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Articolo metodologico

Profilazione spaziale dell'espressione di proteine e RNA nei tessuti: un approccio alla messa a punto della microdissezione virtuale

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DOI:

10.3791/62651

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6 luglio 2022

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1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo per la messa a punto delle regioni di interesse (ROI) per le tecnologie di omiche spaziali per caratterizzare meglio il microambiente tumorale e identificare specifiche popolazioni cellulari. Per i saggi di proteomica, i protocolli personalizzati automatizzati possono guidare la selezione del ROI, mentre i saggi di trascrittomica possono essere ottimizzati utilizzando ROI di soli 50 μm.

Abstract

Il multiplexing consente la valutazione di diversi marcatori sullo stesso tessuto, fornendo al contempo un contesto spaziale. Le tecnologie di omiche spaziali consentono il multiplexing sia di proteine che di RNA sfruttando rispettivamente anticorpi e sonde oligo-marcati foto-scissibili. Gli oligo vengono scissi e quantificati da regioni specifiche attraverso il tessuto per chiarire la biologia sottostante. Qui, lo studio dimostra che i protocolli di visualizzazione automatica degli anticorpi personalizzati possono essere utilizzati per guidare la selezione del ROI in combinazione con saggi di proteomica spaziale. Questo metodo specifico non ha mostrato prestazioni accettabili con saggi di trascrittomica spaziale. Il protocollo descrive lo sviluppo di un test immunofluorescente (IF) a 3 plessi per la visualizzazione dei marcatori su una piattaforma automatizzata, utilizzando l'amplificazione del segnale del tiramido (TSA) per amplificare il segnale fluorescente da un determinato bersaglio proteico e aumentare il pool di anticorpi tra cui scegliere. Il protocollo di visualizzazione è stato automatizzato utilizzando un test 3-plex accuratamente convalidato per garantire qualità e riproducibilità. Inoltre, è stato valutato lo scambio di DAPI per coloranti SYTO per consentire l'imaging di saggi IF basati su TSA sulla piattaforma di profilazione spaziale. Inoltre, abbiamo testato la capacità di selezionare piccoli ROI utilizzando il saggio di trascrittomica spaziale per consentire l'indagine di aree di interesse altamente specifiche (ad esempio, aree arricchite per un determinato tipo di cellula). Sono stati raccolti ROI di 50 μm e 300 μm di diametro, che corrispondono rispettivamente a circa 15 cellule e 100 celle. I campioni sono stati inseriti in librerie e sequenziati per studiare la capacità di rilevare segnali provenienti da piccoli ROI e regioni specifiche del profilo del tessuto. Abbiamo determinato che le tecnologie di proteomica spaziale traggono grande vantaggio da protocolli automatizzati e standardizzati per guidare la selezione del ROI. Sebbene questo protocollo di visualizzazione automatizzata non fosse compatibile con i saggi di trascrittomica spaziale, siamo stati in grado di testare e confermare che specifiche popolazioni cellulari possono essere rilevate con successo anche in piccoli ROI con il protocollo di visualizzazione manuale standard.

Introduzione

I progressi nelle tecniche di multiplexing continuano a fornire migliori strumenti di caratterizzazione per i bersagli presenti nei tumori. Il microambiente tumorale (TME) è un sistema complesso di cellule tumorali, cellule immunitarie infiltranti e stroma, in cui le informazioni spaziali sono fondamentali per comprendere e interpretare meglio i meccanismi di interazione tra biomarcatori di interesse1. Con tecniche emergenti come GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) e 10x Visium, è possibile rilevare e quantificare contemporaneamente più target all'interno del loro contesto spaziale. L'uso di protocolli di immunofluorescenza che facilitano la visualizzazione dei tessuti può migliorare ulteriormente le capacità di profilazione spaziale di queste tecnologie.

La tecnologia Spatial Omics su cui ci siamo concentrati per lo sviluppo di questo metodo consiste in saggi di proteomica spaziale e trascrittomica in cui gli oligonucleotidi sono attaccati ad anticorpi o sonde di RNA tramite un linker fotocliviale sensibile ai raggi UV. I vetrini istologici sono etichettati con questi anticorpi o sonde oligo-coniugati e quindi visualizzati sulla piattaforma di profilazione spaziale. Successivamente, vengono selezionati ROI di diverse dimensioni e forme per l'illuminazione e gli oligonucleotidi fotoscissi vengono aspirati e raccolti in una piastra da 96 pozzetti. Gli oligonucleotidi fotoscissi sono preparati per essere quantificati con il sistema Nanostring nCounter o Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figura 1)4,5.

Le distribuzioni cellulari variano all'interno dei tessuti e la capacità di caratterizzare posizioni specifiche delle cellule utilizzando marcatori selezionati e diverse dimensioni del ROI è di grande importanza per comprendere appieno l'ambiente tissutale e identificare caratteristiche specifiche. Nella tecnologia Spatial Omics qui menzionata, il protocollo di visualizzazione standard utilizza anticorpi coniugati direttamente ed è un protocollo manuale. I marcatori standard per distinguere tra tumore e stroma sono panCytokeratin (panCK) e CD456,7, ma sono necessari ulteriori marcatori per indirizzare specifiche popolazioni cellulari di interesse. Inoltre, l'uso di anticorpi fluorescenti direttamente coniugati manca di amplificazione, il che limita la selezione degli anticorpi a marcatori abbondanti. Inoltre, i saggi manuali sono soggetti a una maggiore variabilità rispetto ai flussi di lavoro automatizzati8. Pertanto, è auspicabile disporre di un protocollo di visualizzazione personalizzabile, automatizzato e amplificato per la selezione del ROI.

Qui, lo studio dimostra che, per i saggi di proteomica spaziale, la tecnologia TSA può essere utilizzata per protocolli di visualizzazione su una piattaforma automatizzata con conseguente test più mirato e standardizzato. Inoltre, i saggi basati su TSA consentono l'uso di marcatori a bassa espressione, aumentando la gamma di obiettivi che possono essere selezionati per la visualizzazione. Un test 3-plex per panCK, FAP e Antibody X è stato sviluppato utilizzando una piattaforma automatizzata in cui panCK e FAP sono stati utilizzati per differenziare tra tumore e stroma, rispettivamente. L'anticorpo X è una proteina stromale frequentemente riscontrata nei tumori, ma la sua biologia e l'impatto sull'immunità antitumorale non sono completamente compresi. La caratterizzazione del contesto immunitario in aree ricche di anticorpi X può chiarire il suo ruolo nell'immunità antitumorale e nella risposta terapeutica, nonché il suo potenziale come bersaglio farmacologico.

Mentre i pannelli di visualizzazione automatizzati TSA personalizzati si sono dimostrati efficaci per i saggi di proteomica spaziale, l'applicazione di questi saggi per i saggi di trascrittomica spaziale non ha potuto essere confermata. Ciò è probabilmente dovuto ai reagenti e al protocollo utilizzato per i protocolli di visualizzazione automatica, che sembrano compromettere l'integrità dell'RNA. Riconoscere che un protocollo di etichettatura automatizzato per i marcatori di visualizzazione può essere utilizzato per i saggi di proteomica spaziale ma non per i saggi di trascrittomica spaziale fornisce importanti indicazioni sui progetti di analisi della tecnologia Spatial Omics.

Inoltre, lo studio dimostra che il saggio di trascrittomica spaziale può essere utilizzato per profilare bersagli in regioni di diametro fino a 50 μm o circa 15 cellule. Sono stati selezionati due ROI di dimensioni diverse per testare la capacità del test di rilevare anche trascrizioni in piccoli ROI. Per ogni regione di interesse, gli oligo corrispondenti a 1.800 bersagli di mRNA sono stati raccolti e trasformati in librerie secondo il protocollo della piattaforma di profilazione spaziale. Le librerie sono state indicizzate singolarmente, successivamente raggruppate e sequenziate. Ciò ha permesso di valutare sia l'efficienza del pooling che la capacità di identificare specifiche popolazioni cellulari in piccoli ROI.

Questo articolo mostra che per i saggi di proteomica spaziale, un protocollo automatizzato per guidare la selezione del ROI su specifici marcatori di interesse può essere utilizzato per indirizzare selettivamente l'interrogazione di aree tissutali rilevanti e caratterizzare l'ambiente spaziale del tessuto. Inoltre, dimostriamo che ROI più piccoli possono essere utilizzati per saggi trascrittomici spaziali per rilevare e caratterizzare specifiche popolazioni cellulari.

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Protocollo

Tutti i tessuti umani sono stati acquisiti da biobanche commerciali o banche di tessuti accreditate con la garanzia che sono stati ottenuti l'approvazione appropriata del Comitato di revisione istituzionale e il consenso informato.

NOTA: il protocollo viene eseguito utilizzando Discovery Ultra e GeoMx Digital Spatial Profiler. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su reagenti, apparecchiature e software utilizzati in questo protocollo.

1. Protocollo di visualizzazione automatizzata per saggi di proteomica spaziale

  1. Programma autostainer per applicare anticorpi di visualizzazione fluorescente
    1. Nel software autostainer, fare clic sul pulsante Home e scegliere Protocolli. Quindi, fare clic su Crea / Modifica protocolli e selezionare RUO DISCOVERY Universal come procedura.
    2. Fare clic su Prima sequenza > Deparaffinizzazione > Depar v2. Per Temperatura media, scegliere 72 ° C, quindi fare clic su Pretrattamento e selezionare Condizionamento cellulare e CC1 Reservoir. Per Temperatura molto elevata, scegliere 100 ° C, quindi fare clic su CC1 8 Min e continuare a fare clic fino a selezionare CC1 64 Min.
    3. Fare clic su Inibitore > Inibitore DISCOVERY e, per Tempo di incubazione, scegliere 8 minuti. Quindi, fare clic su Anticorpo > Incubazione Ab ad alta temperatura; per Bassa temperatura, scegli 37 ° C; per Anticorpo, scegliere il numero di anticorpi dall'etichetta del distributore (Anticorpo 6 in questo esempio); per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti.
      NOTA: Questo protocollo ha tre diversi numeri di anticorpi. Il primo anticorpo è FAP, il secondo è Pan-citocheratina e il terzo è Anticorpo X.
    4. Fare clic su Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, quindi per Antibody Blocking, scegliere Gt Ig Block, e per Tempo di incubazione, scegliere 4 minuti. Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap anti-Rb HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi, fai clic su Cy5 e, per Tempo di incubazione lungo, scegli 0 Hr 8 Min.
    5. Fare clic su Doppia sequenza e scegliere Denaturazione anticorpale, quindi selezionare Denatura anticorpale CC2-1 e, per Temperatura molto elevata, scegliere 100 ° C. Assicurarsi che il tempo di incubazione sia di 8 minuti. Quindi, fare clic su DS Inhibitor e selezionare Neutralizza.
    6. Fare clic su Anticorpo DS e, per Temperatura molto bassa, scegliere 37 ° C. Quindi, in Anticorpo, scegliere il numero di anticorpi dall'etichetta del distributore (Anticorpo 3 in questo esempio) e per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti.
    7. Fare clic su DS Multimer HRP e scegliere DS Multimer HRP Blocker. Quindi, per Blocco anticorpi, selezionare Gt Ig Block e per Tempo di incubazione, scegliere 4 minuti. Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap anti-Ms HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi, fai clic su DS Rhodamine 6G e, per un lungo tempo di incubazione, scegli 0 Hr 8 Min.
    8. Fare clic su Triple Stain e selezionare TS Antibody Denaturation, quindi selezionare Antibody Denature CC2-2 e, per Very High Temperature, selezionare 100 ° C. Assicurarsi che il tempo di incubazione sia di 8 minuti. Quindi, fare clic su TS Inhibitor e selezionare TS Neutralize.
    9. Fare clic su Anticorpo TS e, per Temperatura molto bassa, selezionare 37 ° C. Quindi, in Anticorpo, selezionare il numero di anticorpi dall'etichetta del distributore (Anticorpo 7 in questo esempio) e per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti.
    10. Fare clic su TS Multimer HRP e scegliere TS Multimer HRP Blocker. Quindi, per Blocco anticorpi, selezionare Gt Ig Block e per Tempo di incubazione, scegliere 4 minuti. Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap anti-Rb HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi, fai clic su TS FAM e, per Tempo di incubazione lungo, scegli 0 Hr 8 Min.
    11. Aggiungere un titolo al protocollo. Seleziona un numero di protocollo, aggiungi un commento e fai clic su Attivo seguito da Salva.
  2. Preparare diapositive, stampare etichette e avviare l'esecuzione dell'autostainer
    1. Il fornitore di prodotti da forno ha acquistato sezioni di tessuto umano FFPE (fissate in formalina, incorporate in paraffina) in un forno impostato a 70 °C per 20-60 minuti. Mentre le diapositive cuociono, stampa le etichette facendo clic su Crea etichetta nel software autostainer. Quindi, fare clic su Protocolli, selezionare il numero di protocollo e fare clic su Chiudi / Stampa. Aggiungere le informazioni pertinenti sull'etichetta della diapositiva e fare clic su Stampa.
    2. Rimuovere i vetrini dal forno e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente (RT). Applicare le etichette di protocollo stampate in precedenza alle diapositive corrispondenti.
    3. Caricare distributori di anticorpi ricaricabili con anticorpi in base al numero di etichetta dell'anticorpo assegnato al punto 1.1. In questo protocollo, utilizzare l'anticorpo 6 per FAP a 1 μg / ml, utilizzare l'anticorpo 3 per pan-citocheratina a 0,1 μg / ml e utilizzare l'anticorpo 7 per l'anticorpo X a 2,5 μg / ml. Diluire ciascun anticorpo nel diluente specificato e innescare i distributori di anticorpi ricaricabili.
    4. Raccogliere i distributori di reagenti preriempiti di blocco, rilevamento e amplificazione sopra menzionati e posizionarli su un vassoio di reagenti. Caricare le diapositive nei vassoi delle diapositive (fino a 30 diapositive per esecuzione) e fare clic su In esecuzione seguito da Sì. Si noti che DAPI non viene utilizzato per la controcolorazione nucleare.
    5. Confermare l'inizio dell'esecuzione controllando la durata dell'esecuzione sul software autostainer. Il protocollo richiede ~ 11 h per il completamento e può essere eseguito durante la notte.
    6. Il giorno successivo, assicurarsi del completamento della corsa osservando le luci lampeggianti verdi sugli slot del vassoio di scorrimento. Quindi, togliere i vetrini dallo strumento e sciacquarli energicamente in 1x tampone di reazione fino a quando la soluzione liquida di coprislip non viene completamente rimossa.
  3. Protocollo della piattaforma di profilazione spaziale per il saggio di proteomica
    1. Seguire il protocollo di proteomica spaziale indicato nella nota sottostante. Includere le seguenti modifiche al protocollo per abilitare la procedura di etichettatura automatizzata 3-plex.
    2. Eseguire i passaggi 1.2.1-1.2.6 il giorno prima di iniziare il protocollo di proteomica spaziale e passare direttamente alla fase di recupero dell'antigene del protocollo di proteomica spaziale dopo aver eseguito il passaggio 1.2.6. Omettere la procedura di visualizzazione descritta nel protocollo di proteomica di profilazione spaziale.
    3. Sostituire SYTO 13 con SYTO 64 a 5000 nM per consentire l'integrazione dei fluorofori. Diluire SYTO 64 in 1x TBS e incubare in una camera di umidità per 15 min.
    4. Quando si impostano i parametri di scansione nella piattaforma di profilazione spaziale, selezionare i filtri e i canali di messa a fuoco in base ai fluorofori utilizzati nel pannello di visualizzazione per consentire l'integrazione di 3-plex. Utilizzare FITC per DISCOVERY FAM e impostare l'esposizione a 200 ms, utilizzare Cy3 per DISCOVERY Rhodamine 6G e impostare l'esposizione su 200 ms, utilizzare Texas Red per SYTO 64 e impostare l'esposizione su 50 ms (specificare questo come canale di messa a fuoco) e, infine, utilizzare Cy5 per DISCOVERY Cy5, impostare l'esposizione su 200 ms, e salvare le modifiche.
      NOTA: le istruzioni dettagliate del protocollo di proteomica di profilazione spaziale si trovano nella scheda Supporto del sito Web ufficiale selezionando Documentazione > Manuali utente. Qui, cerca il protocollo proteico per nCounter usando Bond RX.

2. Selezione del ROI per i saggi di trascrittomica spaziale

  1. Cuocere le sezioni di pellet a celle FFPE in forno impostato a 70 °C per 20-60 min. Seguire il protocollo NGS della piattaforma di profilazione spaziale indicato nella nota sottostante e scansionare le diapositive sulla piattaforma di profilazione spaziale, selezionando dimensioni di 50 μm e 300 μm. La seguente raccomandazione è evidenziata per il saggio di trascrittomica spaziale:
    1. Quando si prepara la libreria, se sono state selezionate varie dimensioni di ROI, raggruppare ROI di dimensioni simili per creare una libreria per dimensione. Questo per garantire che vengano raggiunte profondità di sequenziamento sufficienti per tutti i ROI senza distorsioni dalle dimensioni.
      NOTA: le istruzioni dettagliate della piattaforma di profilazione spaziale si trovano nella scheda Supporto del sito Web ufficiale selezionando Documentazione > Manuali utente. Qui, cerca il protocollo RNA per applicazioni NGS utilizzando Bond RX.

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Risultati

Protocollo di visualizzazione automatizzato per guidare la selezione del ROI
In questo documento, presentiamo l'uso di un protocollo IF automatizzato e personalizzato basato su TSA per visualizzare il tessuto e selezionare ROI specifici. Lo sviluppo del pannello di visualizzazione utilizzando il melanoma e la pelle umana normale come tessuti di controllo consisteva in test di stabilità dell'epitopo, messa a punto delle intensità dei marcatori e valutazione del sanguinamento attraverso controlli esclus...

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Discussione

Ad oggi, gli anticorpi fluorescenti direttamente coniugati in un protocollo manuale sono più comunemente usati come pannelli di visualizzazione per la proteomica spaziale o saggi di trascrittomica spaziale 9,10. Tuttavia, l'uso di anticorpi fluorescenti direttamente coniugati può essere difficile per marcatori meno abbondanti, limitando la selezione di anticorpi adatti. Questo protocollo mostra che l'etichettatura dei marcatori di visualizzazione può essere autom...

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Dichiarazioni

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan e Sandra Rost sono dipendenti e azionisti di Genentech, membro del Gruppo Roche. Altre aziende che fanno parte di Roche producono reagenti e strumenti utilizzati in questo manoscritto. Ciara Martin è una dipendente a tempo pieno di NanoString Technologies Inc, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo manoscritto.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono a Thomas Wu l'elaborazione dei file NGS. Ringraziamo James Ziai per le discussioni sui risultati e la revisione del manoscritto e Meredith Triplet e Rachel Taylor per la revisione interna del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x Soluzione salina tamponata Tris (TBS)Tecnologie di segnalazione cellulare12498SDiluito a 1x TBS in acqua trattata con DEPC
Anticorpo X (non divulgato)Anticorpo cieco a causa della riservatezza
Acqua trattata con DEPCThermoFisherAM9922Un altro può essere utilizzato
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1)Ventana950-500
DISCOVERY Cy5 KitVentana760-238Indicato come Cy5
DISCOVERY FAM KitVentana760-243Indicato come FAM
DISCOVERY Goat Ig BlockVentana760-6008Indicato come Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRPVentana760-4310Indicato come OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRPVentana760-4311Indicato come OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G KitVentana760-244Indicato come Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Sistema automatizzato di preparazione dei vetriniVentana05 987 750 001 / N750-DISU-FSIndicato come autostainer sul manoscritto
FAP [EPR20021] AnticorpoAbcamAb207178
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanoStringGMX-DSP-1YIndicato come piattaforma di profilazione spaziale sul manoscritto
Camera di umiditàSimportM920-2Un altro può essere utilizzato
Pan-Citocheratina [AE1/AE3] AnticorpoAbcamAb27988
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
PythonPython Analisi statistica
Buffer di reazione (10x)Ventana950-300
Software di analisi statisticaGraphPadPrism 7Analisi statistica
SYTO 64ThermoFisherS11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana950-223
Ventana Antibody Diluente con caseinaVentana760-219Indicato come diluente specificato sul manoscritto
Ventana Dispenser di anticorpi primariVentanadipende dal numero del dispenser
Il numero di catalogo

Riferimenti

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