Summary
Detta protokoll beskriver beredning, biotribologisk testning och analys av osteochondral cylindrar glidande mot metall implantatmaterial. Resultat åtgärder som ingår i detta protokoll är metabolisk aktivitet, genuttryck och histologi.
Abstract
Osteochondral defekter i medelålders patienter kan behandlas med fokala metalliska implantat. Först utvecklats för defekter i knäleden, implantat finns nu för axeln, höft, fotled och den första metatarsalphalangeal gemensamma. Samtidigt som smärtminskning och klinisk förbättring, progressiv degenerativa förändringar av de motsatta brosk observeras i många patienter. De mekanismer som leder till denna skada är inte helt klarlagda. Detta protokoll beskriver en tribological experiment för att simulera en metall-på-brosk ihopkoppling och omfattande analys av ledbrosket. Metallimplantatmaterial testas mot osteokondralcylindrar av nötkreatur som modell för humant ledbrosk. Genom att tillämpa olika laster och glidhastigheter kan fysiologiska lastningsförhållanden imiteras. För att ge en omfattande analys av effekterna på ledbrosket, histologi, metabolisk aktivitet och gen uttryck analys beskrivs i detta protokoll. Den största fördelen med tribologisk testning är att lastningsparametrar kan justeras fritt för att simulera in vivo-förhållanden. Dessutom kan olika testlösningar användas för att undersöka påverkan av smörjning eller proinflammatoriska medel. Genom att använda genuttrycksanalys för broskspecifika gener och katabola gener, kan tidiga förändringar i metabolismen av artikulära kondrocyter som svar på mekanisk lastning upptäckas.
Introduction
Behandlingen av osteokondraldefekter är krävande och kräver operation i många fall. För fokala osteokondrala lesioner hos medelålders patienter är fokala metalliska implantat ett hållbart alternativ, särskilt efter misslyckandet med primär behandling, som benmärgsstimulering (BMS) eller autolog kondrocyteimplantation (ACI)1. Partiell yta ersättare kan betraktas bärgning förfaranden som kan minska smärta och förbättra rörelseomfång2. Dessa implantat är typiskt består av en CoCrMo legering och finns i olika storlekar och offset konfigurationer för att matcha den normalaanatomin 3. Medan ursprungligen utvecklats för defekter på den mediala femorala condyle i knät, sådana implantat finns nu och används för höft, fotled, axel, och armbåge4,5,6. För ett tillfredsställande resultat är det avgörande att bedöma den mekaniska gemensamma anpassningen och tillståndet för det motsatta brosket. Vidare har korrekt implantation utan utsprång av implantatet visat sig vara fundamental7.
Kliniska studier visade utmärkta kortsiktiga resultat i form av smärtreduktion och förbättring av funktion hos medelålders patienter förolika platser 5,6,8. Jämfört med allograft implantation, fokal metall implantat tillåta tidig vikt bäring. Men visade den motsatta ledbrosk visade accelererad slitage i ett betydande antal patienter9,10. Därav, även med rätt placering, i många fall degeneration av den inhemska brosk verkar oundvikligt, medan de underliggande mekanismerna förblir oklart. Liknande degenerativa förändringar har observerats efter bipolär hemiarthroplasty avhöften 11 och ökas med aktivitet och lastning12.
Tribologiska experiment ger möjlighet att studera sådana parningar in vitro och simulera olika lastningssituationer som inträffar under fysiologiska förhållanden13. Användningen av osteokondralstift erbjuder en enkel geometri modell för att undersöka tribology av ledbrosk glidande mot inhemska brosk eller något implantat material14 och kan ytterligare användas i hela gemensamma simuleringsmodeller15. Metall-på-brosk pairings visar accelererade brosk slitage, extracellulära matris störningar, och minskad cell livskraft i den ytliga zonen jämfört med en brosk-på-brosk ihopkoppling16. Skador på brosket uppkom främst i form av delaminering mellan de ytliga och mellersta zonerna17. Men de mekanismer som leder till brosk degeneration är inte helt klarlagda. Detta protokoll ger en omfattande analys av den biosyntetiska aktiviteten av ledbrosk. Genom bestämning av metabolisk aktivitet och genuttryck nivåer av katabola gener, tidiga indikationer för brosk uppdelning kan identifieras. Fördelen med in vitro tribologiska experiment är att lastningsparametrar kan justeras för att imitera olika lastningsförhållanden.
Därav, följande protokoll är lämplig att simulera en metall-på-brosk ihopkoppling, som representerar en experimentell hemiarthroplasty modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av metallcylindrar
- Analysera cylindriska kobolt-krom-molybden (CoCrMo) stavar uppfyller standardspecifikationerna för kirurgiska implantat för deras kemiska sammansättning med hjälp av scanning elektronmikroskopi (SEM) med energi dispersiv röntgenspektroskopi per tillverkarens protokoll för att bekräfta förutsatt värden.
OBS: Den elementära sammansättningen av CoCrMo-legeringen som används för detta experiment är 65% Co, 28% Cr, 5% Mo och 2% andra. - Blöt slipa proverna med kiselkarbidslippapper som börjar med en kornstorlek på 500. Använd slippapper i ökande ordning upp till en kornstorlek på 4000.
- Polera cylindern med 3 μm och 1 μm pasta för att uppnå en ytråhet som ligger inom toleransnivån för ytfinishkrav för metalliska kirurgiska implantat (ISO 5832-12:2019) och total- och partiella ledbytesimplantat (ISO 21534:2007).
OBS: Den genomsnittliga ytjämheten bestäms med hjälp av ett konfokalmikroskop. - Kapa CoCrMo-stavar (Ø på 6 mm) till cylindrar med en längd av 10 mm.
2. Skörd av osteokondral cylindrar
- Använd bovint kvävande leder från skelett mogna djur (i åldern 18-24 månader vid tidpunkten för uppoffringen) och hålla dem inneslutna och kylda tills dissekering inom 24 h efter uppoffring.
OBS: Fogar köps från den lokala slaktaren. Fogen förblir stängd fram till dissektion. - Att skörda cylindriska osteochondral pluggar under aseptiska förhållanden, desinficera knäet och utföra en arthrotomy och exponera den mediala femorala condyle.
OBS: Dissektionen måste utföras med försiktighet för att inte skada den artikulära ytan. - Inspektera den artikulära ytan för makroskopiska skador.
OBS: Kassera provet om brosket saknar sitt vitaktiga, släta och glansiga utseende eller om det finns blåsor, sprickor eller större defekter. - Rikta in skärröret vinkelrätt mot den viktbärande ytans artikulära yta och kör in anordningen i brosket och det subkondrala benet med fasta drag med en hammare. Vid 15 mm penetrationsdjup vrider du enheten medurs med en plötslig rörelse.
- Ta bort enheten, sätt i den vita ratten och skruva in den tills den nedre änden av osteokondralpluggen är synlig.
- Märk anteroposterior orienteringen av proverna med en steril markör för att kunna ordna osteokondral cylindern i enlighet med detta under provning.
OBS: Det tredimensionella kollagennätverket och dess komplexa arkitektur underlättar de unika mekaniska egenskaperna hos ledbrosk och bör övervägas i provens orientering. - Skölj provet med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att tvätta bort blod- och fettvävnad.
- Upprepa de steg som nämns ovan för att skörda önskat antal osteokondralpluggar (8 mm diameter, 15 mm längd).
OBS: Typiskt, 9 till 12 osteokondral cylindrar kan skördas från viktbärande område på den mediala femorala condyle. - Placera proverna i Dulbeccos modifierade Eagles medium som innehåller 10% fetalt bovinserum, kompletterat med antibiotika (penicillin 200 U/mL; streptomycin 0,2 mg/mL) och amphotericin B 2,5 μg/mL och förvara dem vid 4 °C tills testningen för att upprätthålla lönsamheten.
- Analysera kontroll osteochondral pluggar direkt efter skörden för att fastställa baslinjevärden (se analys avsnitt).
3. Tribologisk provning
- Utför experimenten med hjälp av en kommersiellt tillgänglig återgående tribometer med en cylinder-på-platta konfiguration. Krav på enheten är vertikal lastning och justerbar last och glidhastighet. Vidare möjliggör en vätskecell att utföra testerna i en smörjlösning.
- Bestäm kontakttrycket i CoCrMo-on-brosksystemet med hjälp av en tryckmätningsfilm. Placera tryckmätningsfilmen vid gränssnittet och applicera statisk belastning under 30 s för att bestämma initialt kontakttryck, kontaktstorlek och form. På grund av metallcylinderns konvexitet och ledbrosk har det inledande kontaktområdet en elliptisk form i denna konfiguration.
OBS: Tryckmätningsfilmen reagerar på det påsedda trycket som visar röd missfärgning av zoner där tröskeltrycket uppnås eller överskrids. För 1 N belastning bestämdes kontakttrycket runt 2 MPa genom visuell jämförelse med definierade kontakttryck. - Fixera osteokondralcylindrarna på den understa provhållaren med märkningen i linje med glidriktningen, och montera CoCrMo-cylindrarna på den övre belastningscellen.
- Tillsätt testlösningen (PBS med 3 g/L hyaluronsyra) i vätskecellen som resulterar i att den dränka osteokondralcylindern och täcka metal-broskglidningsgränssnittet.
- Ställ in testparametrarna (föreskriven normalkraft, slaglängd och glidhastighet), som sedan appliceras och underhålls under hela provningen.
OBS: Återgående rörelses slaglängd måste ställas in enligt kontaktytan för att skapa ett migrerande kontaktområde (MCA). För pluggar som är 8 mm i diameter, en 2 mm stroke tillåter tillräcklig rehydrering av brosket. - Börja reciprocal glidning av CoCrMo cylindern mot ledbrosket nedsänkt i smörjlösningen med de inställda lastningsparametrarna.
- Övervaka friktionskoefficienten (COF) under experimenten.
OBS: COF bedöms automatiskt men kan beräknas med hjälp av ekvationen μ=F/W (μ - friktionskoefficient; F - friktionskraft; W - normal belastning som tillämpas av systemet). - Avsluta experimentet efter önskad testperiod.
- Ta bort osteokondralpluggen från provhållaren, skölj den med PBS och förvara den i medium tills ytterligare biologisk analys (se nedan).
- Submerge kontrollprover i testlösningen vid rumstemperatur under hela testets varaktighet och analysera tillsammans med prover som har utsatts för mekanisk lastning.
4. Analys
OBS: Osteochondral cylinder analyseras för metabolisk aktivitet och genuttryck för att undersöka biologisk aktivitet; histologi utförs för att studera brosk yta integritet och den underliggande matrisen.
- Histologi
- För histologisk analys, sänk ner osteochondralpluggarna i 4% buffrad formaldehydlösning i rumstemperatur fram till vidare bearbetning.
- Skölj proverna med PBS och placera dem i ett plastkärl.
- Lägg till ett överskott av den användningsklara dekalcifier-lösningen så att alla prover täcks över.
- Applicera konstant agitation i 4 veckor för fullständig dekalcifiering.
- Efter dekalceringen bäddar du in proverna i vattenlösliga glykoler och hartser och förvarar dem på −80 °C.
- Erhåll 6 μm sektioner genom att kryosektionera transversal till kontaktytan.
- Därefter, förbereda proverna för Safranin O färgning och Fastgreen counterstaining med hjälp av en tillverkares protokoll.
- Fånga histologiska bilder med hjälp av ett mikroskop och process med hjälp av bildbehandlingsprogram.
- Metabolisk aktivitet
OBS: Den metaboliska aktiviteten hos kondrocyter i ledbrosket undersöks med en XTT-baserad ex vivo toxikologianalys.- Skölj osteochondralpluggen med hjälp av PBS och lägg provet i en petriskål.
- Placera en 24-brunnsplatta på en skala och nolla skalan.
- Skär av brosket från osteokondraltransplantatet med en skalpell i ett stycke.
- Bissekera brosket i två lika stora bitar så att kontaktytan fördelas lika på båda broskbitarna och finhackar en halv till 1 mm³ bitar. Den andra halvan används för analys av genuttryck.
- Överför malet brosk i en brunn av den beredda 24-brunnsplattan och bestäm vävnadsvikten.
- Upprepa de steg som nämns ovan för varje prov och tillsätt 1 mL tillväxtmedium till varje brunn av plattan.
- Tillsätt XTT-lösningen (490 μL XTT-märkningsreagens och 10 μL aktiveringsreagens) enligt tillverkarens instruktion och mix.
- Inkubera plattan vid 37 °C och 5%CO 2 i 4 h.
- Efter inkubationen, ta bort supernatanten och för över den till ett 5 mL-rör.
- Extrahera tetrazoliumprodukten genom att tillsätta 0,5 mL dimetylsulfoxid (DMSO) till broskvävnaden i 24-brunnsplattan och applicera kontinuerlig agitation i 1 h vid rumstemperatur.
- Ta bort DMSO-lösningen och poola den med den tidigare insamlade XTT-lösningen.
- Överför 100 μL av provet i tre exemplar i en 96-brunnsplatta på en plattläsare och mät absorbansen vid en våglängd på 492 nm och en referensvåglängd vid 690 nm.
- Normalisera de resulterande absorbansvärdena till den våta vikten av varje prov och utföra analys med hjälp av programvara.
- Analys av genuttryck
- RNA-isolering
OBS: RNA-isolering utförs med hjälp av en kommersiell sats (Tabell övermaterial ) enligt de instruktioner som tillverkaren med små ändringar.- Finhacka den andra halvan av broskvävnaden som erhålls från osteokondralpluggen i små bitar.
- Överför dem till ett rör som innehåller keramiska pärlor och 300 μL av Lysbuffert (som innehåller 1% β-merkaptoetanol).
OBS: Proverna kan frysas i flytande kväve tills vidare bearbetning. - Tina proverna i 2 min och använd lyser kommersiella för homogenisering av vävnaden. Applicera 6500 varv/min i 20 s (homogeniseringssteg) fyra gånger med en 2 min kylfas efter varje körning (vid 4 °C med hjälp av den kommersiella lyserkylanordningen) för att helt störa vävnaden.
- Tillsätt 20 μL proteinas K och 580 μL RNasefritt vatten till varje rör och inkubera dem vid 55 °C i 30 min.
- Centrifugera proverna i 3 min vid 10 000 x g och överför supernatanten till ett 1,5 mL-rör.
- Tillsätt 0,5 volymer av 90% etanol till varje rör och blanda.
- Överför 700 μL av provet till en RNA-bindningskolumn som placeras i ett 2 mL uppsamlingsrör och centrifug vid 8 000 x g för 15 s.
- Kassera genomflödet och upprepa centrifugeringssteget för den kompletta lysate.
- Tillsätt 350 μL buffert RW1 till kolonnen, centrifug vid 8 000 x g för 15 s och kassera genomflödet.
- Blanda 10 μL DNase stamlösning och 70 μL buffert RDD. Tillsätt lösningen till RNA-reningsmembranet och inkubera den i rumstemperatur i 15 min.
- Tillsätt 350 μL Buffer RW1 till kolonnen och centrifugen vid 8 000 x g för 15 s. Kassera genomflödet.
- Tillsätt 500 μL buffert RPE och centrifug vid 8 000 x g för 15 s. Kassera genomflödet.
- Tillsätt 500 μL buffert RPE till RNA-reningskolumnen och centrifugen vid 8 000 x g i 2 min.
- Placera kolonnen i ett 1,5 mL uppsamlingsrör och tillsätt 30 μL RNase-fritt vatten. Centrifugera vid 8 000 x g i 1 min.
- Förvara det isolerade RNA vid -80 °C fram till cDNA-syntes.
- cDNA-syntes
NOTERA: Att syntetisera kompletterande DNA (cDNA) från budbärare RNA (mRNA) användes en reklamfilmsats (Bordlägga av material). RNA från bakteriofage MS2 lades till för att stabilisera isolerade RNA under cDNA syntes.- Tina och blanda reagenserna. Sammansättningen för en enda reaktion visas i tabell 1.
- Tillsätt 16 μL RNA-prov till volymen för en enda reaktion (14 μL).
- Utför cDNA-syntes i en termisk cycler med hjälp av följande parametrar: 10 min vid 25 °C (primer glödgning), 60 min vid 50 °C (DNA-syntes), 5 min vid 85 °C (denaturering) och 5 min vid 20 °C (kylfas).
- Förvara cDNA vid -20 °C tills kvantitativ polymeraskedning i realtid (RT-qPCR) i realtid.
- RT-qPCR
OBS: För RT-qPCR av nötkreatursprover konstruerades grund- och sonder genom användning av kommersiell qPCR-programvara i realtid (t.ex. IDT) för generna GAPDH (Glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas), COL2A1 (Kollagen typ 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Kollagen typ 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1), och MMP-13 (Matrix Metalloproteinase-13). Bovin primers och dubbla släckt sonder tillhandahölls av IDT. De reagenser som används för en enda reaktion för att utvärdera effektivitets- och genuttrycket visas i tabell 2.- Dispensera mastermixen av en enda reaktion (9 μL) till varje brunn av en 96-väl PCR-platta och tillsätt 1 μL cDNA till varje reaktion. Utför tester för varje prov i tre exemplar.
- Stäng PCR-plattan med hjälp av tätningsolja och centrifug vid 877 x g i 10 min vid 4 °C.
- Utför RT-qPCR med hjälp av en termisk cykelapparat med precision med följande protokoll: 95 °C i 10 min, 45 cykler av amplifiering (95 °C för 10 s, glödgning för 30 s, cDNA-syntes), och 37 °C i 30 s.
OBS: Specifika glödgningstemperaturer krävs för varje grundvatten. - Använd GAPDH tillsammans med målgenerna för att bekräfta effektiviteten.
- Använd den tillhandahållna programvaran för att beräkna effektiviteten hos varje gen.
- Normalisera cykeltröskelns (CT) värden till uttrycket av referensgenen GAPDH och använd ΔΔCT-metoden för kvantifiering.
- RNA-isolering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontaktytan och kontakttrycket måste bekräftas med hjälp av en tryckmätningsfilm (Bild 1). Fysiologiskt lasttillstånd kan bekräftas genom att jämföra med referensavtryck för definierade kontakttryck. Under provningen övervakas friktionskoefficienten konstant. Med ett migrerande kontaktområde kan en lågfriktionskoefficient bibehållas i minst 1 h (Figur 2). Med hjälp av Safranin O färgning extracellulär matris sammansättning och struktur kan bestämmas (Bild 3). Intensiteten i Safranin O färgning är proportionell mot proteoglykanhalten. Fast Green räknar ner de icke-kollagen platser och ger en tydlig kontrast till Safranin O färgning. Proteoglykanhalten varierar över den artikulära ytan men ska vara enhetligt i hela vävnadsavsnittet i baslinjeprover (figur 3A). Kontrollprover nedsänkta i testlösningen visar extraktion av GAGs, som kan motverkas genom mekanisk lastning (Figur 3B, 3C). Metabolisk aktivitet hos bovins artikulära kondrocyter är oberoende av upptagningsstället, men visar en ökning med mekanisk lastning jämfört med olastade kontroller (Figur 4). Genuttrycksnivåerna hos broskspecifika gener (COL2A1, ACAN) ökar med fysiologiska belastningstillstånd, medan katabola gener (COL1A1 och MMP13) är uppreglerade med stationärt kontaktyta (Figur 5).
| Volym (μl) | |
| Transkriptor RT Reaktioner Buffert 5x conc. | 6 |
| Protector RNase Inhibitor 40U/μl | 0.75 |
| Deoxynucleotide Mix 10 mM vardera | 3 |
| Slumpmässig Hexamer Primer 600 μM | 3 |
| Transkriptor Omvänd Transkriptas 20 U/μl | 0.75 |
| MS2 RNA (0,8 μg/μl) | 0.375 |
| Nukleasfritt destillerat vatten | 0.125 |
| Total volym | 14 |
Tabell 1: Reagenser för en enda reaktion för cDNA-syntes.
| Volym (μl) | |
| FastStart Probe Master 2X | 5 |
| Hydrolyssond 2,5 μM | 1 |
| Vänster PrimerGAPDH 5 μM | |
| Rätt Primer GAPDH 5 μM | |
| Nukleasfritt destillerat vatten | 3 |
| Total Master Mix | 9 |
Tabell 2: Reagenser för Master Mix för en enda PCR.
Figur 1: Pressuremätning av den inledande kontaktytan vid metall-broskgränssnittet före provning. På grund av metallcylinderns konvexitet och den artikulära ytan och dess elastiska egenskaper är det inledande kontaktområdet elliptisk. Under glidning rör sig detta inledande kontaktområde med ett slag på 2 mm, vilket resulterar i ett större område som utsätts för mekanisk lastning; skala bar = 2 mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Tidsbetonad friktionskoefficient (varaktighet 1 timme) för sju prov som provats vid 8 mm/s glidhastighet och 1 N-belastning (2 MPa kontakttryck). Varje färgad linje representerar COF av en osteokondral cylinder. Den observerade variabiliteten ligger inom gränserna för biologiska prover. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Histologiska tvärsnitt av osteokondralprover från nötkreatur som färgats med Safranin-O och Fast Green. (A) Baseline prover visar hög GAG innehåll i hela ledbrosket. (B) Kontrollprov nedsänkt i testlösning utan mekanisk lastning uppvisar mindre Safranin-O-färgning i mittenzonen, indikering av en extraktion av proteoglykaner. (C) Testade prover visar högre GAG-halt jämfört med kontroller, som indikerar mekanisk stimulering; skala bar = 250 μm Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Metabolisk aktivitet hos bovint artikulära kondrocyter efter tribologisk testning med olika belastningsvariationer och kontroller. Den vågräta streckade linjen representerar baslinjenivåer. Nonparametric Kruskal–Wallis testet utfördes för jämförelse mellan testning grupper följt av Dunns post hoc-test i händelse av betydelse. *p < 0,05. Denna siffra har modifierats från Stotter et al.18. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Genuttryck av broskspecifika gener efter tribologisk provning med olika lastningsförhållanden och kontroller. COL2A1=kollagen typ 2; ACAN=aggrecan; COL1A1= kollagen typ 1; MMP13= matrismetalloproteinas 13. Uttrycksnivåerna normaliserades till hushållningsgenen GAPDH (glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas). De vågräta streckade linjerna representerar baslinjeuttrycksnivåer. Nonparametric Kruskal–Wallis testet utfördes för jämförelse mellan testning grupper följt av Dunns post hoc-test i händelse av betydelse. *p < 0,05. Denna siffra har modifierats från Stotter et al.18. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Focal metalliska implantat utgör en bärgning förfarande för osteochondral defekter, särskilt i medelålders patienter och efter misslyckades primär behandling. Även om kliniska studier visat lovande kortsiktiga resultat, en observerade komplikation är skador på den motsatta, infödda brosk10. Kadaver och biomekaniska studier visar tydliga bevis för att korrekt implantation med platt eller något infälld positionering upprätthåller naturliga kontakttryck19. Tribologiska experiment ger en möjlighet att testa olika broskparningar in vitro. Vid sådana kan lastningsförhållanden, smörjning, materialparningar och varaktighet justeras efter önskemål.
Nötkreaturbrosk finns i hög mängd på det lokala slakteriet. Den cellularity och den zonala strukturen är mycket lik den mänskliga femorala condyles20. Proteoglycan-innehåll är dock platsspecifikt, medan genuttrycksnivåerna har visat sig vara enhetliga över den artikulära ytan. I detta protokoll, var osteochondral pluggar skördas från viktbärande område. Brosktjocklek, kollagenarkitektur och resulterande tribologiska egenskaper visar regionala skillnader över den artikulära ytan16. Begränsningen av att använda osteokondral pluggar i en unconfined lastning setup med en störd kollagen nätverk och ändrade vätsketrycksättning jämfört med hela gemensamma modeller måste beaktas.
I majoriteten av tribologiska studier används enbart PBS som testlösning för att generera mer robusta data. PBS är en buffertlösning med isotonosmomolitet och hjälper till att upprätthålla ett konstant pH-värde under biologiska experiment. Att använda PBS med hyaluronsyra ger gränssmörjning och minskad friktion21. Följaktligen minskar ledvätska friktionskoefficienten och förbättrar vätsketrycksbildningen jämfört med saltlösning22. Friktionskoefficienten beror på olika systemegenskaper, vilket demonstreras av den klassiska StribeckKurvan. Stribeckkurvan relaterar friktionskoefficienten och viskositeten, hastigheten och belastningen och presenterar de grundläggande smörjregimerna: gräns, blandad och hydrodynamisk smörjning. Gränssmörjning kan erhållas med enbart PBS som smörjvätska, men lastningsparametrar skulle behöva justeras därefter. Cof levereras från testerna är genomsnittliga värden över stroke. Således kan man anta att olika smörjförhållanden uppstår under cykeln. Vid stillastående vid återföringsläge kan gränsförhållandena vara rådande, medan blandad smörjning kan vara dominerande under glidningen. Baserat på absolut varaktighet under glidcykeln skulle den senare ha haft större inflytande på medelvärdet för COF-värdet.
För att undersöka fysiologiska tillstånd som förekommer i leder under dagliga aktiviteter kan lastningsförhållanden justeras i enlighet med detta i tribometermjukvaran. Tryckkänsliga mätningar bör användas för att bekräfta de önskade kontakttrycken. Rapporterade femorotibiala kontakttryck varierar mellan 1 MPa under stående och upp till 10 MPa under nedförsbacke23. Med en fokal renovering, implantattrycket är bara något förhöjd jämfört med friska leder24. Rapporterade relativa glidnings-hastigheter under gångcykeln rapporteras upp till 100 mm/s med höga variationer under de olika faserna. Detta innebär att relativa gemensamma rörelser överstiger de hastigheter som kan tillämpas i denna tribologiska setup. För att efterlikna naturliga kinematiska förhållanden och kontakttryck i friska knäleder, varierar lastningsförhållandena från 1 till 10 MPa kontakttryck och 5 till 100 mm/s glidhastighet. Men medan höga belastningar kan tillämpas i denna experimentella setup, är utbudet av glidande hastigheter begränsad. Patologiska lastningsförhållanden, både överbelastning och otillräckliga belastningar, kan också simuleras. Låg glidande hastigheter eller statiska lastning likställer immobilisering, medan högre belastningar representerar nonphysiological mekanisk stimulering.
Som enzymatisk matsmältningen kan påverka uttrycket av brosk-specifika gener, en nonenzymatic vävnad homogenisering beskrivs i detta protokoll. Under cDNA-syntesen, förutom instruktionerna, läggs RNA från bakteriofage MS2 till för stabiliseringsändamål. Gen uttryck nivåer, men inte proteiner, analyserades för att upptäcka tidiga förändringar i den biosyntetiska aktiviteten av artikulära chondrocytes. Förutom histologiska sektioner och metabolisk aktivitet, dessa analyser ger omfattande information om effekterna av mekanisk lastning på ledbrosk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. och delstatsregeringen i Niederösterreich genom Life Science Calls (Projekt-ID: LSC15-019) och av det österrikiska COMET-programmet (Projekt K2 XTribology, Anslag nr 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
