Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung, biotribologische Prüfung und Analyse von Osteochonderzylindern, die gegen Metallimplantatmaterial gleiten. Ergebnismaßnahmen, die in diesem Protokoll enthalten sind metabolische Aktivität, Genexpression und Histologie.
Abstract
Osteochondrale Defekte bei Patienten mittleren Alters könnten mit fokalen metallischen Implantaten behandelt werden. Zunächst für Defekte im Kniegelenk entwickelt, sind nun Implantate für Schulter, Hüfte, Knöchel und das erste metatarsalphalangeal Gelenk erhältlich. Bei der Schmerzlinderung und klinischen Verbesserung werden bei vielen Patienten progressive degenerative Veränderungen des gegnerischen Knorpels beobachtet. Die Mechanismen, die zu diesem Schaden führen, sind nicht vollständig verstanden. Dieses Protokoll beschreibt ein tribologisches Experiment zur Simulation einer Metall-auf-Knorpel-Paarung und einer umfassenden Analyse des Gelenkknorpels. Metallimplantatmaterial wird an Rinderosteochondralzylindern als Modell für den menschlichen Gelenkknorpel getestet. Durch die Anwendung unterschiedlicher Lasten und Gleitgeschwindigkeiten können physiologische Belastungsbedingungen nachgeaht werden. Um eine umfassende Analyse der Auswirkungen auf den Gelenkknorpel, Histologie, metabolische Aktivität und Genexpressionsanalyse zu ermöglichen, werden in diesem Protokoll beschrieben. Der Hauptvorteil der tribologischen Tests besteht darin, dass die Belastungsparameter frei eingestellt werden können, um in vivo-Bedingungen zu simulieren. Darüber hinaus können verschiedene Testlösungen verwendet werden, um den Einfluss von Schmier- oder Entzündungsmitteln zu untersuchen. Durch die Verwendung von Genexpressionsanalysen für Knorpel-spezifische Gene und katabole Gene könnten frühe Veränderungen im Stoffwechsel von Gelenkchdrozyten als Reaktion auf mechanische Belastung nachgewiesen werden.
Introduction
Die Behandlung von Osteochonderdefekten ist anspruchsvoll und erfordert in vielen Fällen eine Operation. Bei fokalen osteochondralen Läsionen bei Patienten mittleren Alters sind fokale metallische Implantate eine praktikable Option, insbesondere nach dem Scheitern der Primärbehandlung, wie Knochenmarkstimulation (BMS) oder autologe Chondrozytenimplantation (ACI)1. Teilweiser Oberflächenersatz kann als Bergungsverfahren betrachtet werden, die Schmerzen reduzieren und den Bewegungsbereich verbessern können2. Diese Implantate bestehen in der Regel aus einer CoCrMo-Legierung und sind in verschiedenen Größen und Offset-Konfigurationen erhältlich, um der normalen Anatomie3zu entsprechen. Während ursprünglich für Defekte an der medialen Femoralkondyle im Knie entwickelt, sind solche Implantate jetzt verfügbar und im Einsatz für die Hüfte, Knöchel, Schulter, und Ellenbogen4,5,6. Für ein zufriedenstellendes Ergebnis ist es entscheidend, die mechanische Gelenkausrichtung und den Zustand des gegnerischen Knorpels zu beurteilen. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass eine korrekte Implantation ohne Vorsprünge des Implantats grundlegend ist7.
Klinische Studien zeigten hervorragende kurzfristige Ergebnisse in Bezug auf Schmerzlinderung und Verbesserung der Funktion bei Patienten mittleren Alters für verschiedene Standorte5,6,8. Im Vergleich zur Allograft-Implantation ermöglichen fokale Metallimplantate ein frühes Gewicht. Der gegnerische Gelenkknorpel zeigte jedoch bei einer beträchtlichen Anzahl von Patienten einen beschleunigten Verschleiß9,10. Daher scheint selbst bei ordnungsgemäßer Platzierung eine Degeneration des einheimischen Knorpels in vielen Fällen unvermeidlich, während die zugrunde liegenden Mechanismen unklar bleiben. Ähnliche degenerative Veränderungen wurden nach der bipolaren Hemiarthroplastik der Hüfte11 beobachtet und werden mit Aktivität und Belastung12erhöht.
Tribologische Experimente bieten die Möglichkeit, solche Paarungen in vitro zu untersuchen und verschiedene Belastungssituationen zu simulieren, die unter physiologischen Bedingungen auftreten13. Die Verwendung von Osteochondralstiften bietet ein einfaches Geometriemodell zur Untersuchung der Tribologie des Gelenkknorpelgleitens gegen nativen Knorpel oder jedes Implantatmaterial14 und könnte weiter in ganzen Gelenksimulationsmodellen15verwendet werden. Metall-auf-Knorpel-Paarungen zeigen beschleunigten Knorpelverschleiß, extrazelluläre Matrixstörungen und verminderte Zelllebensfähigkeit in der oberflächlichen Zone im Vergleich zu einer Knorpel-auf-Knorpel-Paarung16. Schäden am Knorpel traten hauptsächlich in Form von Delamination zwischen der oberflächlichen und mittleren Zone17auf. Die Mechanismen, die zu knorpeldegenerationleiten, sind jedoch nicht vollständig verstanden. Dieses Protokoll bietet eine umfassende Analyse der biosynthetischen Aktivität des Gelenkknorpels. Durch die Bestimmung der metabolischen Aktivität und der Genexpressionsniveaus kataboler Gene könnten frühe Hinweise auf einen Knorpelabbau identifiziert werden. Der Vorteil von in vitro tribologischen Experimenten besteht darin, dass Die Belastungsparameter an verschiedene Belastungsbedingungen angepasst werden können.
Daher eignet sich das folgende Protokoll zur Simulation einer Metall-auf-Knorpel-Paarung, die ein experimentelles Hemiarthroplastikmodell darstellt.
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Protocol
1. Herstellung von Metallzylindern
- Analysieren Sie zylindrische Kobalt-Chrom-Molybdän-Stäbe (CoCrMo), die die Standardspezifikationen für chirurgische Implantate für ihre chemische Zusammensetzung erfüllen, indem Sie die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie pro Herstellerprotokoll zur Bestätigung der bereitgestellten Werte verwenden.
HINWEIS: Die elementare Zusammensetzung der CoCrMo-Legierung, die für dieses Experiment verwendet wird, beträgt 65% Co, 28% Cr, 5% Mo und 2% andere. - Nass mahlen die Proben mit Siliziumkarbid-Schleifpapier ab einer Korngröße von 500. Verwenden Sie Schleifpapier in erhöhter Reihenfolge bis zu einer Korngröße von 4000.
- Polieren Sie den Zylinder mit einer Paste von 3 m und 1 m, um eine Oberflächenrauheit zu erreichen, die innerhalb des Toleranzniveaus der Oberflächenbeschaffenheit für metallische chirurgische Implantate (ISO 5832-12:2019) und Gesamt- und Teilgelenkersatzimplantate (ISO 21534:2007) liegt.
HINWEIS: Die durchschnittliche Oberflächenrauheit wird mit einem konfokalen Mikroskop bestimmt. - CoCrMo-Stäbe (ca. 6 mm) auf Zylinder mit einer Länge von 10 mm schneiden.
2. Ernte von Osteochonderzylindern
- Verwenden Sie Rinder-Stifle-Gelenke von skelettreifen Tieren (im Alter von 18-24 Monaten zum Zeitpunkt des Opfers) und halten Sie sie enthalten und gekühlt, bis die Zerlegung innerhalb von 24 h nach dem Opfer.
HINWEIS: Joints werden vom örtlichen Metzger gekauft. Das Gelenk bleibt bis zur Zerlegung geschlossen. - Um zylindrische Osteochondralstecker unter aseptischen Bedingungen zu ernten, desinfizieren Sie das Knie und führen Sie eine Arthrotomie durch und setzen Sie den medialen Femoralkondyle frei.
HINWEIS: Die Zerlegung muss mit Vorsicht durchgeführt werden, um die Gelenkoberfläche nicht zu beschädigen. - Prüfen Sie die Gelenkoberfläche auf makroskopische Schäden.
HINWEIS: Entsorgen Sie die Probe, wenn der Knorpel nicht weißlich, glatt und glänzend wirkt oder wenn Blasenbildung, Risse oder größere Defekte auftreten. - Richten Sie das Schneidrohr senkrecht zur Gelenkoberfläche des gewichtstragenden Bereichs aus und treiben Sie das Gerät mit einem Hammer durch feste Striche in den Knorpel und unterchondralen Knochen. Bei 15 mm Eindringtiefe das Gerät mit einer plötzlichen Bewegung im Uhrzeigersinn drehen.
- Entfernen Sie das Gerät, setzen Sie den weißen Knopf ein und schrauben Sie es ein, bis das untere Ende des Osteochondersteckers sichtbar ist.
- Markieren Sie die anteroposterior epositionäre Ausrichtung der Proben mit einem sterilen Marker, um den Osteochonderzylinder während der Prüfung entsprechend anzuordnen.
HINWEIS: Das dreidimensionale Kollagennetzwerk und seine komplexe Architektur erleichtern die einzigartigen mechanischen Eigenschaften des Gelenkknorpels und sollten bei der Ausrichtung der Proben berücksichtigt werden. - Spülen Sie die Probe mit phosphatgepufferter Saline (PBS), um Blut und Fettgewebe abzuwaschen.
- Wiederholen Sie die oben genannten Schritte, um die gewünschte Anzahl an Osteochondersteckern (8 mm Durchmesser, 15 mm Länge) zu ernten.
HINWEIS: Typischerweise können 9 bis 12 Osteochondralzylinder aus der Gewichtslagerfläche auf dem medialen Femoralkondyle geerntet werden. - Legen Sie die Proben in das modifizierte Eagle-Medium von Dulbecco, das 10 % fetales Rinderserum enthält, ergänzt mit Antibiotika (Penicillin 200 U/ml; Streptomycin 0,2 mg/ml) und Amphotericin B 2,5 g/ml und lagern Sie sie bei 4 °C bis zur Prüfung, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
- Analysieren Sie Die Osteochondralstecker unmittelbar nach der Ernte, um Basiswerte festzulegen (siehe Abschnitt Analyse).
3. Tribologische Tests
- Führen Sie die Experimente mit einem handelsüblichen Hubkolben-Tribometer mit zylinder-auf-Platte-Konfiguration durch. Anforderungen an das Gerät sind vertikale Beladung und einstellbare Last- und Gleitgeschwindigkeit. Darüber hinaus ermöglicht eine Flüssigkeitszelle die Durchführung der Tests in einer Schmierlösung.
- Bestimmen Sie den Anpressdruck im CoCrMo-on-Knorpelsystem mit einem Druckmessfilm. Platzieren Sie den Druckmessfilm an der Schnittstelle und tragen Sie eine statische Last für 30 s auf, um den Anfangskontaktdruck, die Kontaktgröße und die Form zu bestimmen. Aufgrund der Konvexität des Metallzylinders und des Gelenkknorpels hat die anfangse Kontaktfläche in dieser Konfiguration eine elliptische Form.
HINWEIS: Der Druckmessfilm reagiert auf den aufgebrachten Druck und zeigt eine rote Verfärbung von Zonen, in denen der Schwellendruck erreicht oder überschritten wird. Für 1 N der Last wurde der Anpressdruck um 2 MPa durch visuellen Vergleich mit definierten Kontaktdrücken bestimmt. - Fixieren Sie die Osteochonderzylinder am unteren Probenhalter mit der Markierung, die an der Gleitrichtung ausgerichtet ist, und montieren Sie die CoCrMo-Zylinder auf die obere Wägezelle.
- Fügen Sie die Prüflösung (PBS mit 3 g/L Hyaluronsäure) in die flüssige Zelle ein, was dazu führt, dass der Osteochonderzylinder untergetaucht und die Metallknorpel-Schiebeschnittstelle abgedeckt wird.
- Legen Sie die Prüfparameter (vorgeschriebene Normalkraft, Hub und Gleitgeschwindigkeit) fest, die dann während des Tests angewendet und beibehalten werden.
HINWEIS: Die Hublänge der Hubbewegung muss entsprechend dem Kontaktbereich eingestellt werden, um einen migrierenden Kontaktbereich (MCA) zu erstellen. Bei Steckern mit einem Durchmesser von 8 mm ermöglicht ein 2 mm Hub eine ausreichende Rehydrierung des Knorpels. - Starten Sie das wechselseitige Schieben des CoCrMo-Zylinders gegen den Gelenkknorpel, der mit den eingestellten Belastungsparametern in die Schmierlösung eingetaucht ist.
- Überwachen Sie den Reibungskoeffizienten (COF) während der Experimente.
ANMERKUNG: Der COF wird automatisch bewertet, kann aber mit der Gleichung μ=F/W (μ - Reibungskoeffizient berechnet werden; F - Reibungskraft; W - normale Belastung durch das System). - Beenden Sie das Experiment nach dem gewünschten Testzeitraum.
- Entfernen Sie den Osteochonder-Stecker aus dem Probenhalter, spülen Sie ihn mit PBS ab und lagern Sie ihn bis zu einer weiteren biologischen Analyse im Medium (siehe unten).
- Untertauchen Sie Proben in der Prüflösung bei Raumtemperatur für die Dauer der Prüfung und analysieren Sie zusammen mit Proben, die mechanisch belastet wurden.
4. Analyse
HINWEIS: Osteochondrale Zylinder werden auf metabolische Aktivität und Genexpression analysiert, um biologische Aktivität zu untersuchen; Histologie wird durchgeführt, um die Knorpeloberflächenintegrität und die zugrunde liegende Matrix zu untersuchen.
- Histologie
- Für die histologische Analyse tauchen Sie die Osteochondralstecker bis zur Weiterverarbeitung in 4% gepufferte Formaldehydlösung bei Raumtemperatur ein.
- Spülen Sie die Proben mit PBS und legen Sie sie in ein Kunststoffgefäß.
- Fügen Sie einen Überschuss der gebrauchsfertigen Entkalkungslösung hinzu, so dass alle Proben abgedeckt werden.
- Tragen Sie konstante Aufregung für 4 Wochen für vollständige Entkalkung.
- Nach der Entkalkung die Proben in wasserlösliche Glykole und Harze einbetten und bei 80 °C lagern.
- Erhalten Sie 6 m Abschnitte, indem Sie transverversal in den Kontaktbereich kryokentieren.
- Anschließend bereiten Sie die Proben für Safranin O Färbung und Fastgreen Gegenfärbung mit einem Herstellerprotokoll.
- Erfassen Sie histologische Bilder mit einem Mikroskop und einem Verfahren mit Bildverarbeitungssoftware.
- Metabolische Aktivität
HINWEIS: Die metabolische Aktivität von Chondrozyten im Gelenkknorpel wird mit einem XTT-basierten Ex-vivo-Toxikologie-Assay untersucht.- Spülen Sie den Osteochondralstecker mit PBS und legen Sie die Probe in eine Petrischale.
- Platzieren Sie eine 24-Well-Platte auf einer Skala und Null die Skala.
- Den Knorpel mit einem Skalpell in einem Stück vom Osteochondraltransplantat abschneiden.
- Den Knorpel in zwei gleiche Stücke zerlegen, so dass die Kontaktfläche gleichmäßig auf beide Knorpelstücke verteilt ist und eine Hälfte bis 1 mm3 Stück zerkleinern. Die zweite Hälfte wird für die Genexpressionsanalyse verwendet.
- Den gehackten Knorpel in einen Brunnen der vorbereiteten 24-Well-Platte geben und das Gewebegewicht bestimmen.
- Wiederholen Sie die oben genannten Schritte für jede Probe und fügen Sie 1 ml Wachstumsmedium zu jedem Brunnen der Platte hinzu.
- Fügen Sie die XTT-Lösung (490 l XTT-Etikettierungsreagenz und 10 l Aktivierungsreagenz) gemäß der Anweisung des Herstellers und der Mischung hinzu.
- Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und 5%CO2 für 4 h.
- Nach der Inkubation den Überstand entfernen und in ein 5 ml Rohr übertragen.
- Extrahieren Sie das Tetrazoliumprodukt, indem Sie 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) in das Knorpelgewebe in der 24-Well-Platte auftragen und bei Raumtemperatur 1 h kontinuierlich rühren.
- Entfernen Sie die DMSO-Lösung, und bündeln Sie sie mit der zuvor gesammelten XTT-Lösung.
- Übertragen Sie 100 l der Probe in Triplicaten in einer 96-Well-Platte auf einen Plattenleser und messen Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 492 nm und eine Referenzwellenlänge bei 690 nm.
- Normalisieren Sie die resultierenden Absorptionswerte auf das Nassgewicht jeder Probe und führen Sie analysen mit Software durch.
- Genexpressionsanalyse
- RNA-Isolierung
HINWEIS: Die RNA-Isolierung erfolgt mit einem kommerziellen Kit (Tabelle der Materialien) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit kleinen Änderungen.- Die zweite Hälfte des Knorpelgewebes aus dem Osteochonder-Stecker in kleine Stücke zerkleinern.
- Übertragen Sie sie in ein Rohr, das Keramikperlen und 300 L Lysispuffer (mit 1% β-Mercaptoethanol) enthält.
HINWEIS: Die Proben können bis zur Weiterverarbeitung in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. - Die Proben 2 min auftauen und den kommerziellen Lyser zur Homogenisierung des Gewebes verwenden. Tragen Sie 6500 Umdrehungen pro Minute für 20 s (Homogenisierungsschritt) viermal mit einer 2 min Kühlphase nach jedem Lauf (bei 4 °C mit dem kommerziellen Lyser-Kühlgerät) auf, um das Gewebe vollständig zu stören.
- Fügen Sie in jeder Röhre 20 l Proteinase K und 580 l RNase-freies Wasser hinzu und inkubieren Sie sie bei 55 °C für 30 min.
- Zentrifugieren Sie die Proben für 3 min bei 10.000 x g und übertragen Sie den Überstand in ein 1,5 ml Rohr.
- Fügen Sie 0,5 Volumen von 90% Ethanol zu jeder Tube und Mischung hinzu.
- Übertragen Sie 700 l der Probe in eine RNA-Bindungssäule, die in ein 2 ml-Sammelrohr und eine Zentrifuge bei 8.000 x g für 15 s gelegt wird.
- Entsorgen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt für das vollständige Lysat.
- Fügen Sie der Säule 350 l Puffer RW1, Zentrifuge bei 8.000 x g für 15 s, und entsorgen Sie den Durchfluss.
- Mischen Sie 10 L DNase-Lagerlösung und 70 l Puffer-RDD. Fügen Sie die Lösung der RNA-Reinigungsmembran hinzu und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 15 min.
- Fügen Sie der Säule 350 l Puffer RW1 und zentrifugieren bei 8.000 x g für 15 s hinzu. Entsorgen Sie den Durchfluss.
- Fügen Sie 500 l Puffer-RPE und Zentrifuge bei 8.000 x g für 15 s hinzu. Entsorgen Sie den Durchfluss.
- Fügen Sie der RNA-Reinigungssäule und Zentrifuge für 2 min 500 l Puffer-RPE und Zentrifugen bei 8.000 x g hinzu.
- Legen Sie die Säule in ein 1,5 ml Sammelrohr und fügen Sie 30 L RNase-freies Wasser hinzu. Zentrifuge bei 8.000 x g für 1 min.
- Bewahren Sie die isolierte RNA bei -80 °C bis zur cDNA-Synthese auf.
- cDNA-Synthese
HINWEIS: Zur Synthese komplementärer DNA (cDNA) aus Boten-RNA (mRNA) wurde ein kommerzielles Kit (Table of Materials) verwendet. RNA aus Bakteriophagen MS2 wurde hinzugefügt, um isolierte RNA während der cDNA-Synthese zu stabilisieren.- Die Reagenzien auftauen und mischen. Die Zusammensetzung für eine einzelne Reaktion ist in Tabelle 1dargestellt.
- Fügen Sie dem Volumen für eine einzelne Reaktion 16 l RNA-Probe hinzu (14 l).
- Führen Sie die cDNA-Synthese in einem thermischen Cycler unter Verwendung der folgenden Parameter durch: 10 min bei 25 °C (Primer-Glühen), 60 min bei 50 °C (DNA-Synthese), 5 min bei 85 °C (Denaturierung) und 5 min bei 20 °C (Kühlphase).
- CDNA bei -20 °C bis zur quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) in Echtzeit lagern.
- RT-qPCR
ANMERKUNG: Bei RT-qPCR von Rinderproben Primer und Sonden wurden mit kommerzieller Real-Time qPCR Software (z.B. IDT) für die Gene GAPDH (Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase), COL2A1 (Collagen Typ 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Collagen Typ 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) und MMP-13 (Matrix Metalloproteinase-13) entwickelt. Rindergrundierungen und doppelt abgeschreckte Sonden wurden von IDT bereitgestellt. Die Reagenzien, die für eine einzelne Reaktion zur Bewertung der Effizienz und genexpression verwendet werden, sind in Tabelle 2 dargestellt.- Geben Sie die Master-Mischung einer einzelnen Reaktion (9 l) an jeden Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte und fügen Sie jeder Reaktion 1 l cDNA hinzu. Führen Sie Tests für jede Probe in Triplicaten durch.
- Schließen Sie die PCR-Platte mit Dichtöl und Zentrifuge bei 877 x g für 10 min bei 4 °C.
- Führen Sie RT-qPCR mit einem Präzisions-Thermocycler mit folgendem Protokoll durch: 95 °C für 10 min, 45 Zyklen Der Amplifikation (95 °C für 10 s, Glühen für 30 s, cDNA-Synthese) und 37 °C für 30 s.
HINWEIS: Für jede Grundierung sind spezifische Glühtemperaturen erforderlich. - Verwenden Sie GAPDH zusammen mit den Zielgenen, um die Effizienz zu bestätigen.
- Verwenden Sie die mitgelieferte Software, um die Effizienz jedes Gens zu berechnen.
- Normalisieren Sie die Zyklusschwellenwerte (CT) auf die Expression des Referenzgens GAPDH, und verwenden Sie die Methode "CT" für die Quantifizierung.
- RNA-Isolierung
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Representative Results
Die Kontaktfläche und der Kontaktdruck müssen mit einem Druckmessfilm bestätigt werden (Abbildung 1). Physiologische Belastungsbedingungen können durch Vergleich mit Referenzaufdrucken für definierte Kontaktdrücke bestätigt werden. Während der Prüfung wird der Reibungskoeffizient ständig überwacht. Bei einer wandernden Kontaktfläche kann ein niedriger Reibungskoeffizient für mindestens 1 h aufrechterhalten werden (Abbildung 2). Mit Safranin O Färbung kann die extrazelluläre MatrixZusammensetzung und -struktur bestimmt werden (Abbildung 3). Die Intensität der Safranin O Färbung ist proportional zum Proteoglykangehalt. Fast Green kontrastiert die nicht-kollagenen Stellen und stellt einen klaren Kontrast zur Safranin O Färbung. Der Proteoglykangehalt variiert über die Gelenkoberfläche, sollte aber im gesamten Gewebeabschnitt in Ausgangsproben einheitlich sein (Abbildung 3A). In die Prüflösung eingetauchte Kontrollproben zeigen die Extraktion von GAGs, denen durch mechanische Belastung entgegengewirkt werden kann (Abbildung 3B, 3C). Die metabolische Aktivität der Rindergelenkchondrozyten ist unabhängig von der Erntestelle, zeigt aber eine Zunahme mit mechanischer Belastung im Vergleich zu unbelasteten Kontrollen (Abbildung 4). Die Genexpressionsniveaus von Knorpel-spezifischen Genen (COL2A1, ACAN) nehmen mit physiologischen Belastungsbedingungen zu, während katabole Gene (COL1A1 und MMP13) mit stationärer Kontaktfläche hochreguliert werden (Abbildung 5).
| Volumen (l) | |
| Transkriptor RT Reactions Buffer 5x conc. | 6 |
| Protektor RNase-Inhibitor 40U/l | 0.75 |
| Deoxynukleotid Mix je 10 mM | 3 |
| Zufälliger Hexamer Primer 600 | 3 |
| Transkriptor Reverse Transcriptase 20 U/l | 0.75 |
| MS2-RNA (0,8 g/l) | 0.375 |
| Nukleasefreies destilliertes Wasser | 0.125 |
| Gesamtvolumen | 14 |
Tabelle 1: Reagenzien für eine einzige Reaktion zur cDNA-Synthese.
| Volumen (l) | |
| FastStart Probe Master 2X | 5 |
| Hydrolysesonde 2,5 m | 1 |
| Linker PrimerGAPDH 5 m | |
| Rechte Grundierung GAPDH 5 | |
| Nukleasefreies destilliertes Wasser | 3 |
| Gesamtmaster-Mix | 9 |
Tabelle 2: Reagenzien für den Master Mix für eine einzige PCR.
Abbildung 1: P-Ressure-Messung der Anfangskontaktfläche an der Metall-Knorpel-Schnittstelle vor der Prüfung. Aufgrund der Konvexität des Metallzylinders und der Gelenkoberfläche und ihrer elastischen Eigenschaften ist die anfangse Kontaktfläche elliptisch. Während des Gleitens bewegt sich diese anfängliche Kontaktfläche mit einem Hub von 2 mm, was zu einer größeren Fläche führt, die mechanischer Belastung ausgesetzt ist; Skalenbalken = 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zeitabhängiger Reibungskoeffizient (Dauer 1 Stunde) für sieben Proben, die mit 8 mm/s Gleitgeschwindigkeit und 1 N Last (2 MPa-Kontaktdruck) getestet wurden. Jede farbige Linie stellt den COF eines Osteochonderzylinders dar. Die beobachtete Variabilität liegt innerhalb der Grenzen für biologische Proben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Histologische Querschnitte von Osteochondralproben von Rindern, die mit Safranin-O und Fast Green gefärbt sind. (A) Basismuster zeigen einen hohen GAG-Gehalt im gesamten Gelenkknorpel. (B) Kontrollprobe in Prüflösung ohne mechanische Belastung getaucht zeigen weniger Safranin-O Färbung in der mittleren Zone, Hinweis auf eine Extraktion von Proteoglykanen. (C) Geprüfte Proben weisen einen höheren GAG-Gehalt im Vergleich zu Kontrollen auf, was auf eine mechanische Stimulation hinweist; maßstabsleiste = 250 'm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Metabolische Aktivität von Rindergelenkchondrozyten nach tribologischen Tests mit unterschiedlichen Belastungsvariationen und Kontrollen. Die horizontale gepunktete Linie stellt Basisebenen dar. Der nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test wurde für den Vergleich zwischen Testgruppen durchgeführt, gefolgt von Dunns Post-hoc-Test im Falle einer Signifikanz. *p < 0,05. Diese Zahl wurde von Stotter et al.18geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Genexpression knorpelspezifischer Gene nach tribologischen Tests mit unterschiedlichen Belastungsbedingungen und Kontrollen. COL2A1=Kollagen Typ 2; ACAN=aggrecan; COL1A1= Kollagen Typ 1; MMP13= Matrix-Metalloproteinase 13. Die Expressionswerte wurden auf das Haushaltsgen GAPDH (Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase) normalisiert. Die horizontalen gepunkteten Linien stellen Basisausdrucksebenen dar. Der nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test wurde für den Vergleich zwischen Testgruppen durchgeführt, gefolgt von Dunns Post-hoc-Test im Falle einer Signifikanz. *p < 0,05. Diese Zahl wurde von Stotter et al.18geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Fokale metallische Implantate stellen ein Bergungsverfahren für Osteochonderdefekte dar, insbesondere bei Patienten mittleren Alters und nach fehlgeschlagener Primärbehandlung. Obwohl klinische Studien vielversprechende kurzfristige Ergebnisse zeigten, ist eine beobachtete Komplikation eine Schädigung des gegnerischen, nativen Knorpels10. Kadaver und biomechanische Studien zeigen eindeutige Beweise dafür, dass eine richtige Implantation mit flacher oder leicht versenkter Positionierung den natürlichen Kontaktdruck aufrechterhält19. Tribologische Experimente bieten die Möglichkeit, verschiedene Knorpelpaarungen in vitro zu testen. Bei solchen können Ladebedingungen, Schmierung, Materialpaarungen und Dauer beliebig eingestellt werden.
Rinderknorpel ist in großer Stückzahl im örtlichen Schlachthof erhältlich. Die Zelllichkeit und die zonale Struktur sind den menschlichen Femoralkondylen sehr ähnlich20. Der Proteoglykangehalt ist jedoch standortspezifisch, während sich die Genexpressionsniveaus über der Gelenkoberfläche als einheitlich erwiesen haben. In diesem Protokoll wurden Osteochondralstecker aus dem Gewicht tragenden Bereich geerntet. Knorpeldicke, Kollagenarchitektur und daraus resultierende tribologische Eigenschaften zeigen regionale Unterschiede über die Gelenkoberfläche16. Die Einschränkung der Verwendung von Osteochondralsteckern in einem unbeschränkten Ladeaufbau mit einem gestörten Kollagennetz und veränderter Flüssigkeitsdruck im Vergleich zu ganzen Gelenkmodellen muss berücksichtigt werden.
In den meisten tribologischen Studien wird PBS allein als Testlösung verwendet, um robustere Daten zu generieren. PBS ist eine Pufferlösung mit isotonischer Osmolarität und hilft, bei biologischen Experimenten einen konstanten pH-Wert aufrechtzuerhalten. Die Verwendung von PBS mit Hyaluronsäure sorgt für Grenzschmierung und reduzierte Reibung21. Dementsprechend reduziert Synovialflüssigkeit den Reibungskoeffizienten und verbessert die Flüssigkeitsdruckbildung im Vergleich zu Saline22. Der Reibungskoeffizient hängt von verschiedenen Systemeigenschaften ab, wie die klassische Stribeck-Kurve zeigt. Die Stribeck-Kurve bezieht den Reibungskoeffizienten und die Viskosität, Geschwindigkeit und Last und stellt die grundlegenden Schmiersysteme dar: Grenz-, Misch- und hydrodynamische Schmierung. Die Grenzschmierung kann mit PBS allein als Schmierflüssigkeit erhalten werden, aber die Belastungsparameter müssten entsprechend angepasst werden. Der aus den Tests gelieferte COF sind Durchschnittswerte über den Strich. Somit kann davon ausgegangen werden, dass während des Zyklus unterschiedliche Schmierbedingungen auftreten. Während des Stillstands an der Umkehrposition können Randbedingungen vorherrschen, während gemischte Schmierung während des Gleitens vorherrschen kann. Basierend auf der absoluten Dauer während des Gleitzyklus hätte dieser mehr Einfluss auf den mittleren COF-Wert gehabt.
Um physiologische Bedingungen in Gelenken bei täglichen Aktivitäten zu untersuchen, können die Belastungsbedingungen in der Tribometer-Software entsprechend angepasst werden. Druckempfindliche Messungen sollten verwendet werden, um die gewünschten Kontaktdrücke zu bestätigen. Die gemeldeten femorotibialen Kontaktdrücke liegen zwischen 1 MPa im Stehen und bis zu 10 MPa während des Abfahrtslaufs23. Bei einer fokalen Wiederbelebung sind die Implantatdrücke im Vergleich zu gesunden Gelenken nur geringfügig erhöht24. Die gemeldeten relativen Gleitgeschwindigkeiten während des Gangzyklus werden bis zu 100 mm/s mit hohen Schwankungen während der verschiedenen Phasen gemeldet. Dies bedeutet, dass relative Gelenkbewegungen die Geschwindigkeiten überschreiten, die in diesem tribologischen Setup angewendet werden können. Um natürliche kinematische Bedingungen und Kontaktdrücke in gesunden Kniegelenken nachzuahmen, liegen die Belastungsbedingungen zwischen 1 und 10 MPa Kontaktdruck und 5 bis 100 mm/s Gleitgeschwindigkeit. Während in diesem Versuchsaufbau hohe Lasten angewendet werden können, ist der Bereich der Gleitgeschwindigkeiten begrenzt. Pathologische Belastungsbedingungen, sowohl Überlastung als auch unzureichende Belastungen, können ebenfalls simuliert werden. Niedrige Gleitgeschwindigkeiten oder statische Belastung setzen immobilisierend dar, während höhere Belastungen eine nichtphysiologische mechanische Stimulation darstellen.
Da die enzymatische Verdauung die Expression knorpelspezifischer Gene beeinflussen kann, wird in diesem Protokoll eine nichtenzymatische Gewebehomogenisierung beschrieben. Während der cDNA-Synthese wird zusätzlich zu den Anweisungen RNA aus Bakteriophage MS2 zu Stabilisierungszwecken hinzugefügt. Genexpressionsniveaus, aber keine Proteine, wurden analysiert, um frühe Veränderungen in der biosynthetischen Aktivität von Gelenkchondrozyten zu erkennen. Neben histologischen Abschnitten und metabolischer Aktivität bieten diese Assays umfassende Informationen über die Auswirkungen der mechanischen Belastung auf den Gelenkknorpel.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. gefördert. und die Landesregierung Niederösterreichs durch die Life Science Calls (Projekt-ID: LSC15-019) und das österreichische COMET-Programm (Projekt K2 XTribology, Grant-Nr. 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
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