Articolo metodologico

Profilazione spaziale dell'espressione di proteine e RNA nei tessuti: un approccio alla messa a punto della microdissezione virtuale

DOI:

10.3791/62651

⸱

6 luglio 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un protocollo per la messa a punto delle regioni di interesse (ROI) per le tecnologie di omiche spaziali per caratterizzare meglio il microambiente tumorale e identificare specifiche popolazioni cellulari. Per i saggi di proteomica, i protocolli personalizzati automatizzati possono guidare la selezione del ROI, mentre i saggi di trascrittomica possono essere ottimizzati utilizzando ROI di soli 50 μm.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il multiplexing consente la valutazione di diversi marcatori sullo stesso tessuto, fornendo al contempo un contesto spaziale. Le tecnologie di omiche spaziali consentono il multiplexing sia di proteine che di RNA sfruttando rispettivamente anticorpi e sonde oligo-marcati foto-scissibili. Gli oligo vengono scissi e quantificati da regioni specifiche attraverso il tessuto per chiarire la biologia sottostante. Qui, lo studio dimostra che i protocolli di visualizzazione automatica degli anticorpi personalizzati possono essere utilizzati per guidare la selezione del ROI in combinazione con saggi di proteomica spaziale. Questo metodo specifico non ha mostrato prestazioni accettabili con saggi di trascrittomica spaziale. Il protocollo descrive lo sviluppo di un test immunofluorescente (IF) a 3 plessi per la visualizzazione dei marcatori su una piattaforma automatizzata, utilizzando l'amplificazione del segnale del tiramido (TSA) per amplificare il segnale fluorescente da un determinato bersaglio proteico e aumentare il pool di anticorpi tra cui scegliere. Il protocollo di visualizzazione è stato automatizzato utilizzando un test 3-plex accuratamente convalidato per garantire qualità e riproducibilità. Inoltre, è stato valutato lo scambio di DAPI per coloranti SYTO per consentire l'imaging di saggi IF basati su TSA sulla piattaforma di profilazione spaziale. Inoltre, abbiamo testato la capacità di selezionare piccoli ROI utilizzando il saggio di trascrittomica spaziale per consentire l'indagine di aree di interesse altamente specifiche (ad esempio, aree arricchite per un determinato tipo di cellula). Sono stati raccolti ROI di 50 μm e 300 μm di diametro, che corrispondono rispettivamente a circa 15 cellule e 100 celle. I campioni sono stati inseriti in librerie e sequenziati per studiare la capacità di rilevare segnali provenienti da piccoli ROI e regioni specifiche del profilo del tessuto. Abbiamo determinato che le tecnologie di proteomica spaziale traggono grande vantaggio da protocolli automatizzati e standardizzati per guidare la selezione del ROI. Sebbene questo protocollo di visualizzazione automatizzata non fosse compatibile con i saggi di trascrittomica spaziale, siamo stati in grado di testare e confermare che specifiche popolazioni cellulari possono essere rilevate con successo anche in piccoli ROI con il protocollo di visualizzazione manuale standard.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I progressi nelle tecniche di multiplexing continuano a fornire migliori strumenti di caratterizzazione per i bersagli presenti nei tumori. Il microambiente tumorale (TME) è un sistema complesso di cellule tumorali, cellule immunitarie infiltranti e stroma, in cui le informazioni spaziali sono fondamentali per comprendere e interpretare meglio i meccanismi di interazione tra biomarcatori di interesse1. Con tecniche emergenti come GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) e 10x Visium, è possibile rilevare e quantificare contemporaneamente più target all'interno del loro contesto spaziale. L'uso di protocolli di immunofluorescenza che facilitano la v....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i tessuti umani sono stati acquisiti da biobanche commerciali o banche di tessuti accreditate con la garanzia che sono stati ottenuti l'approvazione appropriata del Comitato di revisione istituzionale e il consenso informato.

NOTA: il protocollo viene eseguito utilizzando Discovery Ultra e GeoMx Digital Spatial Profiler. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su reagenti, apparecchiature e software utilizzati in questo protocollo.

1. Protocollo di visualizzazione automatizzata per saggi di proteomica spaziale

  1. Programma autostainer per applicare anticorpi d....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protocollo di visualizzazione automatizzato per guidare la selezione del ROI
In questo documento, presentiamo l'uso di un protocollo IF automatizzato e personalizzato basato su TSA per visualizzare il tessuto e selezionare ROI specifici. Lo sviluppo del pannello di visualizzazione utilizzando il melanoma e la pelle umana normale come tessuti di controllo consisteva in test di stabilità dell'epitopo, messa a punto delle intensità dei marcatori e valutazione del sanguinamento attraverso controlli esclus.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ad oggi, gli anticorpi fluorescenti direttamente coniugati in un protocollo manuale sono più comunemente usati come pannelli di visualizzazione per la proteomica spaziale o saggi di trascrittomica spaziale 9,10. Tuttavia, l'uso di anticorpi fluorescenti direttamente coniugati può essere difficile per marcatori meno abbondanti, limitando la selezione di anticorpi adatti. Questo protocollo mostra che l'etichettatura dei marcatori di visualizzazione può essere autom.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan e Sandra Rost sono dipendenti e azionisti di Genentech, membro del Gruppo Roche. Altre aziende che fanno parte di Roche producono reagenti e strumenti utilizzati in questo manoscritto. Ciara Martin è una dipendente a tempo pieno di NanoString Technologies Inc, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo manoscritto.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori riconoscono a Thomas Wu l'elaborazione dei file NGS. Ringraziamo James Ziai per le discussioni sui risultati e la revisione del manoscritto e Meredith Triplet e Rachel Taylor per la revisione interna del manoscritto.

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x Soluzione salina tamponata Tris (TBS)Tecnologie di segnalazione cellulare12498SDiluito a 1x TBS in acqua trattata con DEPC
Anticorpo X (non divulgato)Anticorpo cieco a causa della riservatezza
Acqua trattata con DEPCThermoFisherAM9922Un altro può essere utilizzato
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1)Ventana950-500
DISCOVERY Cy5 KitVentana760-238Indicato come Cy5
DISCOVERY FAM KitVentana760-243Indicato come FAM
DISCOVERY Goat Ig BlockVentana760-6008Indicato come Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRPVentana760-4310Indicato come OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRPVentana760-4311Indicato come OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G KitVentana760-244Indicato come Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Sistema automatizzato di preparazione dei vetriniVentana05 987 750 001 / N750-DISU-FSIndicato come autostainer sul manoscritto
FAP [EPR20021] AnticorpoAbcamAb207178
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanoStringGMX-DSP-1YIndicato come piattaforma di profilazione spaziale sul manoscritto
Camera di umiditàSimportM920-2Un altro può essere utilizzato
Pan-Citocheratina [AE1/AE3] AnticorpoAbcamAb27988
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
PythonPython Analisi statistica
Buffer di reazione (10x)Ventana950-300
Software di analisi statisticaGraphPadPrism 7Analisi statistica
SYTO 64ThermoFisherS11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana950-223
Ventana Antibody Diluente con caseinaVentana760-219Indicato come diluente specificato sul manoscritto
Ventana Dispenser di anticorpi primariVentanadipende dal numero del dispenser
Il numero di catalogo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572(2020).
  2. Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Omica SpazialeProteomica SpazialeTrascrittomica SpazialeRegione di InteresseImmunofluorescenza MultiplexAmplificazione del Segnale tramite TiramideProtocollo di Visualizzazione AutomatizzatoProfilazione dell Espressione ProteicaProfilazione dell Espressione dell RNAFissato in Formalina e Incluso in Paraffina

Articoli correlati