Summary
该协议描述了骨质体油柱在金属植入物材料上滑动的制备、生物摩擦测试和分析。该协议中包含的结果指标是代谢活性、基因表达和组织学。
Abstract
中年患者的骨质疏松缺陷可能用焦点金属植入物进行治疗。首先开发为膝关节的缺陷，植入物现在可用于肩部，臀部，脚踝和第一个骨质性关节。在提供疼痛减轻和临床改善的同时，许多患者观察到对立软骨的渐进性退行性变化。导致这种损害的机制尚未完全了解。该协议描述了一个摩擦实验，以模拟软骨上的金属配对和关节软骨的综合分析。金属植入物材料测试牛骨柱作为人体关节软骨的模型。通过应用不同的负载和滑动速度，可以模拟生理载荷条件。为了全面分析关节软骨的影响，本协议描述了组织学、代谢活性和基因表达分析。摩擦学测试的主要优点是，可以自由调节载荷参数，以模拟体内条件。此外，不同的测试解决方案可用于研究润滑或亲炎剂的影响。通过使用软骨特异性基因和猫科动物基因的基因表达分析，可以检测到关节软骨细胞代谢的早期变化，以回应机械负荷。
Introduction
骨质疏松缺陷的治疗要求很高，在许多情况下需要手术。对于中年患者的聚焦骨质病变，焦点金属植入物是一个可行的选择，尤其是在原发治疗失败之后，如骨髓刺激（BMS）或自体软骨细胞植入（ACI）1。部分表面置换可视为挽救程序，可减轻疼痛，改善运动范围2。这些植入物通常由CoCrMo合金组成，具有不同的尺寸和偏移配置，以匹配正常的解剖结构3。虽然最初开发为膝盖的内侧股骨孔的缺陷，这种植入物现在可用，并用于臀部，脚踝，肩膀和肘部4，5，6。为了获得满意的结果，评估相对软骨的机械关节对齐和状况至关重要。此外，正确的植入没有突起植入物已被证明是基本的7。
临床研究显示，在减少疼痛及改善中年病人功能方面，有优良的短期效果。与同体植入相比，焦金属植入物允许早期承重。然而，对立的关节软骨显示加速磨损在相当多的病人9，10。因此，即使放置适当，在许多情况下，原生软骨的退化似乎也不可避免，而基本机制仍然不清楚。类似的退行性变化已经观察到后，双相体体成形术的臀部11和增加与活动和加载12。
摩擦实验提供了在体外研究这种配对和模拟生理条件下发生的不同载荷情况的可能性。骨质针的使用提供了一个简单的几何模型，以研究关节软骨滑对原生软骨或任何植入材料14的摩擦学， 并可以进一步用于整个关节模拟模型15。软骨上的金属配对显示软骨磨损加速，细胞外基质中断，和减少细胞生存能力在表面区域相比软骨对软骨配对16。软骨的损伤主要发生在浅层和中间区域17之间的分层形式。然而，导致软骨退化的机制尚未完全了解。该协议对关节软骨的生物合成活性进行了综合分析。通过确定代谢活性和代谢基因的基因表达水平，可以确定软骨分解的早期适应症。体外摩擦学实验的优点是可以调整载荷参数以模拟各种载荷条件。
因此，以下协议适合模拟软骨上的金属配对，代表实验性半人成形模型。
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Protocol
1. 金属钢瓶的准备
- 分析圆柱形钴-铬-硅（CoCrMo）棒，使用扫描电子显微镜（SEM）和每个制造商的协议能量分散X射线光谱，以确认所提供的值，符合手术植入物的化学成分标准规范。
注：用于此实验的CoCrMo合金元素成分为65%Co、28%Cr、5%Mo和2%其他。 - 用碳化硅研磨纸湿磨样品，从粒度为 500 开始。使用研磨纸，增加顺序高达 4000 的颗粒大小。
- 用 3 μm 和 1 μm 糊进行抛光，以达到金属手术植入物表面光洁度要求的公差水平 （ISO 5832-12：2019） 和完全和部分关节置换植入物 （ISO 21534：2007） 的表面粗糙度。
注：平均表面粗糙度使用共和显微镜确定。 - 将 CoCrMo 杆 （± 6 mm） 切割到长度为 10 mm 的气缸中。
2. 骨质松缸的收获
- 使用牛窒息关节从骨骼成熟的动物（年龄在18-24个月牺牲时），并保持他们包含和冷却，直到解剖在牺牲后24小时内。
注：从当地屠夫处购买关节。关节保持关闭，直到解剖。 - 在无菌条件下收获圆柱形骨质疏松塞，对膝盖进行消毒并进行关节切除术，并露出中叶股。
注：必须小心解剖，不要损坏关节表面。 - 检查关节表面有大体损伤。
注：如果软骨缺乏白色、光滑和光泽的外观，或者有起泡、裂缝或更大的缺陷，请丢弃样品。 - 将切削管垂直于承重区域的关节表面，用锤子用铁锤将设备驱动到软骨和亚骨骨中。在 15 mm 穿透深度下，突然运动顺时针旋转设备。
- 卸下设备，插入白色旋钮并拧入，直到骨质疏松塞的底端可见。
- 用无菌标记标记样品的后向，以便在测试过程中相应地排列骨质松柱。
注：三维胶原蛋白网络及其复杂的结构有利于关节软骨的独特机械性能，应从样品的方向考虑。 - 用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗样品，以洗掉血液和脂肪组织。
- 重复上述步骤以收获所需的骨质松塞数量（直径 8 mm，长度 15 mm）。
注：通常，9 至 12 个骨质松体油缸可以从中心股骨康德尔的承重区域收获。 - 将样品放在Dulbecco的改良鹰的介质中，含有10%的胎儿牛血清，辅以抗生素（青霉素200 U/mL;链霉素0.2mg/mL）和安培霉素B 2.5微克/mL，并在4°C储存，直到测试保持活力。
- 收获后立即分析控制骨质疏松塞以建立基线值（参见分析部分）。
3. 摩擦学测试
- 使用市售的往复式摩擦仪进行实验，并采用板筒配置。设备的要求是垂直加载和可调负载和滑动速度。此外，液体电池能够执行润滑溶液中的测试。
- 使用压力测量膜确定 CoCrMo 上软骨系统中的接触压力。将压力测量膜放在接口处，并施加 30 s 的静态负载，以确定初始接触压力、接触尺寸和形状。由于金属圆柱体和关节软骨的凸度，初始接触区域在此配置中具有椭圆形形状。
注：压力测量膜对施加的压力做出反应，显示达到或超过阈值压力的区域的红色变色。对于 1 N 的负载，通过与定义的接触压力进行可视化比较，确定接触压力在 2 MPa 左右。 - 用与滑动方向对齐的标记固定底部样品支架上的骨质松缸，然后将 CoCrMo 油缸安装到上部称重传感器上。
- 将测试溶液（PBS，带3克/L透明质酸）加入液体电池，导致骨质松体油缸淹没并覆盖金属软骨滑动界面。
- 设置测试参数（规定的正常力、冲程和滑动速度），然后在整个测试中应用和维护这些参数。
注：必须根据接触区域设置往复运动的冲程长度，以创建迁移接触区域 （MCA）。对于直径为 8 mm 的插头，2 mm 冲程允许软骨充分补液。 - 使用设定的装载参数，对浸入润滑溶液中的关节软骨开始 CoCrMo 气缸的对等滑动。
- 在实验过程中监控摩擦系数 （COF）。
注：COF是自动评估的，但可以使用μ+F/W（μ系数）计算;F - 摩擦力;W - 系统应用的正常负载）。 - 在所需的测试期后终止实验。
- 从样品架上取下骨质疏松塞，用 PBS 冲洗，并将其储存在介质中，直到进一步进行生物分析（见下文）。
- 在测试期间，在室温下将控制样品淹没在测试溶液中，并结合暴露于机械负载的样品进行分析。
4. 分析
注：对骨质疏松体进行代谢活性和基因表达分析，以研究生物活性;组织学是研究软骨表面的完整性和基础矩阵。
- 组织学
- 对于组织学分析，将骨质疏松塞浸入室温下4%缓冲甲醛溶液中，直至进一步处理。
- 用 PBS 冲洗样品，然后放入塑料容器中。
- 添加多余的即用式分体解，以便覆盖所有样本。
- 应用持续搅拌 4 周，以完成脱钙。
- 去钙化后，将样品嵌入水溶性乙二醇和树脂中，并将其储存在+80°C。
- 通过截流横向到接触区域获得 6 μm 部分。
- 随后，使用制造商的协议为萨夫拉宁 O 染色和 Fastgreen 反染色准备样品。
- 使用显微镜和图像处理软件捕获组织学图像。
- 代谢活性
注：通过基于XTT的外体毒理学测定，对关节软骨中软骨细胞的代谢活性进行了调查。- 使用 PBS 冲洗骨质疏松塞，将样品放在培养皿中。
- 将 24 井板放在刻度上，将刻度归零。
- 用手术刀在一块骨质移植物上切掉软骨。
- 将软骨分两部分，使接触区域均匀地分布在软骨和肉末和1 mm3件之间。后半部分用于基因表达分析。
- 将切碎的软骨转移到准备好的24井板的一个井中，并确定组织重量。
- 对每个样品重复上述步骤，并在板的每个井中加入 1 mL 的生长介质。
- 根据制造商的说明和混合物添加 XTT 溶液（490 μL 的 XTT 标签试剂和 10 μL 的活化试剂）。
- 在37°C和5%CO2下孵育 板4小时。
- 孵育后，取出上经液并将其转移到5 mL管中。
- 通过将0.5 mL二甲基硫化物（DMSO）加入24井板的软骨组织，在室温下连续搅拌1小时，提取四分之一硫化物。
- 卸下 DMSO 解决方案并将其与以前收集的 XTT 解决方案进行池中。
- 在板读卡器上的 96 井板中，将样品的三分之一酸酯中 100 μL 转移，并在 492 nm 的波长和 690 nm 的参考波长下测量吸光度。
- 将生成的吸光度值与每个样品的湿重标准化，并使用软件执行分析。
- 基因表达分析
- RNA分离
注：RNA隔离使用商业套件（材料表）根据制造商提供的指示进行，并作出小修改。- 从骨质疏松中分得的软骨组织的后半部分被切成小块。
- 将它们转移到含有陶瓷珠和300μL的乳西斯缓冲液管（含有1%β-甲醇）。
注：样品可冷冻在液氮中，直至进一步处理。 - 解冻样品2分钟，并使用商业莱瑟组织均质化。每次运行后（使用商用 Lyser 冷却装置在 4°C 下），在 2 分钟冷却阶段（均质步骤）中应用 6500 rpm 四次（均质步骤），以完全扰乱组织。
- 将20 μL的蛋白酶K和580μL的无RNase水加入到每个管中，并在55°C下孵育30分钟。
- 将样品在 10，000 x g 下离心 3 分钟 ，然后将上看液转移到 1.5 mL 管中。
- 将0.5卷90%乙醇加入每个管中并混合。
- 将样品的700μL转移到放置在2 mL收集管中的RNA结合柱上，以8，000 x g 的离心机放置15 s。
- 丢弃流经，重复离心步骤，实现完整 lysate。
- 将 350 μL 的缓冲 RW1 添加到柱子中，以 8，000 x g 的离心机 15 s 进行离心机，然后丢弃流经。
- 混合 10 μL 的 DNase 库存溶液和 70 μL 的缓冲液 RDD。将溶液加入RNA纯化膜，并在室温下孵育15分钟。
- 将 350 μL 的缓冲 RW1 添加到柱中，以 8，000 x g 的离心机进行 15 s。丢弃流式。
- 加入 500 μL 的缓冲 RPE，以 8，000 x g 的离心机 15 s。丢弃流式。
- 将 500 μL 缓冲 RPE 加入 RNA 纯化柱，以 8，000 x g 的离心机进行 2 分钟。
- 将柱放在 1.5 mL 收集管中，并加入 30 μL 无 RNase 水。在 8，000 x g 下离心 1 分钟。
- 将分离的RNA储存在-80°C，直到cDNA合成。
- cDNA 合成
注：为了从信使RNA（mRNA）合成互补DNA（cDNA），使用了商业试剂盒（材料表）。在cDNA合成过程中，添加了来自噬菌体MS2的RNA，以稳定分离的RNA。- 解冻并混合试剂。单个反应的组成显示在表 1中。
- 将16μLRNA样品加入体积，进行单次反应（14μL）。
- 使用以下参数在热循环器中执行 cDNA 合成：25 °C（底片退火时为 10 分钟），50°C（DNA 合成时为 60 分钟），85 °C（变性）下为 5 分钟，在 20°C（冷却阶段）下为 5 分钟。
- 将 cDNA 储存在-20°C，直到实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。
- Rt - qpcr
注：对于牛样本的RT-qPCR，底的是底图和探针，使用商业实时qPCR软件（例如， IDT）用于基因GAPDH（甘油醛3-磷酸脱氢酶）、COL2A1（胶原蛋白2）、ACAN（阿格雷康）、COL1A1（1型胶原蛋白）、MMP-1（基质金属蛋白酶-1）和MMP-13（基质金属蛋白酶-13）。IDT 提供牛底和双淬火探头。用于单个反应以评估效率和基因表达的试剂显示在表2中。- 将单个反应（9 μL）的主混合物分配到96井PCR板的每个井中，并在每个反应中加入1 μL的cDNA。对三脚架中的每个样本执行测试。
- 使用密封油关闭 PCR 板，并在 4 °C 下以 877 x g 关闭离心机 10 分钟。
- 使用具有以下协议的精密热循环器执行RT-qPCR：95 °C 10分钟，45个放大周期（95°C，10秒，退火30秒，cDNA合成），37°C，30秒。
注：每个底片需要特定的退火温度。 - 使用GAPDH与目标基因确认效率。
- 使用提供的软件计算每个基因的效率。
- 将周期阈值 （CT） 值规范化为参考基因 GAPDH 的表达，并使用 +CT 方法进行定量。
- RNA分离
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Representative Results
必须使用压力测量膜确认接触区域和接触压力（图1）。生理载荷条件可以通过与所定义的接触压力的参考印迹进行比较来确认。在测试过程中，摩擦系数不断被监测。对于迁移接触区，低摩擦系数可保持至少 1 小时（图 2）。使用萨夫兰宁O染色的细胞外基质组成和结构可以确定（图3）。萨夫拉宁 O 染色的强度与蛋白细胞素含量成正比。快速绿色计数器非胶原点，并提供一个明确的对比萨夫拉宁 O 染色。在关节表面，蛋白质蛋白细胞含量变化，但应在整个基线样本中整个组织部分均匀（图3A）。浸在测试溶液中的控制样品显示GAG的提取，可以通过机械载荷抵消（图3B，3C）。牛关节软骨细胞的代谢活性与收获地点无关，但与卸载控制装置相比，机械载荷增加（图4）。软骨特异性基因（COL2A1，ACAN）的基因表达水平随着生理负荷条件而增加，而代谢基因（COL1A1和MMP13）则与固定接触区一起调节（图5）。
| 体积 （μl） | |
| 抄本器 RT 反应缓冲器 5x 凹凸。 | 6 |
| 保护器 RNase 抑制剂 40U/μl | 0.75 |
| 脱氧核苷酸混合 10 mM 每个 | 3 |
| 随机六角体底膜 600 μM | 3 |
| 转录器逆转录酶 20 U/μl | 0.75 |
| MS2 RNA （0，8 μg/μl） | 0.375 |
| 无核酸蒸馏水 | 0.125 |
| 总体积 | 14 |
表1：用于cDNA合成的单一反应试剂。
| 体积 （μl） | |
| 快速启动探头母版 2X | 5 |
| 水解探头 2，5 μM | 1 |
| 左底木 5 μM | |
| 右底图 GAPDH 5 μM | |
| 无核酸蒸馏水 | 3 |
| 总主混合 | 9 |
表 2：单个 PCR 的主混合试剂。
图1： 测试前对金属软骨界面上初始接触区域进行P再测量。 由于金属圆柱体和关节表面的凸度及其弹性特性，初始接触区域为椭圆形。在滑动过程中，此初始接触区域以 2 mm 的冲程移动，导致更大的区域暴露在机械负载中;比例线 = 2 毫米 。请单击此处查看此图的较大版本。
图 2：以 8 mm/s 滑动速度和 1 N 负载（2 MPa 接触压力）测试的 7 个样品的摩擦系数（持续时间 1 小时）的时间依赖系数。 每条彩色线表示一个骨质圆柱体的 COF。观察到的变异性在生物样品的限度内。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：与萨夫拉宁-O和快绿染色的牛骨粒体样本的组理学横截面。 （A） 基线样本显示整个关节软骨的GAG含量很高。（B） 在测试溶液中浸没的控制样品，无需机械载荷，显示中间区域的萨夫兰宁-O染色较少，表明蛋白细胞的提取。（C） 测试样本与控制装置相比，显示较高的GAG含量，表示机械刺激;比例线 = 250 μm 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：牛关节软骨细胞的代谢活性，经过摩擦学测试，具有不同的载荷变化和控制。 水平虚线表示基线水平。非参数的 Kruskal-Wallis 测试用于测试组之间的比较，然后是 Dunn 的后期测试，以防显著性。*p < 0.05。这个数字已经修改了从斯托特等人18。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：不同负荷条件和对联的摩擦学测试后软骨特异性基因的基因表达。 COL2A1=胶原蛋白类型2;阿卡纳格雷坎;COL1A11= 胶原蛋白类型1;MMP13+ 基质金属蛋白酶 13.表达水平被规范化到家政基因GAPDH（甘油醛3-磷酸盐脱氢酶）。水平虚线表示基线表达式级别。非参数的 Kruskal-Wallis 测试用于测试组之间的比较，然后是 Dunn 的后期测试，以防显著性。*p < 0.05。这个数字已经修改了从斯托特等人18。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
聚焦金属植入物是骨质疏松缺陷的抢救程序，特别是在中年患者和初级治疗失败后。虽然临床研究表明有希望的短期结果，一个观察到的并发症是损害对立的，本地软骨10。尸体和生物力学研究表明，适当的植入与平坦或轻微凹陷定位保持自然接触压力19。摩擦实验提供了在体外测试各种软骨配对的可能性。在这种情况下，装载条件、润滑、材料配对和持续时间可能会根据需要进行调整。
牛软骨在当地屠宰场有大量可用。细胞性和区域结构与人类股骨20非常相似。然而，蛋白质蛋白细胞含量是站点特异性的，而基因表达水平已被证明是均匀的关节表面。在此协议中，从承重区采集骨质疏松塞。软骨厚度、胶原体结构以及由此产生的摩擦特性显示了关节表面16的区域差异。与整个关节模型相比，在非精炼加载设置中使用骨质质塞和改变流体加压的限制需要考虑。
在大多数摩擦学研究中，PBS 仅用作测试解决方案，以生成更健壮的数据。PBS 是一种具有同位素渗透性的缓冲液，有助于在生物实验中保持恒定的 pH 值。将PBS与透明质酸一起使用，可提供边界润滑和减少摩擦21。因此，与盐水22相比，突触流体降低了摩擦系数，提高了流体加压。摩擦系数取决于各种系统属性，经典斯特里贝克曲线证明了这一点。Stribeck 曲线涉及摩擦系数和粘度、速度和负载，并介绍了基本润滑方案：边界、混合和流体动力润滑。边界润滑仅可作为润滑液使用 PBS 获得，但负载参数需要相应调整。从测试中交付的 COF 是冲程的平均值。因此，可以假定在循环期间出现不同的润滑条件。在反转位置处静止期间，边界条件可能很普遍，而混合润滑在滑动过程中可能占主导地位。根据滑动周期内的绝对持续时间，后者对平均COF值的影响会越来越大。
为了调查日常活动过程中关节的生理状况，可以在摩擦计软件中相应地调整装载条件。应使用压力敏感测量来确认所需的接触压力。报告女性接触压力在站立期间为1MPa，下坡运行23期间为10MPa。与健康关节相比，与健康关节相比，植入物压力仅略有升高。在步态循环期间报告的相对滑动速度报告高达 100 mm/s，不同阶段变化很大。这意味着相对关节运动超过可在此摩擦学设置中应用的速度。为了模拟健康膝关节中的自然运动条件和接触压力，装载条件范围为 1 至 10 MPa 接触压力和 5 至 100 mm/s 滑动速度。然而，虽然高负载可以应用于这个实验设置，滑动速度的范围是有限的。也可以模拟病理载荷条件，包括过载和负载不足。低滑动速度或静态载荷等同于固定，而较高的负载表示非生理机械刺激。
由于酶消化会影响软骨特异性基因的表达，本协议描述了非酶组织同质化。在cDNA合成过程中，除了说明外，还添加了来自噬菌体MS2的RNA，用于稳定目的。对基因表达水平（而不是蛋白质）进行了分析，以检测关节软骨细胞生物合成活性的早期变化。除了组织学部分和代谢活动，这些分析提供了机械负荷对关节软骨的影响的综合信息。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
这项研究由Né Forschungs-und Bildungsges.m.b.H.和下奥地利省政府通过生命科学电话（项目ID：LSC15-019）和奥地利彗星方案（项目K2 XTribology，第849109号赠款）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
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