Summary
Ce protocole décrit la préparation, les essais biotribologiques et l’analyse des cylindres ostéochondral glissant contre le matériel d’implant métallique. Les mesures des résultats incluses dans ce protocole sont l’activité métabolique, l’expression des gènes et l’histologie.
Abstract
Les défauts ostéochondral dans les patients entre deux âges pourraient être traités avec des implants métalliques focaux. D’abord développés pour des défauts dans l’articulation du genou, les implants sont maintenant disponibles pour l’épaule, la hanche, la cheville et la première articulation métatarsalphalangeal. Tout en fournissant la réduction de douleur et l’amélioration clinique, des changements dégénératifs progressifs du cartilage opposé sont observés dans beaucoup de patients. Les mécanismes menant à ces dommages ne sont pas entièrement compris. Ce protocole décrit une expérience tribologique pour simuler un appariement métal-sur-cartilage et une analyse complète du cartilage articulaire. Le matériel d’implant métallique est testé contre les cylindres ostéochondral bovins comme modèle pour le cartilage articulaire humain. En appliquant différentes charges et vitesses de glissement, les conditions physiologiques de chargement peuvent être imitées. Pour fournir une analyse complète des effets sur le cartilage articulaire, l’histologie, l’activité métabolique et l’analyse d’expression de gène sont décrites dans ce protocole. Le principal avantage des essais tribologiques est que les paramètres de chargement peuvent être ajustés librement pour simuler des conditions in vivo. En outre, différentes solutions d’essai pourraient être utilisées pour étudier l’influence de la lubrification ou des agents pro-inflammatoires. En utilisant l’analyse de l’expression génétique pour les gènes spécifiques au cartilage et les gènes cataboliques, des changements précoces dans le métabolisme des chondrocytes articulaires en réponse à la charge mécanique pourraient être détectés.
Introduction
Le traitement des défauts ostéochondral est exigeant et exige la chirurgie dans beaucoup de cas. Pour les lésions ostéochondral focales chez les patients d’âge moyen, les implants métalliques focaux sont une option viable, surtout après l’échec du traitement primaire, comme la stimulation de la moelle osseuse (BMS) ou l’implantation autologue de chondrocytes (ACI)1. Les remplacements partiels de surface peuvent être considérés comme des procédures de récupération qui peuvent réduire la douleur et améliorer l’étendue dumouvement 2. Ces implants sont généralement composés d’un alliage CoCrMo et sont disponibles en différentes tailles et configurations offset pour correspondre à l’anatomie normale3. Alors qu’initialement développé pour les défauts sur le condyle fémoral médial dans le genou, ces implants sont maintenant disponibles et en usage pour la hanche, la cheville, l’épaule etle coude 4,5,6. Pour un résultat satisfaisant, il est crucial d’évaluer l’alignement articulaire mécanique et l’état du cartilage adverse. En outre, l’implantation correcte sans saillie de l’implant s’est montrée fondamentale7.
Les études cliniques ont démontré d’excellents résultats à court terme en termes de réduction de la douleur et d’amélioration de la fonction chez les patients d’âgemoyen pour divers endroits 5,6,8. Comparés à l’implantation d’allogreffe, les implants métalliques focaux permettent un port précoce du poids. Cependant, le cartilage articulaire opposé a montré l’usure accélérée dans un nombre considérable de patients9,10. Par conséquent, même avec le placement approprié, dans beaucoup de cas la dégénérescence du cartilage indigène semble inévitable, alors que les mécanismes sous-jacents restent peu clairs. Des changements dégénératifs similaires ont été observés après l’hémiarthroplastie bipolaire dela hanche 11 et sont augmentés avec l’activité et lechargement 12.
Les expériences tribologiques offrent la possibilité d’étudier de tels appariements in vitro et de simuler différentes situations de chargement se produisant dans des conditionsphysiologiques 13. L’utilisation d’épingles ostéochondral offre un modèle de géométrie simple pour étudier la tribologie du cartilage articulaire glissant contre le cartilage indigène ou tout matériel d’implant14 et pourrait encore être employé dans les modèles entiers de simulationcommune 15. Les appariements métal-sur-cartilage montrent l’usure accélérée de cartilage, la perturbation extracellulaire de matrice, et la viabilité diminuée de cellules dans la zone superficielle comparée à un appariement de cartilage-sur-cartilage16. Les dommages au cartilage se sont produits principalement sous forme de délamination entre les zones superficielles et moyennes17. Cependant, les mécanismes menant à la dégénérescence de cartilage ne sont pas entièrement compris. Ce protocole fournit une analyse complète de l’activité biosynthétique du cartilage articulaire. Par la détermination de l’activité métabolique et des niveaux d’expression de gène des gènes cataboliques, des indications tôt pour la panne de cartilage pourraient être identifiées. L’avantage des expériences tribologiques in vitro est que les paramètres de chargement peuvent être ajustés pour imiter diverses conditions de chargement.
Par conséquent, le protocole suivant est approprié pour simuler un appariement métal-sur-cartilage, représentant un modèle expérimental d’hémiarthroplastie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation de cylindres métalliques
- Analyser les tiges cylindriques cobalt-chrome-molybdène (CoCrMo) en respectant les spécifications standard s’il s’agit d’implants chirurgicaux pour leur composition chimique à l’aide de microscopie électronique à balayage (SEM) avec spectroscopie radiographique dispersive par protocole du fabricant pour confirmer les valeurs fournies.
REMARQUE: La composition élémentaire de l’alliage CoCrMo utilisé pour cette expérience est de 65% Co, 28% Cr, 5% Mo et 2% autres. - Moudre humidement les échantillons avec du papier de broyage de carbure de silicium commençant par une taille de grain de 500. Utilisez du papier broyeur en ordre croissant jusqu’à concurrence de 4000 grains.
- Polir le cylindre avec 3 μm et 1 pâte de μm pour atteindre une rugosité de surface qui est dans le niveau de tolérance des exigences de finition de surface pour les implants chirurgicaux métalliques (ISO 5832-12:2019) et les implants de remplacement articulaires totaux et partiels (ISO 21534:2007).
REMARQUE : La rugosité moyenne de surface est déterminée à l’aide d’un microscope confocal. - Couper les tiges CoCrMo (Ø de 6 mm) en cylindres d’une longueur de 10 mm.
2. Récolte de cylindres ostéochondral
- Utilisez des articulations bovines étouffées d’animaux matures sur le plan squelettique (âgés de 18 à 24 mois au moment du sacrifice) et gardez-les contenues et refroidies jusqu’à la dissection dans les 24 heures suivant le sacrifice.
REMARQUE : Les joints sont achetés auprès du boucher local. L’articulation reste fermée jusqu’à la dissection. - Pour récolter les bouchons ostéochondral cylindriques dans des conditions aseptiques, désinfectez le genou et effectuez une arthrotomie et exposez le condyle fémoral médial.
REMARQUE : La dissection doit être effectuée avec prudence pour ne pas endommager la surface articulaire. - Inspecter la surface articulaire à la recherche de dommages macroscopiques.
REMARQUE : Jetez l’échantillon si le cartilage n’a pas son aspect blanchâtre, lisse et brillant ou s’il y a des cloques, des fissures ou de plus grands défauts. - Alignez le tube de coupe perpendiculairement à la surface articulaire de la zone de port de poids et conduisez l’appareil dans le cartilage et l’os subchondral par des coups fermes avec un marteau. À 15 mm de profondeur de pénétration, tordez l’appareil dans le sens des aiguilles d’une montre avec un mouvement soudain.
- Retirez l’appareil, insérez le bouton blanc et vissez-le jusqu’à ce que l’extrémité inférieure de la prise ostéochondrale soit visible.
- Marquer l’orientation antéroposteriore des échantillons avec un marqueur stérile afin d’organiser le cylindre ostéochondral en conséquence pendant les essais.
REMARQUE : Le réseau tridimensionnel de collagène et son architecture complexe facilitent les propriétés mécaniques uniques du cartilage articulaire et devraient être considérés dans l’orientation des échantillons. - Rincer l’échantillon avec de la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) pour laver le sang et les tissus adipeux.
- Répétez les étapes mentionnées ci-dessus pour récolter le nombre désiré de bouchons ostéochondral (diamètre de 8 mm, longueur de 15 mm).
REMARQUE : En règle générale, 9 à 12 cylindres ostéochondral peuvent être récoltés à partir de la zone de port de poids sur le condyle fémoral médial. - Placez les échantillons dans le milieu modifié de l’Aigle de Dulbecco contenant 10 % de sérum bovin fœtal, complété par des antibiotiques (pénicilline 200 U/mL; streptocycine 0,2 mg/mL) et amphotericine B 2,5 μg/mL et conservez-les à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient testés pour maintenir leur viabilité.
- Analyser les bouchons ostéochondral de contrôle immédiatement après la récolte pour établir les valeurs de base (voir la section analyse).
3. Tests tribologiques
- Effectuez les expériences à l’aide d’un tribomètre réciproque disponible dans le commerce avec une configuration cylindre sur plaque. Les exigences de l’appareil sont la charge verticale et la charge réglable et la vitesse de glissement. En outre, une cellule liquide permet d’effectuer les tests dans une solution lubrifiante.
- Déterminez la pression de contact dans le système CoCrMo-on-cartilage à l’aide d’un film de mesure de pression. Placez le film de mesure de pression à l’interface et appliquez la charge statique pendant 30 s pour déterminer la pression initiale de contact, la taille et la forme de contact. En raison de la convexité du cylindre métallique et du cartilage articulaire, la zone de contact initiale a une forme elliptique dans cette configuration.
REMARQUE : Le film de mesure de la pression réagit à la pression appliquée montrant la décoloration rouge des zones où la pression du seuil est atteinte ou dépassée. Pour 1 N de charge, la pression de contact a été déterminée autour de 2 MPa par comparaison visuelle avec les pressions de contact définies. - Fixez les cylindres ostéochondral sur le support inférieur de l’échantillon avec le marquage aligné avec la direction coulissante, et montez les cylindres CoCrMo sur la cellule de charge supérieure.
- Ajouter la solution d’essai (PBS avec de l’acide hyaluronique de 3 g/L) dans la cellule liquide, ce qui entraîne la fusion du cylindre ostéochondral et le recouvrement de l’interface coulissante métal-cartilage.
- Définissez les paramètres d’essai (force normale prescrite, course et vitesse de glissement), qui sont ensuite appliqués et maintenus tout au long de l’essai.
REMARQUE : La longueur de course du mouvement de réciprocité doit être réglée en fonction de la zone de contact pour créer une zone de contact de migration (MCA). Pour les bouchons de 8 mm de diamètre, un AVC de 2 mm permet une réhydratation adéquate du cartilage. - Commencez à glisser réciproquement le cylindre CoCrMo contre le cartilage articulaire immergé dans la solution lubrifiante avec les paramètres de chargement définis.
- Surveiller le coefficient de frottement (COF) pendant les expériences.
REMARQUE : Le COF est évalué automatiquement mais peut être calculé à l’aide de l’équation μ=F/W (μ - coefficient de frottement; F - force de frottement; W - charge normale appliquée par le système). - Mettre fin à l’expérience après la période de test souhaitée.
- Retirez le bouchon ostéochondral du porte-échantillon, rincez-le avec du PBS et rangez-le en milieu jusqu’à une analyse biologique plus poussée (voir ci-dessous).
- Submergez les échantillons de contrôle dans la solution d’essai à température ambiante pendant toute la durée de l’essai et analysez avec des échantillons qui ont été exposés à la charge mécanique.
4. Analyse
NOTE : Le cylindre ostéochondral sont analysés pour l’activité métabolique et l’expression de gène pour étudier l’activité biologique ; l’histologie est exécutée pour étudier l’intégrité de surface de cartilage et la matrice sous-jacente.
- Histologie
- Pour l’analyse histologique, immerger les bouchons ostéochondral dans la solution de formaldéhyde tamponné à 4% à température ambiante jusqu’à ce que le traitement ultérieur.
- Rincez les échantillons avec du PBS et placez-les dans un récipient en plastique.
- Ajoutez un excès de la solution de décalcifiant prêt à l’emploi afin que tous les échantillons soient couverts.
- Appliquer une agitation constante pendant 4 semaines pour une décalcification complète.
- Après décalcification, intégrer les échantillons dans des glycols et des résines solubles dans l’eau et les stocker à −80 °C.
- Obtenez 6 sections de μm en cryosection transversale à la zone de contact.
- Par la suite, préparez les échantillons pour la coloration Safranin O et le contre-coloration Fastgreen à l’aide du protocole d’un fabricant.
- Capturez des images histologiques à l’aide d’un microscope et d’un processus à l’aide d’un logiciel de traitement d’imagerie.
- Activité métabolique
REMARQUE : L’activité métabolique des chondrocytes dans le cartilage articulaire sont étudiées avec un essai toxicologique ex vivo basé sur XTT.- Rincer le bouchon ostéochondral à l’aide de PBS et placer l’échantillon dans une boîte de Pétri.
- Placer une plaque de 24 puits sur une échelle et zéro l’échelle.
- Couper le cartilage de la greffe ostéochondrale avec un scalpel en un seul morceau.
- Couper le cartilage en deux morceaux égaux de sorte que la zone de contact soit également répartie sur les deux morceaux de cartilage et émincer de moitié à 1 mm³ morceaux. La deuxième moitié est utilisée pour l’analyse de l’expression des gènes.
- Transférer le cartilage haché dans un puits de la plaque préparée de 24 puits et déterminer le poids des tissus.
- Répétez les étapes mentionnées ci-dessus pour chaque échantillon et ajoutez 1 mL de milieu de croissance à chaque puits de la plaque.
- Ajouter la solution XTT (490 μL de réagenage d’étiquetage XTT et 10 μL de réageni d’activation) selon les instructions et le mélange du fabricant.
- Incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 4 h.
- Après l’incubation, retirer le surnatant et le transférer dans un tube de 5 mL.
- Extraire le produit du tétrazolium en ajoutant 0,5 mL de sulfure de diméthyle (DMSO) au tissu cartilagineux de la plaque de 24 puits et appliquer une agitation continue pendant 1 h à température ambiante.
- Supprimez la solution DMSO et mutualiser avec la solution XTT précédemment collectée.
- Transférer 100 μL de l’échantillon en triplicates dans une plaque de 96 puits sur un lecteur de plaque et mesurer l’absorption à une longueur d’onde de 492 nm et une longueur d’onde de référence à 690 nm.
- Normalisez les valeurs d’absorption qui en résultent au poids humide de chaque échantillon et effectuez une analyse à l’aide d’un logiciel.
- Analyse de l’expression génique
- Isolement de l’ARN
REMARQUE : L’isolement de l’ARN est effectué à l’aide d’un kit commercial(Tableau des matériaux)selon les instructions fournies par le fabricant avec de petites modifications.- Hacher la deuxième moitié du tissu cartilagineux obtenu à partir de la prise ostéochondral en petits morceaux.
- Transférez-les dans un tube contenant des perles de céramique et 300 μL de tampon de lyse (contenant 1% β-mercaptoéthanol).
REMARQUE : Les échantillons peuvent être congelés dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’ils soient traités plus avant. - Décongeler les échantillons pendant 2 min et utiliser le lyser commercial pour l’homogénéisation du tissu. Appliquer 6500 tours pour 20 s (étape d’homogénéisation) quatre fois avec une phase de refroidissement de 2 min après chaque course (à 4 °C à l’aide du dispositif de refroidissement lyser commercial) pour perturber complètement le tissu.
- Ajouter 20 μL de proteinase K et 580 μL d’eau sans RNase à chaque tube et les incuber à 55 °C pendant 30 min.
- Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 10 000 x g et transférer le supernatant dans un tube de 1,5 mL.
- Ajouter 0,5 volume d’éthanol à 90 % à chaque tube et mélanger.
- Transférer 700 μL de l’échantillon dans une colonne de liaison ARN placée dans un tube de collecte de 2 mL et une centrifugeuse à 8 000 x g pendant 15 s.
- Jetez le flow-through et répétez l’étape de centrifugation pour le lysate complet.
- Ajouter 350 μL de Buffer RW1 à la colonne, centrifugeuse à 8 000 x g pendant 15 s et jeter le flux.
- Mélanger 10 μL de solution de stock DNase et 70 μL de DDR tampon. Ajouter la solution à la membrane de purification de l’ARN et l’incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Ajouter 350 μL de Buffer RW1 à la colonne et centrifugeuse à 8 000 x g pendant 15 s. Jetez le flux à travers.
- Ajouter 500 μL d’EPR tampon et de centrifugeuse à 8 000 x g pendant 15 s. Jetez le flux à travers.
- Ajouter 500 μL d’EPR tampon à la colonne de purification de l’ARN et à la centrifugeuse à 8 000 x g pendant 2 min.
- Placez la colonne dans un tube de collecte de 1,5 mL et ajoutez 30 μL d’eau sans RNase. Centrifugeuse à 8 000 x g pendant 1 min.
- Conserver l’ARN isolé à -80 °C jusqu’à la synthèse de l’ADN.
- synthèse cDNA
REMARQUE : Pour synthétiser l’ADN complémentaire (CDNA) à partir de l’ARN messager (ARNm), un kit commercial (Tableau des matériaux) a été utilisé. L’ARN du bactériophage MS2 a été ajouté pour stabiliser l’ARN isolé pendant la synthèse de l’ADN.- Décongeler et mélanger les reagents. La composition d’une seule réaction est indiquée dans le tableau 1.
- Ajouter 16 μL d’échantillon d’ARN au volume pour une seule réaction (14 μL).
- Effectuer la synthèse de l’ADN dans un cycleur thermique en utilisant les paramètres suivants : 10 min à 25 °C (annealing d’amorce), 60 min à 50 °C (synthèse de l’ADN), 5 min à 85 °C (dénaturation) et 5 min à 20 °C (phase de refroidissement).
- Conserver l’ADNd à -20 °C jusqu’à ce que la réaction quantitative en chaîne quantitative en temps réel de polymése (RT-qPCR).
- RT-qPCR (rt-qPCR)
REMARQUE : Pour le RT-qPCR des échantillons bovins, les amorces et les sondes ont été conçues à l’aide d’un logiciel qPCR commercial en temps réel (p. ex., IDT) pour les gènes GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate de déshydrogénase), COL2A1 (Collagène de type 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Collagène de type 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) et MMP-13 (Matrix Metalloproteinase-13). Des amorces bovines et des sondes à double étanchéation ont été fournies par IDT. Les reagents utilisés pour une seule réaction pour évaluer l’efficacité et l’expression des gènes sont affichés dans le tableau 2.- Distribuez le mélange principal d’une seule réaction (9 μL) à chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits et ajoutez 1 μL de cDNA à chaque réaction. Effectuez des tests pour chaque échantillon en triplicates.
- Fermer la plaque PCR à l’aide d’huile d’étanchéité et de centrifugeuse à 877 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Effectuez rt-qPCR à l’aide d’un cycleur thermique de précision avec le protocole suivant : 95 °C pendant 10 min, 45 cycles d’amplification (95 °C pour 10 s, annealing pour 30 s, synthèse cDNA) et 37 °C pour 30 s.
REMARQUE : Des températures d’annelation spécifiques sont requises pour chaque amorce. - Utilisez GAPDH avec les gènes cibles pour confirmer l’efficacité.
- Utilisez le logiciel fourni pour calculer l’efficacité de chaque gène.
- Normaliser les valeurs du seuil de cycle (CT) à l’expression du gène de référence GAPDH et utiliser la méthode ΔΔCT pour la quantification.
- Isolement de l’ARN
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La zone de contact et la pression de contact doivent être confirmées à l’aide d’un film de mesure dela pression ( figure 1). L’état physiologique de chargement peut être confirmé en comparant avec des empreintes de référence pour des pressions de contact définies. Pendant les essais, le coefficient de frottement est surveillé en permanence. Avec une zone de contact migrante, un faible coefficient de frottement peut être maintenu pendant au moins 1 h (figure 2). L’utilisation de la composition et de la structure de la matrice extracellulaire Safranin O peut être déterminée( figure 3). L’intensité de la coloration Safranin O est proportionnelle à la teneur en protéoglycane. Fast Green contre-tache les sites non collagènes et offre un contraste évident avec la coloration Safranin O. La teneur en protéoglycanes varie sur la surface articulaire, mais doit être uniforme dans toute la section tissulaire dans les échantillons de base (figure 3A). Les échantillons de contrôle immergés dans la solution d’essai montrent l’extraction de GAGs, qui peuvent être neutralisés par chargement mécanique(figure 3B, 3C). L’activité métabolique des chondrocytes articulaires bovins est indépendante du site de récolte, mais montre une augmentation avec la charge mécanique par rapport aux commandes déchargées (figure 4). Les niveaux d’expression génétique des gènes spécifiques au cartilage (COL2A1, ACAN) augmentent avec les conditions de charge physiologiques, tandis que les gènes cataboliques (COL1A1 et MMP13) sont régulés avec la zone de contact stationnaire (figure 5).
| Volume (μl) | |
| Transcriptor RT Réactions Buffer 5x conc. | 6 |
| Inhibiteur protecteur de la RNase 40U/μl | 0.75 |
| Mélange de désoxynucléotide 10 mM chacun | 3 |
| Primer Hexamer aléatoire 600 μM | 3 |
| Transcriptor Transcriptase inverse 20 U/μl | 0.75 |
| ARN MS2 (0,8 μg/μl) | 0.375 |
| Eau distillée sans nucléase | 0.125 |
| Volume total | 14 |
Tableau 1 : Reagents pour une seule réaction pour la synthèse cDNA.
| Volume (μl) | |
| FastStart Probe Master 2X | 5 |
| Sonde d’hydrolyse 2,5 μM | 1 |
| PrimerGAPDH gauche 5 μM | |
| Amorce droite GAPDH 5 μM | |
| Eau distillée sans nucléase | 3 |
| Mix Maître Total | 9 |
Tableau 2 : Reagents pour le Master Mix pour un seul PCR.
Figure 1 : Mesure deréassurage p de la zone de contact initiale à l’interface métal-cartilage avant l’essai. En raison de la convexité du cylindre métallique et de la surface articulaire et de ses propriétés élastiques, la zone de contact initiale est elliptique. Pendant le glissement, cette zone de contact initiale se déplace d’un trait de 2 mm, ce qui donne une plus grande surface qui est exposée à la charge mécanique; barre d’échelle = 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Coefficient de frottement dépendant du temps (durée 1 heure) pour sept échantillons testés à une vitesse de glissement de 8 mm/s et à une charge de 1 N (pression de contact de 2 MPa). Chaque ligne colorée représente le COF d’un cylindre ostéochondral. La variabilité observée est dans les limites des échantillons biologiques. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Sections histologiques d’échantillons ostéochondral bovins tachés de Safranin-O et de Fast Green. (A) Les échantillons de base montrent une teneur élevée en GAG dans tout le cartilage articulaire. (B)L’échantillon de contrôle immergé dans la solution d’essai sans chargement mécanique montrent moins de taches Safranin-O dans la zone centrale, ce qui indique une extraction de protéoglycanes. (C) Les échantillons testés montrent une teneur en GAG plus élevée par rapport aux contrôles, ce qui indique une stimulation mécanique; barre d’échelle = 250 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Activité métabolique des chondrocytes articulaires bovins après des essais tribologiques avec différentes variations et contrôles de chargement. La ligne pointillée horizontale représente les niveaux de base. Le test non paramétrique Kruskal-Wallis a été effectué pour comparaison entre les groupes d’essai suivi du test post-hoc de Dunn en cas d’importance. *p < 0,05. Ce chiffre a été modifié à partir de Stotter et coll.18. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Expression génétique de gènes spécifiques au cartilage après des tests tribologiques avec différentes conditions et contrôles de chargement. COL2A1=collagène type 2; ACAN=aggrecan; COL1A1= collagène de type 1; MMP13= matrice metalloprotéine 13. Les niveaux d’expression ont été normalisés au gène d’entretien ménager GAPDH (déshydrogénase glyceraldehyde 3-phosphate). Les lignes pointillées horizontales représentent les niveaux d’expression de base. Le test non paramétrique Kruskal-Wallis a été effectué pour comparaison entre les groupes d’essai suivi du test post-hoc de Dunn en cas d’importance. *p < 0,05. Ce chiffre a été modifié à partir de Stotter et coll.18. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les implants métalliques focaux représentent une procédure de récupération pour des défauts osteochondral, particulièrement dans les patients entre deux âges et après traitement primaire échoué. Bien que les études cliniques aient démontré des résultats prometteurs à court terme, une complication observée est dommages au cartilage indigène opposé10. Les études cadavériques et biomécaniques montrent clairement que l’implantation correcte avec un positionnement plat ou légèrement encastré maintient des pressions de contactnaturelles 19. Les expériences tribologiques offrent la possibilité de tester divers appariements cartilagineux in vitro. Dans de telles conditions, les conditions de chargement, la lubrification, les appariements des matériaux et la durée peuvent être ajustés comme vous le souhaitez.
Le cartilage bovin est disponible en grande quantité à l’abattoir local. La cellularité et la structure zonale sont très semblables aux condyles fémoraux humains20. Cependant, le contenu protéoglycane est spécifique au site, tandis que les niveaux d’expression des gènes se sont montrés uniformes sur la surface articulaire. Dans ce protocole, des bouchons ostéochondral ont été récoltés de la zone de roulement de poids. L’épaisseur du cartilage, l’architecture du collagène et les propriétés tribologiques qui en résultent montrent des différences régionales sur la surfacearticulaire 16. La limitation de l’utilisation de bouchons ostéochondral dans une configuration de chargement non définie avec un réseau de collagène perturbé et la pressurisation fluide modifiée par rapport à des modèles communs entiers doivent être considérées.
Dans la majorité des études tribologiques, PBS seul est utilisé comme solution de test pour générer des données plus robustes. PBS est une solution tampon avec osmolarity isotonique et aide à maintenir un pH constant pendant les expériences biologiques. L’utilisation de PBS avec de l’acide hyaluronique fournit la lubrification des limites et réduit lefrottement 21. Par conséquent, le liquide synovial réduit le coefficient de frottement et améliore la pressurisation des fluides par rapport à la solution saline22. Le coefficient de frottement dépend de diverses propriétés du système, démontrées par la courbe classique de Stribeck. La courbe de Stribeck relie le coefficient de frottement et la viscosité, la vitesse et la charge et présente les régimes de lubrification de base : lubrification limite, mixte et hydrodynamique. La lubrification des limites peut être obtenue avec pbs seul comme fluide lubrifiant, mais les paramètres de chargement devraient être ajustés en conséquence. Le COF délivré à partir des tests sont des valeurs moyennes sur l’AVC. Ainsi, on peut supposer que différentes conditions de lubrification se produisent pendant le cycle. Pendant l’arrêt à la position d’inversion, les conditions limites peuvent prévaloir, tandis que la lubrification mixte peut être prédominante pendant le glissement. Sur la base de la durée absolue pendant le cycle coulissant, ce dernier aurait eu plus d’influence sur la valeur moyenne du COF.
Pour étudier les conditions physiologiques qui se produisent dans les articulations pendant les activités quotidiennes, les conditions de chargement peuvent être ajustées en conséquence dans le logiciel tribomètre. Les mesures sensibles à la pression doivent être utilisées pour confirmer les pressions de contact souhaitées. Les pressions de contact fémorotibiales signalées varient entre 1 MPa pendant la position debout et jusqu’à 10 MPa pendant la descente23. Avec un resurfaçage focal, les pressions des implants sont légèrement élevées par rapport aux articulations saines24. Les vitesses coulissantes relatives signalées pendant le cycle de la démarche sont signalées jusqu’à 100 mm/s avec des variations élevées au cours des différentes phases. Cela signifie que les mouvements articulaires relatifs dépassent les vitesses qui peuvent être appliquées dans cette configuration tribologique. Pour imiter les conditions cinétiques naturelles et les pressions de contact dans les articulations saines du genou, les conditions de chargement varient de 1 à 10 MPa de pression de contact et de 5 à 100 mm/s de vitesse de glissement. Cependant, bien que des charges élevées puissent être appliquées dans cette configuration expérimentale, la gamme des vitesses coulissantes est limitée. Les conditions pathologiques de chargement, à la fois la surcharge et les charges inadéquates, peuvent également être simulées. De faibles vitesses coulissantes ou une charge statique assimilent l’immobilisation, tandis que les charges plus élevées représentent une stimulation mécanique non physique.
Comme la digestion enzymatique peut affecter l’expression de gènes spécifiques au cartilage, une homogénéisation non enzymatique des tissus est décrite dans ce protocole. Pendant la synthèse de l’ADN, en plus des instructions, l’ARN du bactériophage MS2 est ajouté à des fins de stabilisation. Des niveaux d’expression de gène, mais pas des protéines, ont été analysés pour détecter des changements tôt dans l’activité biosynthétique des chondrocytes articulaires. En plus des sections histologiques et de l’activité métabolique, ces analyses fournissent des informations complètes sur les effets de la charge mécanique sur le cartilage articulaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. et le gouvernement provincial de Basse-Autriche par le biais des appels en sciences de la vie (Id du projet : LSC15-019) et par le programme autrichien COMET (Projet K2 XTribology, Subvention no 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
