Summary
يصف هذا البروتوكول إعداد واختبارات الكائنات الحيوية وتحليل اسطوانات الـ osteochondral التي تنزلق ضد مواد الزرع المعدنية. والتدابير الناتجة المدرجة في هذا البروتوكول هي النشاط الأيضي والتعبير الجيني وعلم الأنسجة.
Abstract
قد يتم علاج عيوب Osteochondral في المرضى في منتصف العمر مع زرع معدنية التركيز. وضعت لأول مرة لعيوب في مفصل الركبة، يزرع متاحة الآن للكتف والورك والكاحل وأول مفصل مشط القدم. في حين توفير الحد من الألم وتحسين السريرية, ويلاحظ التغيرات التنكسية التدريجي للغضروف معارضة في كثير من المرضى. والآليات المؤدية إلى هذا الضرر غير مفهومة تماما. يصف هذا البروتوكول تجربة مائية لمحاكاة الاقتران معدن على الغضاريف وتحليل شامل للغضاريف المفصلية. يتم اختبار مواد زرع المعادن ضد اسطوانات أوستيوكوندرال البقرية كنموذج للغضاريف المفصلية البشرية. من خلال تطبيق الأحمال المختلفة وسرعات الانزلاق ، يمكن تقليد ظروف التحميل الفسيولوجية. لتقديم تحليل شامل للآثار على الغضروف المفصلي ، علم الأنسجة ، والنشاط الأيضي وتحليل التعبير الجيني ويرد في هذا البروتوكول. الميزة الرئيسية للاختبار tribological هو أن المعلمات التحميل يمكن تعديلها بحرية لمحاكاة في ظروف الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، قد تستخدم حلول اختبار مختلفة للتحقيق في تأثير تزييت أو العوامل الموالية للالتهابات. باستخدام تحليل التعبير الجيني للجينات الخاصة بالغضاريف والجينات تقويضية، قد يتم الكشف عن التغيرات المبكرة في عملية التمثيل الغذائي للتشندردروسيات المفصلية استجابة للتحميل الميكانيكي.
Introduction
علاج عيوب العظام يتطلب يتطلب جراحة في كثير من الحالات. للآفات osteochondral البؤري في المرضى في منتصف العمر، يزرع المعدنية البؤري خيار قابل للتطبيق، وخاصة بعد فشل العلاج الأولي، مثل تحفيز نخاع العظام (BMS) أو زرع كثرومسيات ذاتية (ACI)1. يمكن اعتبار الاستبدال الجزئي للسطح إجراءات الإنقاذ التي يمكن أن تقلل من الألم وتحسين نطاق الحركة2. وعادة ما تتكون هذه يزرع من سبائك CoCrMo وتتوفر في مختلف الأحجام وتكوينات الإزاحة لتتناسب مع التشريح العادي3. في حين وضعت في البداية لعيوب على مُوسَّع الفخذ في الركبة، هذه الغرسات متاحة الآن وفي الاستخدام للورك والكاحل والكتف والمرفق4،5،6. للحصول على نتيجة مرضية، من المهم تقييم محاذاة المفاصل الميكانيكية وحالة الغضروف المنافس. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت زرع الصحيح دون نتوء من الزرع لتكون أساسية7.
أظهرت الدراسات السريرية نتائج ممتازة على المدى القصير من حيث الحد من الألم وتحسين وظيفة في المرضى في منتصف العمر لمختلف المواقع5,6,8. مقارنة مع زرع allograft، زرع المعادن البؤري تسمح تحمل الوزن المبكر. ومع ذلك، أظهر الغضروف المفصلي المتقابل تآكل متسارع في عدد كبير من المرضى9،10. وبالتالي، حتى مع وضع السليم، في كثير من الحالات انحطاط الغضروف الأصلي يبدو لا مفر منه، في حين أن الآليات الأساسية لا تزال غير واضحة. وقد لوحظت تغيرات تنكسية مماثلة بعد رأب الهرمل ثنائي القطب من الورك11 ويتم زيادتها مع النشاط والتحميل12.
التجارب تريبولوجي توفر إمكانية لدراسة مثل هذه الاقترانات في المختبر ومحاكاة حالات التحميل المختلفة التي تحدث في ظل الظروف الفسيولوجية13. استخدام دبابيس osteochondral يقدم نموذجا هندسيا بسيطة للتحقيق في tribology من الغضاريف المفصلية الانزلاق ضد الغضروف الأصلي أو أي مادة زرع14 ويمكن استخدامها كذلك في نماذج المحاكاة المشتركة15كله . الاقترانات معدنية على الغضاريف تظهر تآكل الغضاريف المتسارعة ، اضطراب المصفوفة خارج الخلية ، وانخفاض صلاحية الخلية في المنطقة السطحية مقارنة مع غضروف على الغضاريف الاقتران16. الأضرار التي لحقت الغضروف وقعت أساسا في شكل delamination بين المناطق السطحية والوسطى17. ومع ذلك، فإن الآليات المؤدية إلى انحطاط الغضروف غير مفهومة تماما. يوفر هذا البروتوكول تحليلا شاملا للنشاط البيولوجي للغضاريف المفصلية. من خلال تحديد النشاط الأيضي ومستويات التعبير الجيني للجينات تقويضي, يمكن تحديد المؤشرات المبكرة لتحلل الغضاريف. وميزة التجارب في المختبر tribological هو أن المعلمات التحميل يمكن تعديلها لتقليد مختلف ظروف التحميل.
ومن ثم، فإن البروتوكول التالي مناسب لمحاكاة الاقتران معدن على الغضاريف، وهو ما يمثل نموذجاً تجريبياً لرأب الهرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد اسطوانات معدنية
- تحليل قضبان الكوبالت-الكروم-الموليبدينوم (CoCrMo) الأسطوانية التي تفي بالمواصفات القياسية للزرعات الجراحية لتركيبها الكيميائي باستخدام المجهر الإلكتروني المسح (SEM) مع التحليل الطيفي للأشعة السينية التشتت في بروتوكول الشركة المصنعة لتأكيد القيم المقدمة.
ملاحظة: التركيبة الأساسية لسبائك CoCrMo المستخدمة في هذه التجربة هي 65٪ Co و 28٪ Cr و 5٪ Mo و 2٪ أخرى. - الرطب طحن العينات مع كربيد السيليكون ورقة طحن بدءا من حجم الحبوب من 500. استخدام ورقة طحن في زيادة النظام تصل إلى حجم الحبوب من 4000.
- تلميع الأسطوانة مع 3 ميكرومتر و 1 ميكرومتر معجون لتحقيق خشونة السطح التي هي ضمن مستوى التسامح من متطلبات إنهاء السطح للزرعات الجراحية المعدنية (ISO 5832-12:2019) وزرع استبدال المفاصل الكلي والجزئي (ISO 21534:2007).
ملاحظة: يتم تحديد متوسط خشونة السطح باستخدام مجهر confocal. - قطع قضبان CoCrMo (Ø من 6 مم) إلى اسطوانات بطول 10 ملم.
2. حصاد اسطوانات osteochondral
- استخدام البقر خنق المفاصل من الحيوانات الناضجة الهيكل العظمي (الذين تتراوح أعمارهم بين 18-24 شهرا في وقت التضحية) والحفاظ عليها الواردة وتبريد حتى تشريح داخل 24 ساعة بعد التضحية.
ملاحظة: يتم شراء المفاصل من الجزار المحلي. يبقى المفصل مغلقاً حتى التشريح. - لحصاد المقابس الاسطولية الأسطوانية في ظل ظروف اتعفن، وتطهير الركبة وإجراء مفصلية وفضح مفصلي مُتوسط.
ملاحظة: يجب إجراء التشريح بحذر بعدم إتلاف السطح المفصلي. - فحص السطح المفصلي للأضرار العيانية.
ملاحظة: تجاهل العينة إذا كان الغضروف يفتقر إلى مظهره الأبيض والناعم واللمع أو إذا كان هناك تقرحات أو شقوق أو عيوب أكبر. - محاذاة عمودي أنبوب القطع إلى السطح المفصلي لمنطقة تحمل الوزن ودفع الجهاز إلى الغضروف والعظام تحت البطن عن طريق السكتات الدماغية شركة مع مطرقة. في عمق الاختراق 15 مم، قم بتحريف الجهاز باتجاه عقارب الساعة بحركة مفاجئة.
- إزالة الجهاز، وإدراج مقبض الباب الأبيض والمسمار في حتى نهاية أسفل المكونات osteochondral مرئية.
- وضع علامة على الاتجاه الأمامي للعينات مع علامة معقمة لترتيب اسطوانة osteochondral وفقا لذلك أثناء الاختبار.
ملاحظة: تسهل شبكة الكولاجين ثلاثية الأبعاد وهندستها المعمارية المعقدة الخصائص الميكانيكية الفريدة للغضاريف المفصلية وينبغي النظر فيها في اتجاه العينات. - شطف العينة مع المالحة الفوسفات المخزنة (PBS) لغسل الدم والأنسجة الدهنية.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه لحصاد العدد المطلوب من المقابس osteochondral (قطرها 8 مم، 15 مم طول).
ملاحظة: عادة، يمكن حصاد 9 إلى 12 اسطوانة أوستيوشوندال من منطقة تحمل الوزن على كوندل الفخذ المتوسط. - ضع العينات في وسط النسر المعدل في دولبيككو الذي يحتوي على مصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪ ، والمكملة بالمضادات الحيوية (البنسلين 200 U/mL ؛ streptomycin 0.2 mg/mL) و amphotericin B 2.5 ميكروغرام / مل وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى الاختبار للحفاظ على الجدوى.
- تحليل التحكم في سدادات osteochondral مباشرة بعد الحصاد لتحديد قيم خط الأساس (انظر قسم التحليل).
3. اختبار تريبولوجي
- إجراء التجارب باستخدام tribometer الترددية المتاحة تجاريا مع تكوين اسطوانة على لوحة. متطلبات الجهاز هي تحميل عمودي والتحميل قابل للتعديل وسرعة انزلاق. وعلاوة على ذلك، تمكن الخلية السائلة من إجراء الاختبارات في محلول التشحيم.
- تحديد ضغط الاتصال في نظام CoCrMo-on-غضروف باستخدام فيلم قياس الضغط. ضع فيلم قياس الضغط على الواجهة وقم بتطبيق الحمل الثابت لمدة 30 s لتحديد ضغط الاتصال الأولي وحجم الاتصال والشكل. نظراً لعمّق الاسطوانة المعدنية والغضاريف المفصلية، فإن منطقة التلامس الأولية لها شكل بيضاوي الشكل في هذا التكوين.
ملاحظة: يتفاعل فيلم قياس الضغط مع الضغط المطبق الذي يظهر تلونًا أحمر للمناطق التي يتم فيها الوصول إلى ضغط العتبة أو تجاوزه. بالنسبة لـ 1 N من الحمل، تم تحديد ضغط الاتصال حول 2 MPa بالمقارنة البصرية مع ضغوط الاتصال المحددة. - إصلاح اسطوانات osteochondral على حامل عينة أسفل مع وضع علامة الانحياز مع اتجاه انزلاق, وجبل اسطوانات CoCrMo على خلية الحمل العلوي.
- إضافة حل الاختبار (برنامج تلفزيوني مع 3 غرام / ل حمض الهيالورونيك) في الخلية السائلة التي تؤدي إلى غمر اسطوانة osteochondral وتغطية المعادن الغضروف انزلاق واجهة.
- تعيين معلمات الاختبار (القوة العادية المقررة، السكتة الدماغية وسرعة الانزلاق)، والتي يتم تطبيقها ثم والحفاظ عليها طوال الاختبار.
ملاحظة: يجب تعيين طول حد حركة تبادلية وفقاً لمنطقة التلامس لإنشاء منطقة اتصال ترحيل (MCA). بالنسبة للمقابس التي يبلغ قطرها 8 مم، تسمح السكتة الدماغية 2 مم بالإماهة الكافية للغضاريف. - بدء الانزلاق المتبادل من اسطوانة CoCrMo ضد الغضروف المفصلي مغمورة في حل التشحيم مع معلمات التحميل مجموعة.
- مراقبة معامل الاحتكاك (COF) أثناء التجارب.
ملاحظة: يتم تقييم COF تلقائياً ولكن يمكن حسابها باستخدام المعادلة μ = F/W (μ - معامل الاحتكاك؛ F - قوة الاحتكاك؛ W - الحمل العادي المطبق من قبل النظام). - إنهاء التجربة بعد فترة الاختبار المطلوبة.
- إزالة المكونات osteochondral من حامل العينة، وشطفه مع برنامج تلفزيوني وتخزينها في المتوسط حتى مزيد من التحليل البيولوجي (انظر أدناه).
- غمر عينات التحكم في محلول الاختبار في درجة حرارة الغرفة طوال مدة الاختبار، وتحلل مع العينات التي تعرضت للتحميل الميكانيكي.
4- التحليل
ملاحظة: يتم تحليل اسطوانة Osteochondral للنشاط الأيضي والتعبير الجيني للتحقيق في النشاط البيولوجي; يتم تنفيذ علم الأنسجة لدراسة سلامة سطح الغضاريف والمصفوفة الأساسية.
- علم الأنسجة
- للتحليل النسيجي، غمر المقابس osteochondral في 4% محلول الفورمالديهايد المخزنة في درجة حرارة الغرفة حتى مزيد من المعالجة.
- شطف العينات مع برنامج تلفزيوني ووضعها في وعاء من البلاستيك.
- إضافة فائض من decalcifier جاهزة للاستخدام-الحل بحيث يتم تغطية كافة العينات.
- تطبيق التحريض المستمر لمدة 4 أسابيع للتكديس الكامل.
- بعد إزالة التحلل، قم بتضمين العينات في الجليكولات والراتنجات القابلة للذوبان في الماء وتخزينها عند −80 درجة مئوية.
- الحصول على 6 ميكرومتر المقاطع عن طريق cryosectioning عرضية إلى منطقة التماس.
- في وقت لاحق، وإعداد العينات لSafranin O تلطيخ و Fastgreen مكافحة الالطياد باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
- التقاط الصور النسيجية باستخدام المجهر وعملية باستخدام برامج معالجة التصوير.
- النشاط الأيضي
ملاحظة: يتم التحقيق في النشاط الأيضي للتشندروسيات في الغضروف المفصلي مع مقايسة سمية الجسم الحية السابقة المستندة إلى XTT.- شطف المكونات osteochondral باستخدام برنامج تلفزيوني ووضع العينة في طبق بيتري.
- ضع لوحة 24-well على مقياس وصفر المقياس.
- قطع الغضروف من الكسب غير المشروع osteochondral مع مشرط في قطعة واحدة.
- اقطع الغضروف في قطعتين متساويتين بحيث يتم توزيع منطقة التماس بالتساوي على كل من قطع الغضاريف والقطع المفرومة من نصف إلى 1 مم³. ويستخدم النصف الثاني لتحليل التعبير الجيني.
- نقل الغضروف المفروم إلى بئر واحد من لوحة 24-جيدا المعدة وتحديد وزن الأنسجة.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه لكل عينة وإضافة 1 مل من متوسطة النمو لكل بئر من لوحة.
- أضف حل XTT (490 ميكرولتر من كاشف XTT و10 ميكرولتر من كاشف التنشيط) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة وخلطها.
- احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ل4 ساعات.
- بعد الحضانة، وإزالة عظمى ونقله إلى أنبوب 5 مل.
- استخراج المنتج tetrazolium بإضافة 0.5 مل من ثنائي الفينيل السلفوكسي (DMSO) إلى أنسجة الغضروف في لوحة 24-جيدا وتطبيق الانفعالات المستمرة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة حل DMSO وتجميعه مع الحل XTT التي تم جمعها مسبقاً.
- نقل 100 ميكرولتر من العينة في ثلاث ية في لوحة 96 جيدا على قارئ لوحة وقياس امتصاص في طول موجة من 492 نانومتر والطول الموجي المرجعي في 690 نانومتر.
- تطبيع قيم الامتصاص الناتجة إلى الوزن الرطب لكل عينة وإجراء التحليل باستخدام البرامج.
- تحليل التعبير الجيني
- عزل الحمض النووي الريبي
ملاحظة: يتم عزل RNA باستخدام مجموعة تجارية(جدول المواد)وفقًا للتعليمات التي تقدمها الشركة المصنعة مع تعديلات صغيرة.- المفروم النصف الثاني من أنسجة الغضاريف التي تم الحصول عليها من المكونات osteochondral إلى قطع صغيرة.
- نقلها إلى أنبوب يحتوي على خرز السيراميك و 300 ميكرولتر من Lysis Buffer (التي تحتوي على 1٪ β-mercaptoethanol).
ملاحظة: يمكن تجميد العينات في النيتروجين السائل حتى مزيد من المعالجة. - ذوبان العينات لمدة 2 دقيقة واستخدام lyser التجارية لتجانس الأنسجة. تطبيق 6500 دورة في الدقيقة لمدة 20 s (خطوة التجانس) أربع مرات مع مرحلة تبريد 2 دقيقة بعد كل تشغيل (في 4 درجة مئوية باستخدام جهاز التبريد lyser التجارية) لتعطيل تماما الأنسجة.
- إضافة 20 ميكرولتر من البروتينات K و 580 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase إلى كل أنبوب واحتضانها في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي العينات لمدة 3 دقائق في 10،000 س ز ونقل عظمى إلى أنبوب 1.5 مل.
- إضافة 0.5 وحدات تخزين من 90٪ الإيثانول إلى كل أنبوب ومزيج.
- نقل 700 ميكرولتر من العينة إلى عمود ملزم للرنا يوضع في أنبوب جمع 2 مل وطاردة مركزية عند 8000 x غم لمدة 15 s.
- تجاهل تدفق من خلال وتكرار خطوة الطرد المركزي لlysate كاملة.
- إضافة 350 ميكرولتر من العازلة RW1 إلى العمود، والطرد المركزي في 8000 س ز لمدة 15ثان، وتجاهل تدفق من خلال.
- مزيج 10 ميكرولتر من محلول الأسهم DNase و 70 ميكرولتر من العازلة RDD. إضافة الحل إلى غشاء تنقية RNA واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 350 ميكرولتر من العازلة RW1 إلى العمود والطرد المركزي في 8000 x ز لمدة 15 s. تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 500 ميكرولتر من RPE العازلة والطرد المركزي في 8000 س ز لمدة 15 s. تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 500 μL من RPE العازلة لعمود تنقية الجيش الملكي النيبالي والطرد المركزي في 8000 × ز لمدة 2 دقيقة.
- ضع العمود في أنبوب جمع 1.5 مل وأضف 30 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase. جهاز طرد مركزي في 8000 × ز لمدة 1 دقيقة.
- تخزين الحمض النووي الريبي المعزول في -80 درجة مئوية حتى التوليف cDNA.
- cDNA التوليف
ملاحظة: لتجميع الحمض النووي التكميلي (cDNA) من رسول RNA (مررنا) تم استخدام مجموعة تجارية (جدول المواد). تمت إضافة RNA من bacteriophage MS2 لتثبيت الحمض النووي الريبي المعزول أثناء توليف cDNA.- ذوبان وخلط الكواشف. يظهر تكوين رد فعل واحد في الجدول 1.
- إضافة 16 ميكرولتر من عينة RNA إلى وحدة التخزين لتفاعل واحد (14 ميكرولتر).
- تنفيذ التوليف cDNA في دورة حرارية باستخدام المعلمات التالية: 10 دقيقة في 25 درجة مئوية (التمهيدي الصلب)، 60 دقيقة في 50 درجة مئوية (تركيب الحمض النووي)، 5 دقائق في 85 درجة مئوية (denaturation) و 5 دقائق في 20 درجة مئوية (مرحلة التبريد).
- تخزين cDNA في -20 درجة مئوية حتى في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز الكمي سلسلة (RT-qPCR).
- RT-qPCR
ملاحظة: بالنسبة لـ RT-qPCR لعينات الأبقار، تم تصميم ال التمهيديات والمسبارات باستخدام برنامج qPCR التجاري في الوقت الحقيقي (على سبيل المثال، IDT) للجينات GAPDH (الجليسرالدهيد 3-الفوسفات dehydrogenase)، COL2A1 (نوع الكولاجين 2)، ACAN (Aggrecan)، COL1A1 (نوع الكولاجين 1)، MMP-1 (ماتريكس ميتالوبروتينيز-1)، و MMP-13 (ماتريكس ميتالوبروتيناز-13). تم توفير الزواريع البقرية والمسبارات المزدوجة التي تم إخمادها من قبل IDT. يتم عرض الكواشف المستخدمة في رد فعل واحد لتقييم الكفاءة والتعبير الجيني في الجدول 2.- الاستغناء عن المزيج الرئيسي من رد فعل واحد (9 ميكرولتر) إلى كل بئر من 96 جيدا PCR لوحة وإضافة 1 ميكرولتر من cDNA إلى كل رد فعل. إجراء اختبارات لكل عينة في ثلاث اُلَكَات.
- أغلق صفيحة PCR باستخدام زيت الختم والطرد المركزي عند 877 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تنفيذ RT-qPCR باستخدام دورة حرارية دقيقة مع البروتوكول التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 45 دورة من التضخيم (95 درجة مئوية لمدة 10 ق، التول لمدة 30 s، cDNA التوليف)، و 37 درجة مئوية لمدة 30 s.
ملاحظة: يلزم وجود درجات حرارة محددة للحنين لكل التمهيدي. - استخدم GAPDH مع الجينات المستهدفة لتأكيد الكفاءة.
- استخدم البرنامج المقدم لحساب كفاءة كل جين.
- تطبيع قيم عتبة الدورة (CT) إلى التعبير عن الجينات المرجعية GAPDH واستخدام طريقة ΔCT لتحديد كمي.
- عزل الحمض النووي الريبي
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يجب تأكيد منطقة الاتصال وضغط الاتصال باستخدام فيلم قياس الضغط (الشكل 1). يمكن تأكيد حالة التحميل الفسيولوجية من خلال مقارنة مع بصمات مرجعية لضغطات الاتصال المحددة. أثناء الاختبار ، يتم مراقبة معامل الاحتكاك باستمرار. مع منطقة الاتصال المهاجرة، يمكن الحفاظ على معامل الاحتكاك المنخفض لمدة 1 ساعة على الأقل(الشكل 2). باستخدام Safranin O تلطيخ تكوين المصفوفة خارج الخلية وهيكل يمكن تحديدها (الشكل 3). كثافة تلطيخ Safranin O يتناسب مع محتوى البروتيوغي. Fast Green مضادة المواقع غير الكولاجين ويوفر تباين واضح إلى تلطيخ Safranin O. محتوى البروتيوغليكان يختلف على سطح المفصل ولكن ينبغي أن تكون موحدة في جميع أنحاء قسم الأنسجة في عينات خط الأساس (الشكل 3A). عينات التحكم المغمورة في اختبار الحل تظهر استخراج من GAGs، والتي يمكن التصدي لها عن طريق التحميل الميكانيكي(الشكل 3B، 3C). النشاط الأيضي للchondrocytes المفصلي البقري مستقلة عن موقع الحصاد، ولكن يظهر زيادة مع التحميل الميكانيكية مقارنة مع الضوابط تفريغ (الشكل 4). مستويات التعبير الجيني للجينات الخاصة بالغضاريف (COL2A1، ACAN) تزيد مع ظروف التحميل الفسيولوجية، في حين أن الجينات تقويضي (COL1A1 و MMP13) هي أعلى تنظيما مع منطقة الاتصال الثابتة(الشكل 5).
| حجم الصوت (ميكرولتر) | |
| النسخ RT التفاعلات المخزن المؤقت 5x conc. | 6 |
| حامي RNase المانع 40U/μl | 0.75 |
| ديوكسي نوكليوتيد ميكس 10 mM لكل من | 3 |
| عشوائية هيكسمر التمهيدي 600 μM | 3 |
| نسخة عكسية Transcriptase 20 U/μl | 0.75 |
| الحمض النووي الريبي MS2 (0,8 ميكروغرام/ميكرولتر) | 0.375 |
| نوكلياز الحرة الماء المقطر | 0.125 |
| الحجم الإجمالي | 14 |
الجدول 1: الكواشف لتفاعل واحد لتخليق cDNA.
| حجم الصوت (ميكرولتر) | |
| فاستستارت مسبار ماستر 2X | 5 |
| مسابير التحلل المائي 2,5 ميكرومتر | 1 |
| أيسر التمهيدي GAPDH 5 μM | |
| اليمين التمهيدي GAPDH 5 μM | |
| نوكلياز الحرة الماء المقطر | 3 |
| مجموع ماجستير ميكس | 9 |
الجدول 2: الكواشف للميكس ماستر لPCR واحد.
الشكل 1: قياس Pressure لمنطقة الاتصال الأولية في واجهة المعادن والغضاريف قبل الاختبار. بسبب محدبة الاسطوانة المعدنية والسطح المفصلي وخصائصه المرنة ، فإن منطقة الاتصال الأولية هي بيضاوية. أثناء الانزلاق، تتحرك منطقة الاتصال الأولية هذه بجرة 2 مم، مما يؤدي إلى منطقة أكبر تتعرض للتحميل الميكانيكي؛ شريط مقياس = 2 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: معامل الاحتكاك المعتمد على الوقت (مدة ساعة واحدة) لسبع عينات تم اختبارها بسرعة انزلاق 8 مم/الثانية و 1 N (ضغط اتصال 2 ميغا باسكال). كل خط ملون يمثل COF من اسطوانة أوستيونودرال واحدة. والتباين الملاحظ في حدود العينات البيولوجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المقاطع العرضية النسيجية لعينات أوستيونوندريرال البقرية الملطخة بـ سافرانين-O والأخضر السريع. (أ)تظهر عينات خط الأساس محتوى هغ عالية في جميع أنحاء الغضروف المفصلي. (ب) عينة التحكم المغمورة في حل الاختبار دون تحميل الميكانيكية تظهر أقل تلطيخ صفران-O في المنطقة الوسطى، مما يدل على استخراج proteoglycans. (C) عينات اختبار تظهر أعلى محتوى GAG مقارنة مع الضوابط، مما يدل على التحفيز الميكانيكي؛ شريط مقياس = 250 μm الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النشاط الأيضي للزخروية المفصلية البقرية بعد الاختبار الريبولوجي مع اختلافات وضوابط تحميل مختلفة. يمثل الخط الأفقي المنقط مستويات الأساس. تم إجراء اختبار Kruskal-Wallis غير القياسي للمقارنة بين مجموعات الاختبار متبوعاً باختبار دن بعد المخصص في حالة الأهمية. * p < 0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من ستوتر وآخرون18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التعبير الجيني للجينات الخاصة بالغضاريف بعد الاختبار الريبولوجي مع ظروف وضوابط تحميل مختلفة. COL2A1 =نوع الكولاجين 2؛ ACAN = aggrecan; COL1A1 = نوع الكولاجين 1؛ MMP13 = مصفوفة ميتالوبروتيناسي 13. تم تطبيع مستويات التعبير إلى جين التدبير المنزلي GAPDH (الجليسيرالدلديهايد 3-الفوسفات dehydrogenase). تمثل الخطوط الأفقية المنقطة مستويات التعبير الأساسي. تم إجراء اختبار Kruskal-Wallis غير القياسي للمقارنة بين مجموعات الاختبار متبوعاً باختبار دن بعد المخصص في حالة الأهمية. * p < 0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من ستوتر وآخرون18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تمثل الغرسات المعدنية البؤرية إجراء إنقاذ لعيوب العظام، خاصة في المرضى في منتصف العمر وبعد فشل العلاج الأولي. على الرغم من أن الدراسات السريرية أظهرت نتائج واعدة على المدى القصير، واحدة لاحظت مضاعفات هو الضرر الذي لحق بالغضروف، الأصليمعارضة 10. تشير الدراسات التشريحية والميكانيكية الحيوية إلى وجود أدلة واضحة على أن الزرع السليم مع وضعية مسطحة أو راحة طفيفة يحافظ على ضغوط الاتصال الطبيعية19. التجارب تريبولوجي توفر إمكانية لاختبار مختلف أزواج الغضاريف في المختبر. في مثل هذه الظروف، قد يتم تعديل ظروف التحميل، تزييت، أزواج المواد والمدة على النحو المرغوب فيه.
غضروف البقر متوفر بكمية عالية في المسلخ المحلي. الخلوية وبنية المناطق هي مشابهة جدا لcondyles الفخذ الإنسان20. ومع ذلك، فإن محتوى البروتيوغليكان محدد الموقع، في حين تبين أن مستويات التعبير الجيني موحدة فوق السطح المفصلي. في هذا البروتوكول، تم حصاد المقابس osteochondral من منطقة تحمل الوزن. سمك الغضاريف، والهندسة المعمارية الكولاجين والخصائص tribological الناتجة تظهر الاختلافات الإقليمية على السطح المفصلي16. الحد من استخدام المقابس osteochondral في إعداد التحميل غير المقيد مع شبكة الكولاجين المعطلة وتغيير ضغط السوائل مقارنة مع نماذج مشتركة كاملة تحتاج إلى النظر فيها.
في معظم الدراسات الريبولوجية، يستخدم برنامج تلفزيوني وحده كحل اختبار لتوليد بيانات أكثر قوة. برنامج تلفزيوني هو حل عازل مع osmolarity متساوي التوتر ويساعد على الحفاظ على درجة الH ثابتة خلال التجارب البيولوجية. باستخدام برنامج تلفزيوني مع حمض الهيالوروني يوفر تزييت الحدود وتقليل الاحتكاك21. وفقا لذلك، السائل الزليلي يقلل من معامل الاحتكاك ويحسن ضغط السوائل مقارنة مع المالحة22. يعتمد معامل الاحتكاك على خصائص النظام المختلفة ، التي أظهرتها منحنى Stribeck الكلاسيكي. ويتصل منحنى ستريبيك بمعامل الاحتكاك واللزوجة والسرعة والحمولة ويعرض أنظمة التشحيم الأساسية: الحدود، والتزييت المختلط، والتهيّج المائي. ويمكن الحصول على تزييت الحدود مع برنامج تلفزيوني وحده كما سائل التشحيم، ولكن المعلمات التحميل سوف تحتاج إلى تعديل وفقا لذلك. COF تسليمها من الاختبارات هي قيم متوسطة على السكتة الدماغية. وهكذا، يمكن افتراض أن ظروف التشحيم المختلفة تحدث خلال الدورة. خلال الجمود عند موقف عكس، قد تكون الظروف الحدود السائدة، في حين أن تزييت مختلط قد تكون الغالبة أثناء الانزلاق. واستنادا إلى المدة المطلقة خلال دورة الانزلاق، كان من شأن هذا الأخير أن يكون له تأثير أكبر على متوسط قيمة COF.
للتحقيق في الظروف الفسيولوجية التي تحدث في المفاصل أثناء الأنشطة اليومية ، يمكن تعديل ظروف التحميل وفقًا لذلك في برنامج tribometer. وينبغي استخدام قياسات حساسة للضغط لتأكيد ضغوط الاتصال المطلوبة. تتراوح ضغوط الاتصال في الورموروتيبيال المبلغ عنها بين 1 MPa أثناء الوقوف وما يصل إلى 10 MPa أثناء تشغيلالمنحدرات 23. مع الظهور البؤري ، تكون ضغوط الزرع مرتفعة قليلاً مقارنة بالمفاصل الصحية24. يتم الإبلاغ عن السرعات المنزلقة النسبية المبلغ عنها أثناء دورة المشي حتى 100 مم/س مع اختلافات عالية خلال المراحل المختلفة. وهذا يعني أن حركات المفاصل النسبية تتجاوز السرعات التي يمكن تطبيقها في هذا الإعداد الريبولوجي. لتقليد الظروف الحركية الطبيعية وضغوط الاتصال في مفاصل الركبة الصحية، تتراوح ظروف التحميل من 1 إلى 10 MPa من ضغط الاتصال وسرعة الانزلاق 5 إلى 100 مم/س. ومع ذلك، في حين يمكن تطبيق الأحمال العالية في هذا الإعداد التجريبي، فإن نطاق السرعات المنزلقة محدود. كما يمكن محاكاة ظروف التحميل المرضية، سواء الحمل الزائد أو غير الكافي. انخفاض السرعات المنزلقة أو تحميل ثابت يعادل شل الحركة، في حين أن الأحمال الأعلى تمثل التحفيز الميكانيكي غير الفيزيولوجي.
كما يمكن أن تؤثر على الهضم الأنزيمي التعبير عن الجينات الغضروف محددة، ويرد وصف التجانس الأنسجة غير التجانس في هذا البروتوكول. أثناء التوليف cDNA, بالإضافة إلى التعليمات, يتم إضافة RNA من bacteriophage MS2 لأغراض التثبيت. تم تحليل مستويات التعبير الجيني ، ولكن ليس البروتينات ، للكشف عن التغيرات المبكرة في النشاط البيولوجي للتشخرات المفصلية. بالإضافة إلى أقسام النسيج والنشاط الأيضي، توفر هذه المقايسات معلومات شاملة عن آثار التحميل الميكانيكي على الغضاريف المفصلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. وحكومة مقاطعة النمسا السفلى من خلال استدعاءات علوم الحياة (معرف المشروع: LSC15-019) وبرنامج المذنب النمساوي (مشروع K2 XTribology، المنحة رقم 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
