化学。上:iPSC由来未熟T細胞の播種の有無にかかわらず、胸腺ローブのH&E染色。2番目の上から下へ:DAPI(核)、CD3(T細胞)、およびマージで染色された断面ローブの共焦点画像。スケールバー = 100 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:iTEは、胸骨後T細胞表現型を示す。(A) FACSは、甲状腺細胞、骨外T細胞(OP9/DLL1共培養系)およびPmel-iTEの分析を行った。生細胞を前因CD45+上でゲートした。CD8 SP集団をCD62LおよびMHC-I発現についてさらに分析した。(B) シード前7日後に1枚当たり1枚のCD8SP CD45.1 iTEの平均数。データは12の独立した実験から収集された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: iTEは抗原特異的刺激により様々なサイトカインを産生する。FACSは、iTEによるサイトカインの細胞内産生を分析する。iTEは、無関係(ヌクレオタンパク質)またはコグネート(hgp100)ペプチドを3日間プリロードしたAPCと共培養した。右上象限に示されている数値は、サイトカインを産生するiTEのパーセンテージを示しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5:全転写解析は、素朴なCD8に向かうiTE遺伝子発現のシフトを明らかにする+Tセルプログラム。DP、骨外CD8 SP、iTE、およびナイーブT細胞からのRNA-seqデータの原理成分分析(PCA)。(公的データベースGSE105110を用いて、胸腺分化に関連する102個の遺伝子の解析)15.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
T-iPSCを使用して腫瘍抗原特異的T細胞を再生することは、持続性を改善した若い細胞を生成することによってACTの現在の障害の多くを克服することができる。OP9/DLL1共培養系を用いたいくつかの方法は、CD8 SP細胞6、7、10、13を産生するCD8分子および腫瘍抗原特異的TCRを発現する、グローバル遺伝子を生成することが報告されている。発現パターンと機能解析は、これらの非チル的に再生されたCD8 SP細胞がナイーブT細胞とは異なっていることを示している(図4)。ここでは、マウスT-iPSCから高い忠実度と均質性を持つiPSC由来のタイムミック移民(iTE)を生成できる3D胸腺培養システムについて述べます。iTEは、グローバル遺伝子発現パターンおよび機能性において、確立された腫瘍15に対する記憶形成および生体内抗腫瘍効果などのナイーブT細胞に似ている。
古典的なFTOCシステムは、インビトロで胸腺選択を要約する方法です。胸腺細胞23の胸腺内発達を研究するために使用されており、RTE24の生成に使用されているFTOCのいくつかの報告があります。ただし、FTOC システムにはいくつかの制限があります。人工臓器培養における酸素の不足に対処するために、いくつかのグループは、半乾燥膜ベースの培養23、または高酸素浸漬培養システム25のいずれかを使用している。しかし、現在の方法では、常に胸後T細胞の均質な集団を生成することはできません。古典的なFTOCシステムの限界を克服するために、我々は従来の方法15よりも技術的な改善を提供する3D胸腺培養システムを設計しました。例えば、当社の3D胸腺培養法を使用して、最大酸素交換と表面ローブの機械的ストレスの不在は、より生理的な環境で胸葉を保ちます。さらに、長期培養は成熟したT細胞が甲状腺葉から自然に出て行くことを可能にする。最後に、リアルタイムの観察とマイクロ操作により、腺ローブを物理的に妨げることなく、メディア交換とiTEの一定のコレクションが可能になります。したがって、3D胸腺培養法は、以前は利用できなかったチメックに選択されたナイーブT細胞を研究するための手段と同様に、大幅な技術的改善を提供する。
この3D胸腺培養システムを使用してiTEを成功させるための重要なポイントがいくつかあります。FBSおよび培養条件の質は、iPSC分化をサポートする能力を失うことなくOP9/DLL1細胞の膨張を維持するために重要である。したがって、細胞分化および老化を防ぐために、FBSロットの事前評価と80%の合流性で一貫して通過することをお勧めします。さらに、合流の違いが効率に影響を与える可能性があるため、iPSCを未熟なT細胞にインビトロで分化するには、コンフルエントOP9/DLL1培養が必要です。最後に、胸腺葉の胚年齢は、iTEの生成に不可欠です。E14.5 - 15.5胸腺ローブを使用することをお勧めします。
他の新しいプロトコルと同様に、この方法には制限があり、改善の対象となります。ここで提示される培養技術は、1日あたり約1000 iTEを2週間の期間で生成する。iTE生成の増加は、酸素濃度、培地量、および3D培養プレートのタイプの最適化を含むさらなる改変によって可能である。サイトカインの添加または除去、ならびにサイトカイン濃度の変化は、iTE収率の向上にも寄与し得る。
ここで紹介する3D胸腺培養システムが完全にexvivoシステムで胸腺移民を生成できることを考えると、この技術は、Tを含むが、これらに限定されない様々な免疫学的および養子細胞移植研究プロジェクトに適用することができる。細胞分化、胸後T細胞成熟、造血前駆体または幹細胞からの抗原特異的T細胞の生成。この方法はヒトサンプルに直接適用できないが、iTEと3D胸腺培養システムは、正と負の選択の分子機構を解明する大きな可能性を秘めており、それを可能にする培養システムの構築を促進する可能性がある。ACTのための臨床的に関連する腫瘍抗原特異的なナイーブ様T細胞の生成。
Disclosures
著者ラウル・ヴィスカルド、ニコラス・D・クレメン、ニコラス・P・レシポは、出願中の国際特許出願PCT/US2017/65986の発明者であり、2017年12月13日に出願された「甲状腺移民細胞の単離または精製集団を準備する方法」同じ方法を使用して治療の方法。
Acknowledgments
私たちは、OP9/DLL1セルラインを親切に提供してくださった川本浩と増田京子に感謝します。アラン・B・ホーフィングとエリナZに感謝します。彼はグラフィカルな援助を受けている。この研究は、米国国立がん研究所(ZIA BC010763)の内部壁画研究プログラムと、NCI(NIH)の細胞ベース治療センターのがんムーンショットプログラムによって支援されました。この活動はミルシュタイン家族財団の支援も受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| 2-deoxyguanosine | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
| FBS | Gemini | 100-500 | |
| Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
| GlutaMAX (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
| Interleukin-2 | R&D Systems | 402-ML | |
| Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| MEM powder | Gibco | 61100061 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| Nucleoprotein | Global Peptides | ASNENMETM | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
| Stemfactor LIF, Mouse Recombinant | STEMGENT | 03-0011-100 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
| Cell Culture Vessels and others | |||
| 10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
| 12 mL Syringe | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
| 6 well plate | Corning/Coster | 3516 | |
| Cell strainer 100 μm | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| Cell strainer 40 μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Forceps | DUMONT | 0108-5PO | |
| Lab soaker mat | Versi-Dry | Cat. EF2175CX 74018-00 | |
| Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
| Perfecta3D Hanging Drop Plate | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
| U Bottom 96 well plate | Corning/Coster | 3799 | |
| Experimental Cell lines | |||
| CD3-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| MEF-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | ATCC | SCRC-1040; RRID:MGI:5007926 | |
| OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | |
| Pmel-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Experimental mouse models | |||
| B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564 | |
| C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
| Pmel-1 mice | Overwijk et al. | J Exp Med 198(4):569-80 | |
| Antibodies | |||
| Anti-aTCR | Biolegend | 109202; RRID:AB_313425 | |
| Anti-CD3 | abcam | ab11089; RRID:AB_369097 | |
| Anti-CD4 | BD Biosciences | 553730; RRID:AB_395014 | |
| Anti-CD44 | BD Biosciences | 559250; RRID:AB_398661 | |
| Anti-CD45.1 | BD Biosciences | 553775; RRID:AB_395043 | |
| Anti-CD45.2 | BD Biosciences | 553772; RRID:AB_395041 | |
| Anti-CD62L | BD Biosciences | 560516; RRID:AB_1645257 | |
| Anti-CD69 | BD Biosciences | 552879; RRID:AB_394508 | |
| Anti-CD8a | BD Biosciences | 557959; RRID:AB_396959 | |
| Anti-CD8b | BD Biosciences | 550798; RRID:AB_393887 | |
| Anti-H-2Kb | BD Biosciences | 553570; RRID:AB_394928 | |
| Anti-IFN-g | BD Biosciences | 557998; RRID:AB_396979 | |
| Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554428; RRID:AB_395386 | |
| Anti-TCRb | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81; RRID:AB_469741 | |
| Anti-TCRVb13 | BD Biosciences | 553204; RRID:AB_394706 | |
| Anti-TNFa | BD Biosciences | 557644; RRID:AB_396761 |
References
- Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320-323 (2016).
- Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P.
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
- Yamagata, T., Mathis, D., Benoist, C. Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a CD8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells. Nature Immunology. 5 (6), 597-605 (2004).
- Themeli, M., et al. Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy. Nature Biotechnology. 31 (10), 928-933 (2013).
- Serwold, T., Hochedlinger, K., Inlay, M. A., Jaenisch, R., Weissman, I. L. Early TCR expression and aberrant T cell development in mice with endogenous prerearranged T cell receptor genes. Journal of Immunology. 179 (2), 928-938 (2007).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).
- Serwold, T., et al. T-cell receptor-driven lymphomagenesis in mice derived from a reprogrammed T cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (44), 18939-18943 (2010).
- Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-treated thymus organ cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Hamazaki, Y., Sekai, M., Minato, N. Medullary thymic epithelial stem cells: role in thymic epithelial cell maintenance and thymic involution. Immunological Reviews. 271 (1), 38-55 (2016).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Rosen, S. D. Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond. Annual Review of Immunology. 22, 129-156 (2004).
- Hogquist, K. A., Xing, Y., Hsu, F. C., Shapiro, V. S. T Cell Adolescence: Maturation Events Beyond Positive Selection. Journal of Immunology. 195 (4), 1351-1357 (2015).
- Best, J. A., et al. Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation. Nature Immunology. 14 (4), 404-412 (2013).
- Schmitz, I., Clayton, L. K., Reinherz, E. L. Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo. International Immunology. 15 (10), 1237-1248 (2003).
- Nitta, T., Ohigashi, I., Takahama, Y. The development of T lymphocytes in fetal thymus organ culture. Methods in Molecular Biology. 946, 85-102 (2013).
- Ueno, T., et al. Role for CCR7 ligands in the emigration of newly generated T lymphocytes from the neonatal thymus. Immunity. 16 (2), 205-218 (2002).
- Watanabe, Y., Katsura, Y. Development of T cell receptor alpha beta-bearing T cells in the submersion organ culture of murine fetal thymus at high oxygen concentration. European Journal of Immunology. 23 (1), 200-205 (1993).
