Summary
Denne protokol beskriver forberedelse, biotribologisk testning og analyse af osteochondralcylindre, der glider mod metalimplantatmateriale. Resultatforanstaltninger, der indgår i denne protokol, er metabolisk aktivitet, genekspression og histologi.
Abstract
Osteochondraldefekter hos midaldrende patienter kan behandles med fokale metalliske implantater. Først udviklet til defekter i knæleddet, implantater er nu tilgængelige for skulder, hofte, ankel og den første metatarsalphalangeal fælles. Samtidig med at smertereduktion og klinisk forbedring, progressive degenerative ændringer af den modsatte brusk er observeret hos mange patienter. De mekanismer, der fører til denne skade, er ikke fuldt forstået. Denne protokol beskriver et tribologisk eksperiment for at simulere en metal-on-brusk parring og omfattende analyse af ledbrusk. Metalimplantatmateriale testes mod kvæg osteochondralcylindre som model for menneskelig ledbrusk. Ved at anvende forskellige belastninger og glidende hastigheder, kan fysiologiske belastningsforhold efterlignes. For at give en omfattende analyse af virkningerne på ledbrusk, histologi, metabolisk aktivitet og genekspressionsanalyse er beskrevet i denne protokol. Den største fordel ved tribologisk test er, at belastningsparametre frit kan justeres for at simulere under vivo-forhold. Desuden kan der anvendes forskellige testløsninger til at undersøge smørings- eller proinflammatoriske midlers indflydelse. Ved at bruge genekspressionsanalyse til bruskspecifikke gener og kataboliske gener kan der påvises tidlige ændringer i metabolismen af artikulære chondrocytter som reaktion på mekanisk belastning.
Introduction
Behandlingen af osteochondraldefekter er krævende og kræver operation i mange tilfælde. For fokale osteokondrale læsioner hos midaldrende patienter er fokale metalliske implantater en farbar vej, især efter den manglende primærbehandling, som knoglemarvsstimulation (BMS) eller autolog chondrocytimplantatation (ACI)1. Delvis overflade udskiftninger kan betragtes bjærgning procedurer, der kan reducere smerter og forbedre vifte af bevægelse2. Disse implantater er typisk sammensat af en CoCrMo legering og fås i forskellige størrelser og offset konfigurationer til at matche den normale anatomi3. Mens oprindeligt udviklet til fejl på den mediale femorale condyle i knæet, sådanne implantater er nu tilgængelige og i brug for hofte, ankel, skulder, og albue4,5,6. For at opnå et tilfredsstillende resultat er det afgørende at vurdere den mekaniske fællesjustering og tilstanden af den modsatte brusk. Desuden har korrekt implantation uden fremspring af implantatet vist sig at være grundlæggende7.
Kliniske undersøgelser viste fremragende kortsigtede resultater med hensyn til smertereduktion og forbedring af funktionen hos midaldrende patienter for forskelligesteder 5,6,8. Sammenlignet med allograft implantation tillader fokalmeimplantater tidligt vægtbærende. Den modsatte ledbruse viste imidlertid accelereret slid hos et betydeligt antal patienter9,10. Derfor, selv med korrekt placering, i mange tilfælde degeneration af den indfødte brusk synes uundgåelig, mens de underliggende mekanismer fortsat uklart. Lignende degenerative ændringer er blevet observeret efter bipolar hemiarthroplasty afhoften 11 og øges med aktivitet og belastning12.
Tribologiske forsøg giver mulighed for at studere sådanne bindinger in vitro og simulere forskellige belastningssituationer, der opstår under fysiologiskeforhold 13. Brugen af osteochondralstifter giver en enkel geometrimodel til at undersøge tribologien af ledbrusk, der glider mod indbygget brusk ellerimplantatmateriale 14 og kan yderligere anvendes i hele fælles simuleringsmodeller15. Metal-on-brusk bindinger viser accelereret brusk slid, ekstracellulære matrix forstyrrelser, og nedsat celle levedygtighed i den overfladiske zone sammenlignet med en brusk-on-brusk parring16. Skader på brusk opstod hovedsagelig i form af delaminering mellem de overfladiske og midterste zoner17. Men de mekanismer, der fører til brusk degeneration er ikke fuldt forstået. Denne protokol giver en omfattende analyse af den biosyntetiske aktivitet af ledbrusk. Ved bestemmelse af metabolisk aktivitet og genekspressionsniveauer af kataboliske gener kan der identificeres tidlige indikationer for brusksammenssnængning. Fordelen ved in vitro tribologiske eksperimenter er, at belastningsparametre kan justeres til at efterligne forskellige belastningsforhold.
Derfor er følgende protokol egnet til at simulere en metal-on-brusk parring, der repræsenterer en eksperimentel hemiarthroplasty model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af metalflasker
- Analysér cylindriske kobolt-chrom-molybdæn (CoCrMo) stænger opfylder standardspecifikationerne for kirurgiske implantater for deres kemiske sammensætning ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM) med energi dispersive x-ray spektroskopi pr producentens protokol for at bekræfte forudsat værdier.
BEMÆRK: Den elementære sammensætning af CoCrMo legering, der anvendes til dette eksperiment er 65% Co, 28% Cr, 5% Mo og 2% andre. - Våd male prøverne med silicium hårdmetal slibepapir startende med en kornstørrelse på 500. Brug slibepapir i stigende rækkefølge op til en kornstørrelse på 4000.
- Cylinderen poleres med 3 μm og 1 μm pasta for at opnå en overfladeryr, der ligger inden for kravene til overfladefinish for metalliskkirurgiske implantater (ISO 5832-12:2019) og total- og delvise udskiftningsimplantater (ISO 21534:2007).
BEMÆRK: Den gennemsnitlige overfladetyrlighed bestemmes ved hjælp af et konfokal mikroskop. - Skær CoCrMo stænger (Ø på 6 mm) til cylindre med en længde på 10 mm.
2. Høst af osteochondralcylindre
- Brug kvæg kvæle leddene fra skeletmodne dyr (i alderen 18-24 måneder på tidspunktet for ofringen) og hold dem indesluttet og afkølet, indtil dissektion inden for 24 timer efter ofret.
BEMÆRK: Samlinger købes hos den lokale slagter. Leddet forbliver lukket, indtil dissektionen. - At høste cylindriske osteochondral stik under aseptiske forhold, desinficere knæet og udføre en arthrotomy og udsætte den mediale femorale condyle.
BEMÆRK: Dissektionen skal udføres med forsigtighed for ikke at beskadige ledfladen. - Undersøg ledfladen for makroskopiske skader.
BEMÆRK: Kassér prøven, hvis brusken mangler det hvidlige, glatte og blanke udseende, eller hvis der er blærer, sprækker eller større defekter. - Skærrøret flugter vinkelret på den ledflade, der er på det vægtbærende område, og før anordningen føres ind i brusk og underknoben ved faste slag med en hammer. Ved 15 mm gennemtrængningsdybde vrides enheden med uret med en pludselig bevægelse.
- Tag enheden ud, sæt den hvide knap i, og skru den ind, indtil den nederste ende af osteochondralproppen er synlig.
- Præroposteriororientering af prøverne markeres med en steril markør for at arrangere osteochondralcylinderen i overensstemmelse hermed under prøvningen.
BEMÆRK: Det tredimensionale kollagennetværk og dets komplekse arkitektur letter de unikke mekaniske egenskaber ved ledbrusk og bør overvejes i retning af prøverne. - Prøven skylles med fosfat-bufferet saltvand (PBS) for at vaske blod og fedtvæv af.
- Gentag ovennævnte trin for at høste det ønskede antal osteochondralpropper (8 mm diameter, 15 mm længde).
BEMÆRK: Typisk kan 9 til 12 osteochondralcylindre høstes fra vægtbærende område på den mediale femorale kondyle. - Prøverne i Dulbeccos modificerede Ørnens medium indeholdende 10% føtalt kvægserum suppleret med antibiotika (penicillin 200 U/ml; streptomycin 0,2 mg/ml) og amphotericin B 2,5 μg/ml og opbevar dem ved 4 °C, indtil de testes for at opretholde levedygtigheden.
- Analysér kontrol osteochondralpropper umiddelbart efter høst for at fastslå baseline værdier (se analyseafsnit).
3. Tribologisk undersøgelse
- Udføre forsøgene ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt stempeltriabometer med en cylinder-på-plade konfiguration. Kravene til enheden er lodret belastning og justerbar belastning og glidehastighed. Desuden gør en flydende celle det muligt at udføre testene i en smørende opløsning.
- Bestem kontakttrykket i CoCrMo-on-brusksystemet ved hjælp af en trykmålingsfilm. Anvend trykmålingsfilmen ved grænsefladen, og anvend statisk belastning i 30 s for at bestemme det første kontakttryk, kontaktstørrelse og form. På grund af metalcylinderens konveksitet og ledbrusken har det oprindelige kontaktområde en elliptisk form i denne konfiguration.
BEMÆRK: Trykmålingsfilmen reagerer på det anvendte tryk, der viser rød misfarvning af zoner, hvor tærskeltrykket er nået eller overskredet. For 1 N belastning blev kontakttrykket bestemt omkring 2 MPa ved visuel sammenligning med definerede kontakttryk. - Fastgør osteochondralcylindrene på den nederste prøveholder med mærkningen justeret i forhold til glideretningen, og monter CoCrMo-cylindrene på den øverste vejecelle.
- Testopløsningen (PBS med 3 g/L hyaluronsyre) tilsættes i den flydende celle, som resulterer i nedsænkning af osteochondralcylinderen og dækker metalbruskskydegrænsefladen.
- Indstil testparametrene (foreskrevet normal kraft, slag og glidehastighed), som derefter påføres og vedligeholdes under hele prøvningen.
BEMÆRK: Slaglængden for stempelbevægelsen skal indstilles i henhold til kontaktområdet for at oprette et overtreringskontaktområde (MCA). For stik med en diameter på 8 mm giver en 2 mm streg tilstrækkelig rehydrering af brusken. - Start den gensidige glidende coCrMo-cylinder mod ledbrusken nedsænket i smøreopløsningen med de indstillede belastningsparametre.
- Overvåg friktionskoefficienten (COF) under forsøgene.
BEMÆRK: COF vurderes automatisk, men kan beregnes ved hjælp af ligningen μ=F/W (μ - friktionskoefficient; F - friktionskraft; W - normal belastning påført af systemet). - Afslut eksperimentet efter den ønskede testperiode.
- Fjern osteochondralproppen fra prøveholderen, skyl det med PBS, og opbevar det i medium indtil yderligere biologisk analyse (se nedenfor).
- Kontrollerprøverne nedsænkes i testopløsningen ved stuetemperatur under hele prøvningen, og der analyseres sammen med prøver, der har været udsat for mekanisk belastning.
4. Analyse
BEMÆRK: Osteochondral cylinder analyseres for metabolisk aktivitet og genekspression til at undersøge biologisk aktivitet; histologi udføres for at studere brusk overflade integritet og den underliggende matrix.
- Histologi
- For histologisk analyse, nedsænke osteochondral propper i 4% buffered formaldehyd opløsning ved stuetemperatur indtil videre behandling.
- Skyl prøverne med PBS og læg dem i en plastbeholder.
- Der tilsættes et overskud af den brugsklare afkalkningsopløsning, så alle prøver er dækket.
- Påfør konstant omrøring i 4 uger for fuldstændig afkalkning.
- Efter afkalkning integreres prøverne i vandopløselige glykoler og harpikser, og de opbevares ved −80 °C.
- Der opnås 6 μm sektioner ved kryosektion, der er tværgående i kontaktområdet.
- Derefter forberede prøverne til Safranin O farvning og Fastgreen kontrastaining ved hjælp af en producents protokol.
- Optag histologiske billeder ved hjælp af et mikroskop og proces ved hjælp af billedbehandlingssoftware.
- Metabolisk aktivitet
BEMÆRK: Den metaboliske aktivitet af chondrocytter i ledbrusk undersøges med en XTT-baseret ex vivo toksikologi assay.- Skyl osteochondralproppen med PBS, og ang prøven i en petriskål.
- Placer en 24-brønd plade på en skala og nul skalaen.
- Skær brusken af osteochondral graft med en skalpel i ét stykke.
- Bisect brusk i to lige store stykker, således at kontaktområdet er ligeligt fordelt på både brusk stykker og hakke den ene halvdel til 1 mm³ stykker. Den anden halvdel bruges til genekspressionsanalyse.
- Overfør hakket brusk i en brønd af den forberedte 24-brønd plade og bestemme vævsvægt.
- Gentag ovennævnte trin for hver prøve og tilsæt 1 ml vækstmedium til hver brønd af pladen.
- Der tilsættes XTT-opløsningen (490 μL XTT-mærkningsreage og 10 μL aktiveringsreages) i henhold til producentens anvisninger og blanding.
- Pladen inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 4 timer.
- Efter inkubation fjernes supernatanten og overføres til et 5 ml rør.
- Tetrazoliumproduktet udvindes ved at tilsætte 0,5 ml dimethylsulfoxid (DMSO) til bruskvævet i 24-brøndpladen og anvende kontinuerlig omrøring i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern DMSO-løsningen, og samm den sammen med den tidligere indsamlede XTT-løsning.
- 100 μL af prøven overføres i tre eksemplarer i en 96-brøndplade på en pladelæser, og absorbansen måles ved en bølgelængde på 492 nm og en referencebølgelængde ved 690 nm.
- Normalisere de resulterende absorbansværdier til den våde vægt af hver prøve og udføre analyse ved hjælp af software.
- Analyse af genekspression
- RNA-isolation
BEMÆRK: RNA-isolering udføres ved hjælp af et kommercielt sæt (materialetabel) i overensstemmelse med producentens anvisninger med små ændringer.- Hakke den anden halvdel af bruskvæv opnået fra osteochondral stikket i små stykker.
- De overføres til et rør, der indeholder keramiske perler, og 300 μL lysisbuffer (indeholdende 1 % β-mercaptoethanol).
BEMÆRK: Prøverne kan fryses i flydende nitrogen indtil videre forarbejdning. - Prøverne tøs op i 2 min. og anvendes den kommercielle lyser til homogenisering af vævet. Påfør 6500 omdrejninger i minuttet i 20 s (homogeniseringstrin) fire gange med en 2 minutters kølefase efter hvert løb (ved 4 °C ved hjælp af den kommercielle lyserkøleapparat) for fuldt ud at forstyrre vævet.
- Der tilsættes 20 μL proteinase K og 580 μL RNase-frit vand til hvert rør, og de inkuberes ved 55 °C i 30 min.
- Centrifuge prøverne i 3 min ved 10.000 x g og overfør supernatanten til et 1,5 ml rør.
- Tilsæt 0,5 volumener af 90% ethanol til hvert rør og bland.
- 700 μL af prøven overføres til en RNA-bindingssøjle, der er anbragt i et 2 ml opsamlingsrør og centrifugeres ved 8.000 x g i 15 s.
- Kassér gennemstrømningen, og gentag centrifugeringstrinnet for det komplette lysat.
- Der tilsættes 350 μL buffer-RW1 til kolonnen, centrifuge ved 8.000 x g for 15 s, og flow-through'en kasseres.
- Bland 10 μL DNase stock opløsning og 70 μL buffer RDD. Tilsættes opløsningen til RNA-rensemembranen, og den inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
- Der tilsættes 350 μL buffer-RW1 til kolonnen og centrifugen ved 8.000 x g for 15 s. Kassér gennemstrømningen.
- Der tilsættes 500 μL buffer-RPE og centrifuge ved 8.000 x g for 15 s. Kassér gennemstrømningen.
- Der tilsættes 500 μL buffer-RPE til RNA-rensekolonnen og centrifugeres ved 8.000 x g i 2 min.
- Kolonnen anbringes i et 1,5 ml opsamlingsrør, og der tilsættes 30 μL RNase-frit vand. Centrifuge ved 8.000 x g i 1 min.
- Det isolerede RNA ved -80 °C opbevares, indtil cDNA-syntesen.
- cDNA syntese
BEMÆRK: For at syntetisere komplementær DNA (cDNA) fra messenger RNA (mRNA) blev der anvendt et kommercielt sæt (Materialetabel). RNA fra bakteriofage MS2 blev tilføjet for at stabilisere isoleret RNA under cDNA syntese.- Tø op og bland reagenserne. Sammensætningen af en enkelt reaktion er vist i tabel 1.
- Der tilsættes 16 μL RNA-prøve til volumen for en enkelt reaktion (14 μL).
- CDNA-syntese udføres i en termisk cycler ved hjælp af følgende parametre: 10 min ved 25 °C (primerglødning), 60 min ved 50 °C (DNA-syntese), 5 min ved 85 °C (denaturering) og 5 min ved 20 °C (kølefase).
- CDNA opbevares ved -20 °C indtil den kvantitative polymerasekædereaktion i realtid (RT-qPCR).
- RT-qPCR
BEMÆRK: For RT-qPCR af kvægprøver er primere og sonder designet ved hjælp af kommerciel qPCR-software i realtid (f.eks. IDT) for generne GAPDH (Glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenase), COL2A1 (Kollagen type 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Kollagen type 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) og MMP-13 (Matrix Metalloproteinase-13). Kvægprimere og dobbeltslukkede sonder blev leveret af IDT. De reagenser, der anvendes til en enkelt reaktion til vurdering af effektiviteten og genekspressionen, vises i tabel 2.- Den vigtigste blanding af en enkelt reaktion (9 μL) afsyl hver brønd på en 96-brønd PCR-plade, og der tilsættes 1 μL cDNA til hver reaktion. Udfør prøver for hver prøve i tre eksemplarer.
- PCR-pladen lukkes med tætningsolie og centrifuge ved 877 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- RT-qPCR udføres ved hjælp af en præcisionstermisk cycler med følgende protokol: 95 °C i 10 min. 45 cyklusser af forstærkning (95 °C i 10 s, glødning i 30 s, cDNA syntese) og 37 °C i 30 s.
BEMÆRK: Der kræves særlige glødetemperaturer for hver primer. - Brug GAPDH sammen med målgener for at bekræfte effektiviteten.
- Brug den medfølgende software til at beregne effektiviteten af hvert gen.
- Normalisere ct-værdierne (cycle threshold) til referencegenet GAPDH's udtryk, og ΔΔCT-metoden anvendes til kvantificering.
- RNA-isolation
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontaktområdet og kontakttrykket skal bekræftes ved hjælp af en trykmålingsfilm (Figur 1). Fysiologisk belastningstilstand kan bekræftes ved at sammenligne med referenceaftryk for definerede kontakttryk. Under test overvåges friktionskoefficienten konstant. Med et overtringskontaktområde kan en lav friktionskoefficient opretholdes i mindst 1 time (figur 2). Ved hjælp af Safranin O farvning den ekstracellulære matrix sammensætning og struktur kan bestemmes (Figur 3). Intensiteten af Safranin O farvning er proportional med proteoglycan indhold. Hurtig Grøn counterstains de ikke-kollagen steder og giver en klar kontrast til Safranin O farvning. Det proteoglykanske indhold varierer over ledoverfladen, men skal være ensartet i hele vævssektionen i baselineprøver (figur 3A). Kontrolprøver, der er nedsænket i testopløsningen, viser udtrækning af GAGs, som kan modvirkes ved mekanisk belastning (Figur 3B, 3C). Kvægmuskulære chondrocytters metaboliske aktivitet er uafhængig af høststedet, men viser en stigning i forhold til mekanisk belastning sammenlignet med aflæssede kontroller (figur 4). Genekspressionsniveauet for bruskspecifikke gener (COL2A1, ACAN) stiger med fysiologiske belastningsforhold, mens kataboliske gener (COL1A1 og MMP13) er reguleret med stationært kontaktområde (Figur 5).
| Volumen (μl) | |
| Transskriptor RT Reaktioner Buffer 5x conc. | 6 |
| Beskytter RNasehæmmer 40U/μl | 0.75 |
| Deoxynukleotid Bland 10 mM hver | 3 |
| Tilfældig Hexamer Primer 600 μM | 3 |
| Transskriptionen Omvendt Transskription 20 U/μl | 0.75 |
| MS2 RNA (0,8 μg/μl) | 0.375 |
| Nuclease frit destilleret vand | 0.125 |
| Samlet volumen | 14 |
Tabel 1: Reagenser til en enkelt reaktion for cDNA-syntese.
| Volumen (μl) | |
| FastStart Sonde Master 2X | 5 |
| Hydrolysesonde 2,5 μM | 1 |
| Venstre PrimerGAPDH 5 μM | |
| Højre Primer GAPDH 5 μM | |
| Nuclease frit destilleret vand | 3 |
| Mastermix i alt | 9 |
Tabel 2: Reagenser til Master Mix for en enkelt PCR.
Figur 1: P-måling af det oprindelige kontaktområde ved metalbruskgrænsefladen før prøvning. På grund af metalcylinderens konveksitet og ledoverfladen og dens elastiske egenskaber er det oprindelige kontaktområde elliptisk. Under glidende, denne første kontaktområde bevæger sig med et slag på 2 mm, hvilket resulterer i et større område, der er udsat for mekanisk belastning; skalalinje = 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tidsafhængig friktionskoefficient (varighed 1 time) for syv prøver, der er testet ved 8 mm/s glidehastighed og 1 N-belastning (2 MPa-kontakttryk). Hver farvet linje repræsenterer COF af en osteochondral cylinder. Den observerede variation ligger inden for grænserne for biologiske prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Histologiske tværsnit af osteochondralprøver af kvæg, der er plettet med Safranin-O og Fast Green. a) Baseline-prøver viser et højt GAG-indhold i hele ledbrusken. b )Kontrolprøvenedsænket i testopløsning uden mekanisk belastning viser mindre Safranin-O farvning i mellemzonen, hvilket angiver en ekstraktion af proteoglycaner. c )Testedeprøver viser et højere GAG-indhold sammenlignet med betjeningsforanstaltninger, hvilket indikerer mekanisk stimulering. skala bar = 250 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Metabolisk aktivitet af kvæg leddekonit chondrocytter efter tribologiske undersøgelser med forskellige belastningsvariationer og kontroller. Den vandrette stiplede linje repræsenterer oprindelige niveauer. Den nonparametriske Kruskal-Wallis test blev udført til sammenligning mellem testgrupper efterfulgt af Dunns post hoc test i tilfælde af betydning. *p < 0,05. Dette tal er blevet ændret fra Stotter et al.18. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Genekspression af bruskspecifikke gener efter tribologisk test med forskellige belastningsforhold og kontroller. COL2A1=kollagen type 2; ACAN=aggrecan; COL1A1= kollagen type 1; MMP13= matrix metalloproteinase 13. Ekspressionsniveauerne blev normaliseret til rengøringsgenet GAPDH (glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenase). De vandrette stiplede linjer repræsenterer grundlæggende udtryksniveauer. Den nonparametriske Kruskal-Wallis test blev udført til sammenligning mellem testgrupper efterfulgt af Dunns post hoc test i tilfælde af betydning. *p < 0,05. Dette tal er blevet ændret fra Stotter et al.18. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Focal metalliske implantater repræsenterer en bjærgning procedure for osteochondralde defekter, især i midaldrende patienter og efter mislykkedes primær behandling. Selv om kliniske undersøgelser viste lovende kortsigtede resultater, en observeret komplikation er skader på den modsatte, indfødte brusk10. Kadaver- og biomekaniske undersøgelser viser klare beviser for, at korrekt implantation med flad eller let forsænket positionering opretholder naturligt kontakttryk19. Tribologiske eksperimenter giver mulighed for at teste forskellige brusk bindinger in vitro. Under sådanne, belastningsforhold, smøring, materiale bindinger og varighed kan justeres som ønsket.
Der anvendes brusk af kvæg i stor mængde på det lokale slagteri. Cellulær og zonestruktur er meget lig den menneskelige femorale condyles20. Proteoglycan-indholdet er imidlertid stedsspecifikt, mens genekspressionsniveauer har vist sig at være ensartede over ledoverfladen. I denne protokol blev osteochondralpropper høstet fra vægtlejeområdet. Brusk tykkelse, kollagen arkitektur og deraf følgende tribologiske egenskaber viser regionale forskelle over den leddemiske overflade16. Begrænsningen af at bruge osteochondral stik i en unconfined loading setup med en forstyrret kollagen netværk og ændret væske tryk sammenlignet med hele fælles modeller skal overvejes.
I de fleste tribologiske undersøgelser anvendes PBS alene som testløsning til at generere mere robuste data. PBS er en bufferopløsning med isotonisk osmolaritet og hjælper med at opretholde en konstant pH under biologiske eksperimenter. Brug af PBS med hyaluronsyre giver grænsesmøring og reduceret friktion21. Derfor reducerer synovialvæske friktionskoefficienten og forbedrer væsketryk sammenlignet med saltvand22. Friktionskoefficienten afhænger af forskellige systemegenskaber, fremgår af den klassiske Stribeck Curve. Stribeck-kurven vedrører friktionskoefficienten og viskositeten, hastigheden og belastningen og præsenterer de grundlæggende smøreregimer: grænse,blandet og hydrodynamisk smøring. Grænsesmøring kan opnås med PBS alene som smørevæske, men belastningsparametre skal justeres i overensstemmelse hermed. Den COF, der leveres fra testene, er gennemsnitsværdier over slagtilfældet. Således kan det antages, at forskellige smøring betingelser opstår i løbet af cyklussen. Under stilstand ved tilbageførsel kan grænseforholdene være fremherskende, mens blandet smøring kan være fremherskende under glidende. Baseret på den absolutte varighed i glidecyklussen ville sidstnævnte have haft større indflydelse på den gennemsnitlige COF-værdi.
For at undersøge fysiologiske forhold, der opstår i leddene under daglige aktiviteter, kan belastningsbetingelserne justeres i overensstemmelse hermed i tribometersoftwaren. Der skal anvendes trykfølsomme målinger for at bekræfte det ønskede kontakttryk. Rapporterede femorotibial kontakttryk spænder mellem 1 MPa under stående og op til 10 MPa under downhill kører23. Med en fokal resurfacing, implantat pres er bare lidt forhøjet sammenlignet med sunde led24. Rapporterede relative glidehastigheder under gangcyklus rapporteres op til 100 mm/s med store variationer i de forskellige faser. Det betyder, at relative fællesbevægelser overstiger de hastigheder, der kan anvendes i denne tribologiske opsætning. For at efterligne naturlige kinematiske forhold og kontakttryk i sunde knæled spænder belastningsforholdene fra 1 til 10 MPa-kontakttryk og 5 til 100 mm/s glidehastighed. Men mens høje belastninger kan anvendes i denne eksperimentelle opsætning, er rækkevidden af glidende hastigheder begrænset. Patologiske belastningsforhold, både overbelastning og utilstrækkelige belastninger, kan også simuleres. Lave glidende hastigheder eller statisk belastning sidestiller immobilisering, mens højere belastninger repræsenterer ikke-fysiologisk mekanisk stimulation.
Da enzymatisk fordøjelse kan påvirke ekspressionen af bruskspecifikke gener, beskrives en ikke-zymatisk vævshomogenisering i denne protokol. Under cDNA syntese, ud over instruktionerne, RNA fra bakteriophage MS2 tilsættes til stabilisering formål. Genekspressionsniveauer, men ikke proteiner, blev analyseret for at opdage tidlige ændringer i den biosyntetiske aktivitet af artikulære chondrocytter. Ud over histologiske sektioner og metabolisk aktivitet giver disse analyser omfattende oplysninger om virkningerne af mekanisk belastning på ledbrusk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. og nierösterreichens provinsregering gennem Life Science Calls (Projekt-ID: LSC15-019) og ved det østrigske COMET-program (Projekt K2 XTribology, grant nr. 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
