Summary
Этот протокол описывает подготовку, биотрибологическое тестирование и анализ остеохондральных цилиндров, скользящих против материала металлического имплантата. Итогом мер, включенных в этот протокол, являются метаболическая активность, экспрессия генов и гистология.
Abstract
Остеохондроз у пациентов среднего возраста можно лечить с помощью фокусных металлических имплантатов. Впервые разработанные для дефектов коленного сустава, имплантаты теперь доступны для плеча, бедра, лодыжки и первого плюсневого фалангального сустава. Обеспечивая снижение боли и клиническое улучшение, прогрессивные дегенеративные изменения противоположного хряща наблюдаются у многих пациентов. Механизмы, ведущие к этому ущербу, до конца не изучены. Этот протокол описывает трибологический эксперимент по имитации спаривания металла на хряще и всесторонний анализ суставного хряща. Металлический имплантат материал тестируется против бычьего остеохондрального цилиндра в качестве модели для суставного хряща человека. Применяя различные нагрузки и скользящие скорости, физиологические условия загрузки могут быть имитирован. Для обеспечения всестороннего анализа воздействия на суставной хрящ, гистология, метаболическая активность и анализ экспрессии генов описаны в этом протоколе. Основным преимуществом трибологического тестирования является то, что параметры загрузки могут свободно корректироваться для имитации условий vivo. Кроме того, различные решения тестирования могут быть использованы для исследования влияния смазки или провоспалительных агентов. С помощью анализа экспрессии генов хряща и катаболических генов могут быть обнаружены ранние изменения в метаболизме суставных хондроцитов в ответ на механическую нагрузку.
Introduction
Лечение остеохондрозных дефектов является требовательным и требует хирургического вмешательства во многих случаях. Для очаговых остеохондральных поражений у пациентов среднего возраста, фокусные металлические имплантаты являются жизнеспособным вариантом, особенно после отказа первичного лечения, как стимуляция костного мозга (BMS) или аутологичной имплантации хондроцитов (ACI)1. Частичные замены поверхности можно считать спасательными процедурами, которые могут уменьшить боль и улучшить диапазон движения2. Эти имплантаты, как правило, состоят из сплава CoCrMo и доступны в различных размерах и смещения конфигураций в соответствует нормальной анатомии3. Хотя первоначально разработаны для дефектов на медиальной бедренной конды в колене, такие имплантаты теперь доступны и используются для бедра, лодыжки, плеча и локтя4,5,6. Для удовлетворительного результата, очень важно оценить механическое выравнивание суставов и состояние противоположного хряща. Кроме того, правильное имплантация без выпячивания имплантата была показана как фундаментальная7.
Клинические исследования показали отличные краткосрочные результаты с точки зрения уменьшения боли и улучшения функции у пациентовсреднего возраста в различных местах 5,6,8. По сравнению с имплантацией алотрансплантата, фокусные металлические имплантаты позволяют раннего веса подшипника. Тем не менее, противоположные суставного хряща показали ускоренный износ у значительного числапациентов 9,10. Таким образом, даже при правильном размещении, во многих случаях дегенерация родного хряща кажется неизбежным, в то время как основные механизмы остаются неясными. Подобные дегенеративные изменения наблюдались после биполярной гемиартропластикитазобедренного сустава 11 и увеличивались с активностью инагрузкой 12.
Трибологические эксперименты дают возможность изучать такие пары в пробирке и моделировать различные ситуации нагрузки, происходящие в физиологическихусловиях 13. Использование остеохондрозных булавки предлагает простую модель геометрии для исследования трибологии суставного хряща скольжения против родного хряща или любой имплантатматериала 14 и может быть дополнительно использован в целом совместных моделей моделирования15. Металлические на хряще пары показывают ускоренный износ хряща, внеклеточные нарушения матрицы, и снижение жизнеспособности клеток в поверхностной зоне по сравнению с хрящом-на-хрящспаривания 16. Повреждение хряща произошло в основном в виде деламинации между поверхностными и средними зонами17. Однако механизмы, ведущие к дегенерации хряща, до конца не изучены. Данный протокол обеспечивает всесторонний анализ биосинтетической активности суставного хряща. По определению метаболической активности и уровня экспрессии генов катаболических генов, ранние признаки распада хряща могут быть определены. Преимущество в пробирке трибологических экспериментов заключается в том, что параметры загрузки могут быть скорректированы для имитации различных условий загрузки.
Таким образом, следующий протокол подходит для имитации спаривания металла на хряще, представляющий экспериментальную модель гемиартропластики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка металлических цилиндров
- Проанализируйте цилиндрические стержни кобальт-хром-молибден (CoCrMo), выполняющие стандартные спецификации для хирургических имплантатов для их химического состава с использованием сканирующей электронной микроскопии (SEM) с энергетической диспергаторной рентгеновской спектроскопией на протокол производителя для подтверждения предоставленных значений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Элементарный состав сплава CoCrMo, используемого для этого эксперимента, составляет 65% Co, 28% Cr, 5% Mo и 2% других. - Влажный молоть образцы с кремния карбида шлифовальной бумаги, начиная с зерна размером 500. Используйте шлифоваку бумаги в увеличении порядка до размера зерна 4000.
- Польский цилиндр с 3 мкм и 1 мкм пасты для достижения поверхности шероховатости, которая находится в пределах уровня толерантности поверхностных требований отделки для металлических хирургических имплантатов (ISO 5832-12:2019) и общей и частичной замены суставов имплантатов (ISO 21534:2007).
ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя шероховатость поверхности определяется с помощью конфокального микроскопа. - Отрежьте стержни CoCrMo (No 6 мм) к цилиндрам с длиной 10 мм.
2. Сбор остеохондровых цилиндров
- Используйте бычьих подавлять суставы из skeletally зрелых животных (в возрасте 18-24 месяцев на момент жертвоприношения) и держать их содержащиеся и охлаждается до вскрытия в течение 24 ч после жертвоприношения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соединения закупаются у местного мясника. Сустав остается закрытым до вскрытия. - Для сбора цилиндрических остеохондрических пробок в асептических условиях, дезинфицировать колено и выполнить артротомию и разоблачить медиальной бедренной конды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрытие должно быть выполнено с осторожностью, чтобы не повредить суставную поверхность. - Осмотрите суставную поверхность на литье на макроскопические повреждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отбросьте образец, если хрящ не имеет беловатый, гладкий и глянцевый вид или если есть пузыри, трещины или большие дефекты. - Выровнять режущей трубки перпендикулярно суставной поверхности несущих области и диск устройства в хрящ и субхондриальной кости твердых ударов молотком. На глубине 15 мм проникновение, поворот устройства по часовой стрелке с внезапным движением.
- Снимите устройство, вставьте белую ручку и ввинчивай ее до тех пор, пока не будет виден нижний конец остеохондрозной пробки.
- Отметйте антеропостерную ориентацию образцов стерильным маркером, чтобы организовать остеохондрический цилиндр соответственно во время тестирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трехмерная коллагеновая сеть и ее сложная архитектура облегчают уникальные механические свойства суставного хряща и должны учитываться в ориентации образцов. - Промыть образец фосфатно-буферным солевым раствором (PBS), чтобы смыть кровь и жировую ткань.
- Повторите упомянутые выше шаги, чтобы собрать нужное количество остеохондрозных пробок (диаметр 8 мм, длина 15 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, от 9 до 12 остеохондральных цилиндров могут быть собраны из области подшипника веса на медиальной бедренной конды. - Поместите образцы в модифицированную среду Орла Дулбекко, содержащую 10% сыворотки крупного рогатого скота плода, дополненную антибиотиками (пенициллин 200 U/mL; стрептомицин 0,2 мг/мл) и амфотерицин B 2,5 мкг/мл и храните их при 4 градусах Цельсия до тестирования на жизнеспособность.
- Проанализируйте контроль остеохондрозные пробки сразу после сбора урожая для установления базовых значений (см. раздел анализа).
3. Трибологическое тестирование
- Выполните эксперименты с использованием коммерчески доступного взаимного трибометра с конфигурацией цилиндра на пластине. Требованиями к устройству являются вертикальная загрузка и регулируемая нагрузка и скорость скольжения. Кроме того, жидкая клетка позволяет выполнять тесты в смазочковом растворе.
- Определите контактное давление в системе CoCrMo-on-cartilage с помощью пленки измерения давления. Поместите пленку измерения давления на интерфейс и примените статическую нагрузку на 30 с, чтобы определить начальное контактное давление, размер контакта и форму. Из-за вытяжки металлического цилиндра и суставного хряща, начальная контактная зона имеет эллиптической формы в этой конфигурации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пленка измерения давления реагирует на оказываемое давление, показывающее красное обесцвечивание зон, где пороговое давление достигнуто или превышено. Для 1 N нагрузки контактное давление определялось в районе 2 МПа путем визуального сравнения с определенным контактным давлением. - Зафиксировать остеохондровые цилиндры на нижнем держателе образца с маркировкой, выровненной с раздвижным направлением, и установить цилиндры CoCrMo на верхнюю ячейку нагрузки.
- Добавьте испытательный раствор (PBS с г/л гиалуроновой кислоты) в жидкую клетку, что приводит к погружению остеохондрального цилиндра и покрытию металло хрящевой раздвижной интерфейс.
- Установите параметры тестирования (предписанная нормальная сила, ход и скорость скольжения), которые затем применяются и поддерживаются на протяжении всего теста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длина хода взаимного движения должна быть установлена в соответствии с областью контакта для создания мигрирующей зоны контакта (MCA). Для пробок диаметром 8 мм 2 мм позволяет адекватно регидратации хряща. - Начните взаимное скольжение цилиндра CoCrMo против суставного хряща, погруженного в смазочный раствор с набором параметров нагрузки.
- Мониторинг коэффициента трения (COF) во время экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: COF оценивается автоматически, но может быть рассчитан с использованием уравнения μ F/W (μ - коэффициент трения; F - фрикционная сила; W - нормальная нагрузка, применяемая системой). - Прекратите эксперимент после желаемого периода тестирования.
- Удалите остеохондрозную вилку из держателя образца, промойте ее PBS и храните в среде до дальнейшего биологического анализа (см. ниже).
- Погрузите образцы управления в испытательном растворе при комнатной температуре в течение всего теста и проанализируйте вместе с образцами, подвергшимися механической нагрузке.
4. Анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Остеохондровый цилиндр анализируются на метаболическую активность и экспрессию генов для исследования биологической активности; гистология проводится для изучения целостности поверхности хряща и основной матрицы.
- Гистологии
- Для гистологического анализа погрузите остеохондрозные пробки в 4% буферного раствора формальдегида при комнатной температуре до дальнейшей обработки.
- Промыть образцы с PBS и поместить их в пластиковый сосуд.
- Добавьте избыток готового к использованию наклейки-решения, чтобы все образцы были покрыты.
- Применять постоянную агитацию в течение 4 недель для полной наклейки.
- После наклейки встраивайте образцы в водорастворимые гликолы и смолы и храните их при 80 градусах Цельсия.
- Получить 6 мкм разделов, криозирование поперечных в область контакта.
- Впоследствии, подготовить образцы для Safranin O окрашивания и Fastgreen счетчиков с использованием протокола производителя.
- Захват гистологических изображений с помощью микроскопа и процесс с помощью программного обеспечения обработки изображений.
- Метаболическая активность
ПРИМЕЧАНИЕ: Метаболическая активность хондроцитов в суставном хряще исследована с помощью токсикологического анализа на основе XTT ex vivo.- Промыть остеохондрозную вилку с помощью PBS и поместить образец в чашку Петри.
- Поместите 24-хорошо пластины по шкале и нулевой шкале.
- Отрежьте хрящ от остеохондроза скальпелем в один кусок.
- Разрезать хрящ на две равные части, так что контактная зона равномерно распределена по обеим частям хряща и фарш от половины до 1 мм3 штук. Вторая половина используется для анализа экспрессии генов.
- Перенесите рубленый хрящ в один колодец подготовленной 24-хорошо пластины и определить вес ткани.
- Повторите упомянутые выше шаги для каждого образца и добавьте 1 мл среды роста к каждому колодец пластины.
- Добавьте решение XTT (490 МКЛ реагента маркировки XTT и 10 мкл реагента активации) в соответствии с инструкцией производителя и смесью.
- Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в течение 4 ч.
- После инкубации снимите супернатант и перенесите его в трубку 5 мл.
- Извлекните продукт тетразолия, добавив 0,5 мл диметилсульфсида (DMSO) в хрящевую ткань в 24-хорошо пластины и применять непрерывное возбуждение в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Удалите решение DMSO и объединить его с ранее собранным решением XTT.
- Передача 100 МКЛ образца в трипликатах в пластине 96-колодец на считыватель пластин и измерить поглощение на длине волны 492 нм и эталонной длины волны на 690 нм.
- Нормализуйте полученные значения поглощения до влажного веса каждого образца и выполняйте анализ с помощью программного обеспечения.
- Анализ экспрессии генов
- Изоляция РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: изоляция РНК осуществляется с использованием коммерческого комплекта(Таблица материалов)в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем с небольшими поправками.- Измельчите вторую половину хрящевой ткани, полученной из остеохондроза, на мелкие кусочки.
- Перенесите их в трубку, содержащую керамические бусы и 300 МКЛ лиза буфера (содержащий 1% β-меркаптоэтанол).
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть заморожены в жидком азоте до дальнейшей обработки. - Оттепель образцов в течение 2 мин и использовать коммерческий лизер для гомогенизации ткани. Нанесите 6500 об/мин на 20 с (шаг гомогенизации) четыре раза с 2-минутной фазой охлаждения после каждого запуска (при 4 градусов по Цельсию с помощью коммерческого устройства охлаждения лизера), чтобы полностью нарушить работу ткани.
- Добавьте 20 МКЛ протеиназы K и 580 МКЛ воды без RNase в каждую трубку и инкубировать их при 55 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
- Центрифуга образцов в течение 3 мин при 10000 х г и передачи супернатанта в 1,5 мл трубки.
- Добавьте 0,5 тома 90% этанола в каждую трубку и перемешайте.
- Перенесите 700 МКЛ образца в колонку связывания РНК, помещенную в трубку сбора 2 мл и центрифугу по 8000 х г на 15 с.
- Отбросьте протеку и повторите шаг центрифугации для полного лисата.
- Добавьте 350 мкл буфера RW1 в столбец, центрифугу на 8000 х г на 15 с и отбросьте протеку.
- Смешайте 10 МКЛ раствора DNase и 70 МКЛ буферного RDD. Добавьте раствор в мембрану очистки РНК и инкубировать его при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Добавьте 350 мкл буфера RW1 в столбец и центрифугу при 8000 х г на 15 с. Отбросьте поток через.
- Добавьте 500 МКЛ буферной RPE и центрифуги при 8000 х г на 15 с. Отбросьте поток через.
- Добавьте 500 мкл буферной RPE в столбец очистки РНК и центрифугу при 8000 х г в течение 2 минут.
- Поместите столбец в трубку для сбора 1,5 мл и добавьте 30 МКЛ воды без RNase. Центрифуга при 8000 х г в течение 1 мин.
- Храните изолированную РНК при -80 градусов по Цельсию до синтеза cDNA.
- синтез cDNA
ПРИМЕЧАНИЕ: Для синтеза дополнительной ДНК (cDNA) из мессенджера РНК (мРНК) был использован коммерческий комплект (Таблица материалов). РНК из бактериофажа MS2 была добавлена для стабилизации изолированной РНК во время синтеза кДНК.- Оттепель и смешать реагенты. Композиция для одной реакции показана в таблице 1.
- Добавьте 16 МКЛ образца РНК к объему для одной реакции (14 МКЛ).
- Выполните синтез кДНК в тепловом циклере, используя следующие параметры: 10 мин при 25 градусов по Цельсию (праймер-аннеализация), 60 мин при 50 градусов по Цельсию (синтез ДНК), 5 мин при 85 градусов по Цельсию (денатурация) и 5 мин при 20 градусов по Цельсию (фаза охлаждения).
- Храните cDNA при -20 градусов по Цельсию до количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (RT-qPCR).
- РТ-КПКР
ПРИМЕЧАНИЕ: Для RT-qPCR образцов крупного рогатого скота, грунтовки и зонды были разработаны с помощью коммерческого программного обеспечения qPCR в режиме реального времени (например, IDT) для генов GAPDH (Глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа), COL2A1 (коллаген типа 2), ACAN (Аггрекан), COL1A1 (коллаген типа 1), MMP-1 (Матрица Металлопротеиназа-1) и MMP-13 (Матрица Металлопротеиназа-13). Bovine грунтовки и двойные затухаемые зонды были предоставлены IDT. Реагенты, используемые для одной реакции для оценки эффективности и экспрессии генов, отображаются в таблице 2.- Выпределите мастер-микс одной реакции (9 йл) к каждой колодец 96-хорошо ПЦР пластины и добавить 1 йл кДНА для каждой реакции. Выполните тесты для каждого образца в трипликатах.
- Закройте пластину ПЦР с помощью герметизации масла и центрифуги при 877 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Выполните RT-qPCR с помощью высокоточного теплового цикла со следующим протоколом: 95 градусов по Цельсию за 10 минут, 45 циклов усиления (95 градусов по Цельсию на 10 с, аннеалирование на 30 с, синтез cDNA) и 37 градусов по Цельсию на 30 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой грунтовки требуются специфические температуры. - Используйте GAPDH вместе с целевыми генами для подтверждения эффективности.
- Используйте предоставленное программное обеспечение для расчета эффективности каждого гена.
- Нормализация значений порогового значения цикла (КТ) с выражением эталонного гена GAPDH и использование метода КТ для количественной оценки.
- Изоляция РНК
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Область контакта и контактное давление должны быть подтверждены с помощью пленки измерения давления(рисунок 1). Физиологическое состояние нагрузки может быть подтверждено путем сравнения со эталонными отпечатками для определенного контактного давления. Во время тестирования коэффициент трения постоянно контролируется. При мигрирующей зоне контакта низкий коэффициент трения может сохраняться не менее 1 ч(рисунок 2). Использование Safranin O окрашивания внеклеточной матричной композиции и структуры может быть определено(рисунок 3). Интенсивность окрашивания Safranin O пропорциональна содержанию протеогликана. Быстрый зеленый счетчики не коллагена сайтов и обеспечивает четкий контраст с Safranin O окрашивания. Содержание протеогликана варьируется по поверхности суставов, но должно быть однородным по всему разделу ткани в базовых образцах(рисунок 3A). Образцы управления, погруженные в решение для тестирования, показывают извлечение ГАГ, которым можно противодействовать с помощьюмеханической нагрузки (рисунок 3B, 3C). Метаболическая активность суставных хондроцитов крупного рогатого скота не зависит от места сбора урожая, но показывает увеличение механической нагрузки по сравнению с выгруженным контролем(рисунок 4). Уровни экспрессии генов хряща (COL2A1, ACAN) увеличиваются при физиологических условиях нагрузки, в то время как катаболические гены (COL1A1 и MMP13) регулируются стационарной зоной контакта(рисунок 5).
| Объем (кл) | |
| Транскриптор RT Реакции Буфер 5x Conc. | 6 |
| Протектор ингибитор rNase 40U/l | 0.75 |
| Дезоксиноклеотид Микс 10 мМ каждый | 3 |
| Случайный Гексамер Праймер 600 МКМ | 3 |
| Транскриптор Обратная Транскриптаза 20 U/L | 0.75 |
| РНК MS2 (0,8 мкг/мл) | 0.375 |
| Nuclease бесплатно дистиллированной воды | 0.125 |
| Общий объем | 14 |
Таблица 1: Реагенты для одной реакции на синтез кДНК.
| Объем (кл) | |
| FastStart зонд Мастер 2X | 5 |
| Гидролиз зонд 2,5 МКМ | 1 |
| Левый ПраймерГАПДХ 5 МКМ | |
| Правый праймер GAPDH 5 МКМ | |
| Nuclease бесплатно дистиллированной воды | 3 |
| Всего Мастер Микс | 9 |
Таблица 2: Реагенты для Master Mix для одного ПЦР.
Рисунок 1: Pressure измерения начальной области контакта на металлическо-хрящевой интерфейс перед тестированием. Из-за вытяжки металлического цилиндра и суставной поверхности и его упругих свойств, начальная контактная зона эллиптическая. Во время скольжения, эта начальная область контакта движется с ударом 2 мм, в результате чего большая площадь, которая подвергается механической нагрузке; шкала бар 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Коэффициент трения, зависящий от времени (длительность 1 час) для семи образцов, протестированных на скорости скольжения 8 мм/с и 1 N нагрузке (2 МПа контактного давления). Каждая цветная линия представляет COF одного остеохондрального цилиндра. Наблюдаемая изменчивость находится в пределах биологических образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Гистологические поперечные сечения образцов бычьего остеохондроза, окрашенных сафранином-О и быстрым зеленым цветом. (A)Базовые образцы показывают высокое содержание GAG по всему суставного хряща. (B)Контрольный образец, погруженный в испытательный раствор без механической нагрузки, показывает меньше окрашивания Safranin-O в средней зоне, что свидетельствует об извлечении протеогликанов. (C)Проверенные образцы показывают более высокое содержание GAG по сравнению с управлением, что указывает на механическую стимуляцию; шкала бар 250 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Метаболическая активность бычьих суставных хондроцитов после трибологического тестирования с различными вариациями нагрузки и контроля. Горизонтальная пунктирная линия представляет базовые уровни. Непараметрический тест Kruskal-Wallis был выполнен для сравнения между группами тестирования с последующим специальным тестом Данна в случае значимости. 0,05. Эта цифра была изменена с Stotter et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Генное выражение генов, специфичных для хряща, после трибологического тестирования с различными условиями загрузки и контроля. COL2A1-коллагеновый тип 2; АКАНАГрегрекан; КОЛ1А1 " коллаген типа 1; Матрица MMP13" металлопротеиназа 13. Уровни экспрессии были нормализовываются к гену gapDH (глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа). Горизонтальные пунктирные линии представляют базовые уровни выражения. Непараметрический тест Kruskal-Wallis был выполнен для сравнения между группами тестирования с последующим специальным тестом Данна в случае значимости. 0,05. Эта цифра была изменена с Stotter et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Фокусные металлические имплантаты представляют собой спасительную процедуру остеохондроза дефектов, особенно у пациентов среднего возраста и после неудачного первичного лечения. Хотя клинические исследования показали многообещающие краткосрочные результаты, одним из наблюдаемых осложнений является повреждение противоположного, родного хряща10. Труп и биомеханические исследования показывают четкие доказательства того, что надлежащая имплантация с плоским или слегка утопленным позиционированием поддерживает естественное контактноедавление 19. Трибологические эксперименты дают возможность протестировать различные пары хрящей в пробирке. В таких условиях погрузка, смазка, материальные спаривания и продолжительность могут быть скорректированы по желанию.
Хрящ крупного рогатого скота доступен в большом количестве на местной скотобойне. Клеточность и зональная структура очень похожи на человеческие бедренные кондилы20. Тем не менее, содержание протеогликана является специфическим для сайта, в то время как уровни экспрессии генов были показаны как однородные над суставной поверхностью. В этом протоколе, остеохондрозные пробки были собраны из области подшипника веса. Толщина хряща, архитектура коллагена и, как следствие, трибологические свойства показывают региональные различия по поводу суставнойповерхности 16. Необходимо учитывать ограничение использования остеохондрозных пробок в неограниченной установке погрузки с нарушенной коллагеновой сетью и измененное давление жидкости по сравнению с целыми моделями суставов.
В большинстве трибологических исследований, PBS только используется в качестве решения тестирования для получения более надежных данных. PBS является буферным раствором с изотонической осмолярностью и помогает поддерживать постоянный рН во время биологических экспериментов. Использование PBS с гиалуроновой кислотой обеспечивает границу смазки и снижение трения21. Соответственно, синовиальная жидкость снижает коэффициент трения и улучшает давление жидкости по сравнению с солевымраствором 22. Коэффициент трения зависит от различных свойств системы, продемонстрировано классической кривой Stribeck. Кривая Стрибека соотносит коэффициент трения и вязкость, скорость и нагрузку и представляет основные режимы смазки: пограничную, смешанную и гидродинамическую смазку. Граница смазки могут быть получены с PBS только в качестве смазки жидкости, но параметры загрузки должны быть скорректированы соответствующим образом. COF, поставляемый из тестов, является средним значением за ход. Таким образом, можно предположить, что в течение цикла возникают различные условия смазки. Во время застоя в разворотной позиции могут преобладать пограничные условия, в то время как смешанная смазка может преобладать во время скольжения. Основываясь на абсолютной продолжительности в течение скользящего цикла, последний оказал бы большее влияние на среднее значение COF.
Для исследования физиологических условий, происходящих в суставах во время повседневной деятельности, условия загрузки могут быть соответствующим образом скорректированы в программном обеспечении трибометра. Для подтверждения желаемого контактного давления следует использовать чувствительные к давлению измерения. Сообщается, бедренной кости контактного давления варьируются от 1 MPa во время стоя и до 10 MPa во время спускаработает 23. С фокусной шлифовки, имплантат давление просто слегка повышен по сравнению со здоровымисуставами 24. Сообщается, что относительные скорости скольжения во время цикла походки сообщаются до 100 мм/с с высокими вариациями на различных этапах. Это означает, что относительные движения суставов превышают скорости, которые могут быть применены в этой трибологической установке. Для имитации естественных кинематических условий и контактного давления в здоровых коленных суставах условия нагрузки варьируются от 1 до 10 МПа контактного давления и от 5 до 100 мм/с скользящей скорости. Однако, в то время как высокие нагрузки могут быть применены в этой экспериментальной установки, диапазон скользящих скоростей ограничен. Можно также моделировать патологические условия загрузки, как перегрузки, так и неадекватные нагрузки. Низкие скорости скольжения или статическая загрузка приравнивают иммобилизацию, в то время как более высокие нагрузки представляют собой нефизиологическую механическую стимуляцию.
Поскольку энзиматичное пищеварение может повлиять на экспрессию генов, специфичных для хряща, в этом протоколе описана однонзимная гомогенизация тканей. Во время синтеза кДНК, в дополнение к инструкциям, для целей стабилизации добавляется РНК из бактериофажа MS2. Уровни экспрессии генов, но не белки, были проанализированы для выявления ранних изменений в биосинтетической активности суставных хондроцитов. Помимо гистологических секций и метаболической активности, эти анализы дают исчерпывающую информацию о воздействии механической нагрузки на суставной хрящ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Н. Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. и провинциальное правительство Нижней Австрии через life Science Calls (Проект ID: LSC15-019) и австрийской программы COMET (Проект K2 XTribology, Грант No 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
