Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het verfijnen van interessante regio's (ROI's) voor Spatial Omics-technologieën om de micro-omgeving van de tumor beter te karakteriseren en specifieke celpopulaties te identificeren. Voor proteomics-assays kunnen geautomatiseerde aangepaste protocollen de ROI-selectie begeleiden, terwijl transcriptomics-assays kunnen worden verfijnd met behulp van ROI's zo klein als 50 μm.
Abstract
Multiplexing maakt de beoordeling van verschillende markers op hetzelfde weefsel mogelijk en biedt tegelijkertijd ruimtelijke context. Spatial Omics-technologieën maken zowel eiwit- als RNA-multiplexing mogelijk door gebruik te maken van respectievelijk foto-splijtbare oligo-gelabelde antilichamen en sondes. Oligo's worden gesplitst en gekwantificeerd van specifieke regio's in het weefsel om de onderliggende biologie op te helderen. Hier toont de studie aan dat geautomatiseerde aangepaste antilichaamvisualisatieprotocollen kunnen worden gebruikt om ROI-selectie te begeleiden in combinatie met ruimtelijke proteomics-assays. Deze specifieke methode vertoonde geen acceptabele prestaties met ruimtelijke transcriptomics-assays. Het protocol beschrijft de ontwikkeling van een 3-plex immunofluorescent (IF) assay voor markervisualisatie op een geautomatiseerd platform, met behulp van tyramide signaalversterking (TSA) om het fluorescerende signaal van een bepaald eiwitdoel te versterken en de antilichaampool te vergroten om uit te kiezen. Het visualisatieprotocol werd geautomatiseerd met behulp van een grondig gevalideerde 3-plex-test om kwaliteit en reproduceerbaarheid te garanderen. Daarnaast werd de uitwisseling van DAPI voor SYTO-kleurstoffen geëvalueerd om beeldvorming van TSA-gebaseerde IF-assays op het ruimtelijke profileringsplatform mogelijk te maken. Daarnaast hebben we het vermogen getest om kleine ROI's te selecteren met behulp van de ruimtelijke transcriptomics-test om het onderzoek van zeer specifieke interessegebieden mogelijk te maken (bijvoorbeeld gebieden die zijn verrijkt voor een bepaald celtype). ROIs van 50 μm en 300 μm diameter werden verzameld, wat overeenkomt met respectievelijk ongeveer 15 cellen en 100 cellen. Monsters werden gemaakt in bibliotheken en gesequenced om het vermogen te onderzoeken om signalen van kleine ROI's en profielspecifieke gebieden van het weefsel te detecteren. We hebben vastgesteld dat ruimtelijke proteomics-technologieën zeer profiteren van geautomatiseerde, gestandaardiseerde protocollen om ROI-selectie te begeleiden. Hoewel dit geautomatiseerde visualisatieprotocol niet compatibel was met ruimtelijke transcriptomics-assays, konden we testen en bevestigen dat specifieke celpopulaties met succes kunnen worden gedetecteerd, zelfs in kleine ROI's met het standaard handmatige visualisatieprotocol.
Introduction
Vooruitgang in multiplexingtechnieken blijft betere karakteriseringsinstrumenten bieden voor doelen die aanwezig zijn in tumoren. De tumormicro-omgeving (TME) is een complex systeem van tumorcellen, infiltrerende immuuncellen en stroma, waarbij ruimtelijke informatie van cruciaal belang is om mechanismen van interactie tussen biomarkers van belang beter te begrijpen en te interpreteren1. Met opkomende technieken zoals de GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) en 10x Visium kunnen meerdere doelen tegelijkertijd worden gedetecteerd en gekwantificeerd binnen hun ruimtelijke context. Het gebruik van immunofluorescentieprotocollen die weefselvisualisatie vergemakkelijken, kan de ruimtelijke profileringsmogelijkheden van deze technologieën verder verbeteren.
De Spatial Omics-technologie waarop we ons voor deze methodeontwikkeling hebben gericht, bestaat uit ruimtelijke proteomics en transcriptomics-assays waarbij oligonucleotiden via een UV-gevoelige fotocleavable linker aan antilichamen of RNA-sondes worden bevestigd. Histologische dia's worden gelabeld met deze oligo-geconjugeerde antilichamen of sondes en vervolgens afgebeeld op het ruimtelijke profileringsplatform. Vervolgens worden ROIs van verschillende groottes en vormen geselecteerd voor verlichting en worden de fotocleaved oligonucleotiden geaspireerd en verzameld in een 96-well plaat. De fotocleaved oligonucleotiden worden bereid om te worden gekwantificeerd met het Nanostring nCounter-systeem of Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figuur 1)4,5.
Celverdelingen variëren binnen weefsels en het vermogen om specifieke locaties van cellen te karakteriseren met behulp van geselecteerde markers en verschillende ROI-groottes is van groot belang om de weefselomgeving volledig te begrijpen en specifieke kenmerken te identificeren. In de hier genoemde Spatial Omics-technologie maakt het standaard visualisatieprotocol gebruik van direct geconjugeerde antilichamen en is het een handmatig protocol. De standaardmarkers om onderscheid te maken tussen tumor en stroma zijn panCytokeratine (panCK) en CD45 6,7, maar aanvullende markers zijn nodig om specifieke celpopulaties van belang te targeten. Bovendien mist het gebruik van direct geconjugeerde fluorescerende antilichamen amplificatie, wat de selectie van antilichamen beperkt tot overvloedige markers. Bovendien zijn handmatige testen onderhevig aan meer variabiliteit dan geautomatiseerde workflows8. Daarom is het wenselijk om een aanpasbaar, geautomatiseerd en versterkt visualisatieprotocol te hebben voor ROI-selectie.
Hier toont de studie aan dat, voor ruimtelijke proteomics-assays, TSA-technologie kan worden gebruikt voor visualisatieprotocollen op een geautomatiseerd platform, wat resulteert in een meer gerichte en gestandaardiseerde test. Bovendien maken op TSA gebaseerde assays het gebruik van low-expressing markers mogelijk, waardoor het bereik van doelen die kunnen worden geselecteerd voor visualisatie wordt vergroot. Een 3-plex assay voor panCK, FAP en Antibody X werd ontwikkeld met behulp van een geautomatiseerd platform waar panCK en FAP werden gebruikt om onderscheid te maken tussen respectievelijk tumor en stroma. Antilichaam X is een stromaal eiwit dat vaak voorkomt in tumoren, maar de biologie en impact ervan op de immuniteit tegen tumoren zijn niet volledig begrepen. Het karakteriseren van de immuuncontextuur in gebieden die rijk zijn aan antilichaam X kan zijn rol in antitumorimuniteit en therapeutische respons ophelderen, evenals het potentieel als medicijndoelwit.
Hoewel aangepaste geautomatiseerde TSA-visualisatiepanelen succesvol bleken te zijn voor ruimtelijke proteomics-assays, kon de toepassing van deze assays voor ruimtelijke transcriptomics-assays niet worden bevestigd. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan de reagentia en het protocol dat wordt gebruikt voor de geautomatiseerde visualisatieprotocollen, die de RNA-integriteit in gevaar lijken te brengen. Erkennen dat een geautomatiseerd etiketteringsprotocol voor visualisatiemarkers kan worden gebruikt voor ruimtelijke proteomics-assays, maar niet voor ruimtelijke transcriptomics-assays, biedt belangrijke richtlijnen voor Spatial Omics-technologietestontwerpen.
Bovendien toont de studie aan dat de ruimtelijke transcriptomics-test kan worden gebruikt om doelen te profileren in regio's met een diameter van slechts 50 μm, of ongeveer 15 cellen. Twee ROIs van verschillende grootte werden geselecteerd om het vermogen van de test te testen om ook transcripties in kleine ROI's te detecteren. Voor elke interesseregio werden oligo's die overeenkomen met 1.800 mRNA-doelen verzameld en in bibliotheken gemaakt volgens het protocol van het spatial profiling platform. Bibliotheken werden individueel geïndexeerd, vervolgens gepoold en gesequenced. Dit maakte de evaluatie mogelijk van zowel de pooling-efficiëntie als het vermogen om specifieke celpopulaties in kleine ROI's te identificeren.
Dit artikel toont aan dat voor ruimtelijke proteomics-assays een geautomatiseerd protocol om ROI-selectie op specifieke markers van belang te begeleiden, kan worden gebruikt om selectief de ondervraging van relevante weefselgebieden te richten en de ruimtelijke omgeving van het weefsel te karakteriseren. Verder tonen we aan dat kleinere ROIs kunnen worden gebruikt voor ruimtelijke transcriptomische assays om specifieke celpopulaties te detecteren en te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menselijke weefsels werden verkregen van commerciële biobanken of geaccrediteerde weefselbanken onder garantie dat de juiste goedkeuring en geïnformeerde toestemming van de Institutional Review Board werden verkregen.
OPMERKING: Het protocol wordt uitgevoerd met behulp van de Discovery Ultra en de GeoMx Digital Spatial Profiler. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Geautomatiseerd visualisatieprotocol voor ruimtelijke proteomics-assays
- Programma autostainer om fluorescerende visualisatie antilichamen toe te passen
- Klik in de autostainer software op de homeknop en kies Protocollen. Klik vervolgens op Protocollen maken /bewerken en selecteer RUO DISCOVERY Universal als de procedure.
- Klik op First Sequence > Deparaffinization > Depar v2. Kies voor Gemiddelde temperatuur 72 graden C, klik vervolgens op Voorbehandeling en selecteer Celconditionering en CC1 Reservoir. Kies voor Zeer hoge temperatuur 100 graden C, klik vervolgens op CC1 8 Min en klik verder totdat CC1 64 Min is geselecteerd.
- Klik op Inhibitor > DISCOVERY Inhibitor en kies voor Incubatietijd 8 Minuten. Klik vervolgens op Antibody > High Temp Ab Incubation; kies voor Lage temperatuur 37 ° C; kies voor Antilichaam het antilichaamnummer op het etiket van de dispenser (Antilichaam 6 in dit voorbeeld); selecteer voor Plus Incubatietijd 32 minuten.
OPMERKING: Dit protocol heeft drie verschillende antilichaamnummers. Het eerste antilichaam is FAP, het tweede is Pan-Cytokeratine en het derde is Antilichaam X. - Klik op Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, kies vervolgens voor Antibody Blocking gt Ig Block en kies voor Incubatietijd 4 Minuten. Selecteer vervolgens in Multimer HRP Reagentia OMap anti-Rb HRP en kies voor Incubatietijd 16 minuten. Klik vervolgens op Cy5 en kies voor Lange incubatietijd 0 uur 8 min.
- Klik op Dual Sequence en kies Antibody Denaturation, selecteer vervolgens Antibody Denature CC2-1 en kies voor Very High Temperature 100 Deg C. Zorg ervoor dat de incubatietijd 8 min is. Klik vervolgens op DS Inhibitor en selecteer Neutraliseren.
- Klik op DS Antibody en kies voor Very Low Temperature 37 Deg C. Kies vervolgens in Antilichaam het antilichaamnummer op het etiket van de dispenser (Antilichaam 3 in dit voorbeeld) en selecteer voor Plus Incubatietijd 32 minuten.
- Klik op DS Multimer HRP en kies DS Multimer HRP Blocker. Selecteer vervolgens voor Antilichaamblokkering de optie Gt Ig-blok en kies voor Incubatietijd 4 minuten. Selecteer vervolgens op Multimer HRP-reagens OMap anti-Ms HRP en kies voor Incubatietijd 16 minuten. Klik vervolgens op DS Rhodamine 6G en kies voor Lange incubatietijd 0 uur 8 min.
- Klik op Triple Stain en selecteer TS Antibody Denaturation, selecteer vervolgens Antibody Denature CC2-2 en selecteer voor Very High Temperature 100 Deg C. Zorg ervoor dat de incubatietijd 8 min is. Klik vervolgens op TS Inhibitor en selecteer TS Neutralize.
- Klik op TS-antilichaam en selecteer voor Zeer lage temperatuur 37 °C. Selecteer vervolgens in Antilichaam het antilichaamnummer op het etiket van de dispenser (Antilichaam 7 in dit voorbeeld) en selecteer voor Plus Incubatietijd 32 minuten.
- Klik op TS Multimer HRP en kies TS Multimer HRP Blocker. Selecteer vervolgens voor Antilichaamblokkering de optie Gt Ig-blok en kies voor Incubatietijd 4 minuten. Selecteer vervolgens in Multimer HRP Reagentia OMap anti-Rb HRP en kies voor Incubatietijd 16 minuten. Klik vervolgens op TS FAM en kies voor Lange incubatietijd 0 uur 8 min.
- Voeg een titel toe aan het protocol. Selecteer een protocolnummer, voeg een opmerking toe en klik op Actief gevolgd door Opslaan.
- Dia's voorbereiden, etiketten afdrukken en de autostainerrun starten
- Bakverkoper kocht FFPE (Formaline-fixed, paraffine-embedded) menselijke weefselsecties in een oven op 70 °C gedurende 20-60 min. Terwijl dia's worden gebakken, drukt u etiketten af door te klikken op Label maken in de autostainer-software. Klik vervolgens op Protocollen, selecteer het protocolnummer en klik op Sluiten/Afdrukken. Voeg relevante informatie toe aan het dialabel en klik op Afdrukken.
- Haal dia's uit de oven en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur (RT). Pas de eerder afgedrukte protocollabels toe op de bijbehorende dia's.
- Laad navulbare antilichaamdispensers met antilichamen volgens het antilichaamlabelnummer dat in stap 1.1 is toegewezen. Gebruik in dit protocol antilichaam 6 voor FAP bij 1 μg/ml, gebruik antilichaam 3 voor pancytokeratine bij 0,1 μg/ml en gebruik antilichaam 7 voor antilichaam X bij 2,5 μg/ml. Verdun elk antilichaam in het opgegeven verdunningsmiddel en primeer de navulbare antilichaamdispensers.
- Verzamel de hierboven genoemde voorgevulde reagensdispensers voor blokkering, detectie en versterking en plaats ze op een reagenslade. Laad dia's in de dialades (tot 30 dia's per run) en klik op Running gevolgd door Yes. Merk op dat DAPI niet wordt gebruikt voor nucleaire counterstaining.
- Bevestig het begin van de run door de looptijd van de autostainer-software te controleren. Het protocol duurt ~ 11 uur voor voltooiing en kan 's nachts worden uitgevoerd.
- Zorg er de volgende dag voor dat de run wordt voltooid door groene knipperende lampjes op de schuifladesleuven te observeren. Haal vervolgens de dia's van het instrument en spoel de dia's krachtig af in 1x reactiebuffer totdat de vloeibare coverslipoplossing volledig is verwijderd.
- Ruimtelijk profileringsplatformprotocol voor proteomics-assay
- Volg het ruimtelijke proteomics-protocol dat in de onderstaande notitie wordt aangegeven. Neem de volgende wijzigingen in het protocol op om de geautomatiseerde labelingprocedure met 3 plexen in te schakelen.
- Voer stap 1.2.1-1.2.6 uit de dag voordat u het ruimtelijke proteomics-protocol start en ga direct naar de antigeen ophaalstap van het ruimtelijke proteomics-protocol na het uitvoeren van stap 1.2.6. Laat de visualisatieprocedure weg die wordt beschreven in het proteomics-protocol voor ruimtelijke profilering.
- Vervang SYTO 13 door SYTO 64 bij 5000 nM om fluorofoorintegratie mogelijk te maken. Verdun SYTO 64 in 1x TBS en incubeer gedurende 15 minuten in een vochtigheidskamer.
- Selecteer bij het instellen van de scanparameters in het ruimtelijke profileringsplatform de filters en scherpstelkanalen op basis van de fluoroforen die in het visualisatiepaneel worden gebruikt om 3-plex-integratie mogelijk te maken. Gebruik FITC voor DISCOVERY FAM en stel de blootstelling in op 200 ms, gebruik Cy3 voor DISCOVERY Rhodamine 6G en stel de blootstelling in op 200 ms, gebruik Texas Red voor SYTO 64 en stel de blootstelling in op 50 ms (specificeer dit als het focuskanaal) en gebruik ten slotte Cy5 voor DISCOVERY Cy5, stel de blootstelling in op 200 ms, en sla wijzigingen op.
OPMERKING: Gedetailleerde instructies van het proteomics-protocol voor ruimtelijke profilering zijn te vinden op het tabblad Ondersteuning van de officiële website door Documentatie > gebruikershandleidingen te selecteren. Zoek hier naar het eiwitprotocol voor nCounter met Bond RX.
2. ROI-selectie voor ruimtelijke transcriptomics-assays
- Bak FFPE cel pellet secties in een oven ingesteld op 70 °C gedurende 20-60 min. Volg het NGS-protocol van het ruimtelijke profileringsplatform dat in de onderstaande notitie wordt aangegeven en scan dia's op het ruimtelijke profileringsplatform, waarbij maten van 50 μm en 300 μm worden geselecteerd. De volgende aanbeveling wordt benadrukt voor de ruimtelijke transcriptomics-test:
- Als bij het voorbereiden van de bibliotheek verschillende formaten ROI's zijn geselecteerd, verzamelt u ROIs van vergelijkbare grootte om één bibliotheek per grootte te maken. Dit is om ervoor te zorgen dat voldoende sequencingdieptes worden bereikt voor alle ROI's zonder vertekening van de grootte.
OPMERKING: Gedetailleerde instructies van het ruimtelijke profileringsplatform zijn te vinden op het officiële tabblad Ondersteuning van de website door Documentatie > gebruikershandleidingen te selecteren. Zoek hier naar het RNA-protocol voor NGS-toepassingen met Bond RX.
- Als bij het voorbereiden van de bibliotheek verschillende formaten ROI's zijn geselecteerd, verzamelt u ROIs van vergelijkbare grootte om één bibliotheek per grootte te maken. Dit is om ervoor te zorgen dat voldoende sequencingdieptes worden bereikt voor alle ROI's zonder vertekening van de grootte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geautomatiseerd visualisatieprotocol om ROI-selectie te begeleiden
In dit artikel presenteren we het gebruik van een geautomatiseerd, aangepast TSA-gebaseerd IF-protocol om het weefsel te visualiseren en specifieke ROI's te selecteren. De ontwikkeling van visualisatiepanels met behulp van melanoom en de menselijke normale huid als controleweefsels bestond uit epitoopstabiliteitstests, fijnafstemming van markerintensiteiten en bleedthrough-beoordeling door één uit controles weg te laten. Om te testen of de epitoopstabiliteit van de antilichamen wordt beïnvloed door repetitieve elutiestappen, werden FAP- en Antilichaam X-signalen kwalitatief beoordeeld na etikettering in elke positie van het 3-plex. Het antilichaam X-signaal bleef consistent in alle posities, terwijl de FAP-signaalintensiteit na één elutie afnam (figuur 2). Eerdere interne studies toonden aan dat de panCK-epitoop stabiel is gedurende een 3-plex-test. Daarom werd FAP gekozen om op de1e positie in de 3-plex te staan, panCK werd in de2e en Antibody X in de3e positie geplaatst. Omdat het FAP-signaal over het algemeen zwakker was in vergelijking met Antibody X en panCK, werd FAP gekoppeld aan de helderdere fluorofoor Cy5.
De geautomatiseerde 3-plex werd geoptimaliseerd met leave one out-bedieningselementen, waarbij elke marker eenmaal uit het 3-plex-protocol werd weggelaten om te bevestigen dat er geen doorbloeding was in naburige kanalen (figuur 3).
De fluoroforen die op het geautomatiseerde kleuringsplatform worden gebruikt, zijn getest op het ruimtelijke profileringsplatform om te bevestigen dat de filters compatibel zijn met de TSA-fluoroforen in het 3-plex visualisatiepaneel. Aangezien het 3-plex-protocol FITC, Cy3 en Cy5 gebruikt en het DAPI-kanaal wordt gebruikt voor UV-splitsing op het ruimtelijke profileringsplatform, moest een nucleaire counterstain in het Texas Red-kanaal worden gebruikt. Twee verschillende nucleaire kleurstoffen, SYTO 59 en SYTO 64, werden getest en de kleurstoffen vertoonden een duidelijk nucleair signaal in colonweefsels. SYTO 59 vertoonde echter ook een bloedingssignaal in het Cy5-kanaal, terwijl het Cy5-kanaal schoon was bij gebruik van SYTO 64 (figuur 4). Daarom was SYTO 64 de voorkeurskeuze voor nucleaire detectie.
Verdere tests van SYTO 64 toonden aan dat deze kleurstof niet fotoleesbaar was en snel fotobleekte tijdens beeldvorming. Zodra het signaal is gebleekt, richt het beeldvormingssysteem zich op de achtergrond, die kan worden geïnterpreteerd als een niet-specifiek signaal (figuur 5). Het verhogen van de concentratie van de nucleaire kleurstof om de signaalintensiteit te verhogen, hielp dit probleem te minimaliseren.
Weefsels gelabeld met het panCK/CD45 handmatige visualisatieprotocol, dat direct geconjugeerde antilichamen gebruikt, werden vergeleken met weefsels die waren gelabeld met het panCK / FAP / Antibody X geautomatiseerde aangepaste visualisatieprotocol. Beide protocollen delen panCK als een gemeenschappelijke marker en het signaal was vergelijkbaar tussen de twee protocollen (figuur 6).
Om ervoor te zorgen dat een aangepast visualisatieprotocol geen invloed heeft op de upstream ruimtelijke proteomics-test, hebben we de telwaarden vergeleken die zijn verkregen na spatial profiling platform-verzameling en counting platform-verwerking bij gebruik van het panCK / CD45 handmatige visualisatieprotocol. Dit maakt gebruik van direct geconjugeerde antilichamen of het 3-plex geautomatiseerde aangepaste visualisatieprotocol, dat TSA gebruikt. Vier colorectale kanker (CRC) weefsels werden gelabeld met het panCK/CD45 handmatige visualisatieprotocol of het 3-plex geautomatiseerde aangepaste visualisatieprotocol in combinatie met de ruimtelijke proteomics-test. Vergelijkbare ROI's werden gekozen voor elk protocol en telgegevens van de bijbehorende ROI's werden vergeleken met behulp van huishoudnormalisatie voor S6 en Histone. Vergelijkbare trends werden waargenomen tussen deze ROIs zoals weergegeven in de log2 heatmap (figuur 7A), met een Spearman R-waarde van 0,88 voor alle markers die zijn opgenomen in de ruimtelijke proteomics-test (figuur 7B). Van de 31 antilichamen die in de testen werden gebruikt, hadden 23 antilichamen een Spearman R-waarde hoger dan of gelijk aan 0,5.
Omdat ruimtelijke proteomics en transcriptomische protocollen verschillen, hebben we geëvalueerd of het geautomatiseerde visualisatieprotocol ook kan worden toegepast op ruimtelijke transcriptomics-assays. Het geautomatiseerde visualisatieprotocol vereist dat de IHC-test wordt uitgevoerd vóór RNA-detectie, terwijl het oorspronkelijke handmatige protocol eerst RNA detecteert voordat het visualisatieprotocol wordt toegepast. Het 3-plex geautomatiseerde visualisatieprotocol werd naast het CK/CD45 handmatige visualisatieprotocol getest in combinatie met de ruimtelijke transcriptomics-test. Sequencinggegevens voor het 3-plex geautomatiseerde visualisatieprotocol Quartile 3 count (Q3), genormaliseerd op de ruimtelijke profileringssoftware, presenteerden lagere waarden in vergelijking met het CK / CD45 handmatige visualisatieprotocol (figuur 8A), wat ook wordt weerspiegeld door de lage Spearman R-waarden van 0,15 (figuur 8B). Ook werd een verlies van dynamisch bereik waargenomen bij het gebruik van het 3-plex visualisatie geautomatiseerde protocol (figuur 8C).
Dit verlies van tellingen met het geautomatiseerde visualisatieprotocol geeft aan dat dit protocol de RNA-integriteit in gevaar brengt en dat het detecteren van het RNA voorafgaand aan het uitvoeren van de visualisatietest noodzakelijk is om de RNA-kwaliteit te behouden. Aangezien dit geautomatiseerde visualisatiepaneel vereist dat het eiwitgedeelte wordt uitgevoerd voorafgaand aan RNA-detectie, is dit protocol niet geschikt voor RNA-assays.
Grootte van ROI-selectie in ruimtelijke transcriptomics-assays
Om de impact van roi-grootte op RNA-gegevensuitvoer beter te begrijpen, werden RNA-tellingen van verschillende grootte-ROI's vergeleken. De ruimtelijke transcriptomics-test werd uitgevoerd op SUDHL1- en JURKAT-cellijnen om verschillen die inherent zijn aan weefsels te minimaliseren. Circulaire ROI's met een diameter van 50 μm en 300 μm werden geselecteerd en met elkaar vergeleken met behulp van Q3-normalisatie op de ruimtelijke profileringssoftware. RNA-tellingen voor geselecteerde doelen op verschillende cellijnen waren vergelijkbaar tussen de twee ROI-groottes na normalisatie (figuur 9A, B).
Figuur 1: Digitale ruimtelijke profileringsworkflow. (A) Dia's worden gelabeld met antilichamen (spatial proteomics assay) of probes (spatial transcriptomics assay) en visualisatiemarkers. (B) Dia's worden op het ruimtelijk profileringsplatform geplaatst om ROIs in beeld te brengen en te selecteren. (C) Oligo's worden gesplitst door UV-licht en verzameld in een plaat met 96 putten. Dit proces wordt herhaald voor elke geselecteerde ROI. (D) De monsters worden verwerkt en gegevens worden gegenereerd met behulp van het telplatform of een sequencer. Dit cijfer is aangepast van Nanostring technologies website 4,5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Epitoopstabiliteit. (A-C) Antilichaam X en (D-F) FAP getest op respectievelijk de menselijke normale huid en melanoom. Elke marker in de (A,D) 1st, (B,E) 2nd en (C,F) 3rd positie van een 3-plex. Antilichaam X is stabiel in alle posities, terwijl (D) FAP een afnemende signaalintensiteit vertoont na respectievelijk (E-F) één en twee elties. Antilichaam X in groen, FAP in rood, DAPI in grijs. Schaalbalken zijn op 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Laat één controle weg voor het 3-plex geautomatiseerde aangepaste visualisatieprotocol op menselijke pancreasweefsels. Voor alle afbeeldingen wordt Antilichaam X weergegeven in groen, panCK in cyaan en FAP in rood. De eerste rij toont de (A) 3-plex en de enkele kanalen voor (B) Antilichaam X in FITC, (C) panCK in Cy3 en (D) FAP in Cy5. De tweede rij toont de leave one out control 3-plex voor (E) Antibody X en (F-H) de enkele kanalen voor elke marker. De derde rij toont de leave one out control 3-plex voor (I) panCK en (J-L) de enkele kanalen voor elke marker. De vierde rij toont de leave one out control 3-plex voor (M) FAP en (N-P) de enkele kanalen voor elke marker. Er werd geen bleedthrough waargenomen in een van de leave one out-controles, zoals aangegeven door gebrek aan signaal in de overeenkomstige kanalen bij tests (F) zonder FAP, (K) zonder panCK en (P) zonder Antibody X. Schaalbalken zijn 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: SYTO-kleurstoftesten. Texas Red-kanaal geeft het nucleaire signaal weer in Colon voor (A) SYTO 59 met doorbloeding in (B) Cy5-kanaal (rood). Texas Red kanaal toont het nucleaire signaal in Colon voor (D) SYTO 64 zonder bloeding in (E) Cy5 kanaal. Texas Red- en Cy5-kanalen in Colon worden samen weergegeven om (C) bleedthrough van SYTO 59 en (F) geen bleedthrough voor SYTO 64 weer te geven. Schaalbalken zijn op 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: SYTO 64 fotostabiliteit. Colonmonsters gelabeld met SYTO 64 (A) voor en (B) na fotobleaching. Afbeelding B toont het niet-specifieke signaal dat zichtbaarder wordt na nucleair signaalverlies. Schaalbalken zijn op 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Vergelijking van panCK-etikettering. panCK-signaal op colorectale kanker (CRC) monsters met (A) panCK/CD45 handmatig visualisatieprotocol en (B) panCK/FAP/Antibody X geautomatiseerd visualisatieprotocol. Er werden geen verschillen in panCK-signaal waargenomen tussen de twee protocollen. Schaalbalken zijn op 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Vergelijking van telwaarden voor de ruimtelijke proteomics-test met behulp van twee verschillende visualisatieprotocollen op vergelijkbare ROI's van vier CRC-weefsels. (A) Log 2 Heatmap van alle markers die zijn opgenomen in de ruimtelijke proteomics-test waarbij het handmatige panCK / CD45-protocol (zwart) wordt vergeleken met het geautomatiseerde 3-plex-protocol (grijs). (B) Log 2 Spearman correlatie voor alle markers heeft een R-waarde van 0,88. Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism 7 Software of met Python programmeertaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Vergelijking van telwaarden voor de ruimtelijke transcriptomics-test met behulp van twee verschillende visualisatieprotocollen. (A) Log 2 Heatmap van geselecteerde doelen die zijn opgenomen in de ruimtelijke transcriptomics-test waarbij het handmatige panCK/CD45-protocol (zwart) wordt vergeleken met het 3-plex geautomatiseerde protocol (grijs). (B) Log 2 Spearman correlatie voor alle markers heeft een R-waarde van 0,15. (C) Het gemiddelde (blauw) en de standaarddeviatie waarbij het dynamisch bereik verloren gaat in het 3-plex geautomatiseerde protocol. Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism 7 Software of met Python programmeertaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Vergelijking van RNA-telwaarden voor de ruimtelijke transcriptomics-test op celpellets. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen voor 50 μm (zwart) en 300 μm (grijs) diameter ROI's voor geselecteerde doelen op (A) SUDHL1 en (B) JURKAT-cellijnen. Er werd geen significant verschil waargenomen met behulp van t-test. Gemiddelde en standaarddeviatie weergegeven voor n = 3 ROIs per grootte. Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism 7 Software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tot op heden worden direct geconjugeerde fluorescerende antilichamen in een handmatig protocol het meest gebruikt als visualisatiepanelen voor ruimtelijke proteomics of ruimtelijke transcriptomics-assays 9,10. Het gebruik van direct geconjugeerde fluorescerende antilichamen kan echter een uitdaging zijn voor minder overvloedige markers, waardoor de selectie van geschikte antilichamen wordt beperkt. Dit protocol laat zien dat het labelen van visualisatiemarkers kan worden geautomatiseerd op een geautomatiseerd kleuringsplatform met behulp van TSA-technologieën om ruimtelijke proteomics-assays te ondersteunen. Dit zorgt voor meer flexibiliteit bij het aanpassen van visualisatiepanelen, wat een meer gerichte ROI-selectie en verwerving van relevante biologische gegevens uit specifieke delen van een weefsel mogelijk maakt. TSA-technologie maakt ook de visualisatie van markers met een lage abundantie mogelijk en verhoogt daardoor het aantal potentieel geschikte antilichamen. Bovendien zorgt automatisering van het visualisatieprotocol voor reproduceerbaarheid en kwaliteit van de etiketteringsprocedure.
Het ontwikkelen van een 3-plex IF-test vereist een zorgvuldige beoordeling van marker / fluorofoorsignaalintensiteiten op geschikte controleweefsels. Het wordt aanbevolen om antilichaamconcentraties te titreren om de beste signaal-ruisverhouding te verkrijgen, wat zal helpen om doorbloeding in aangrenzende kanalen te minimaliseren. Bovendien moet de stabiliteit van epitoop voor elke marker van belang worden getest om ervoor te zorgen dat het epitoop niet wordt beïnvloed door herhaalde elutiestappen. Zodra de volgorde van antilichamen in het panel is bevestigd, moet de test worden verfijnd met behulp van leave one out-controles. Hier wordt een specifieke markering weggelaten in het deelvenster en wordt het bijbehorende kanaal in de verkregen afbeelding beoordeeld op bleedthrough en cross-talk.
Hier werd aangetoond dat op TSA gebaseerde assays kunnen worden afgebeeld op het spatial profiling platform, en dat DAPI-alternatieven moeten worden gebruikt voor nucleaire kleuring. We hebben SYTO-kleurstoffen getest en vastgesteld dat bij het beslissen welke SYTO-kleurstof te gebruiken, het signaal zorgvuldig moet worden beoordeeld om bloeding in aangrenzende kanalen te voorkomen. Een andere beperking van het gebruik van SYTO-kleurstoffen is dat sommige SYTO-kleurstoffen sneller fotobleken, zoals SYTO 64 en SYTO 83 (interne gegevens), wat van invloed kan zijn op nucleaire kwantificering. Daarom moet blootstelling aan licht van de gekleurde dia's zoveel mogelijk worden vermeden. Andere groepen hebben het gebruik van SYTO 1311,12 aangetoond, dat meer fotostabiel is (interne gegevens) en in een paneel kan worden gebruikt zolang de markers van belang worden toegewezen aan fluoroforen die compatibel zijn met de nucleaire kleurstof van keuze.
Hoewel geautomatiseerde TSA-gebaseerde fluorescerende assays goed werkten voor visualisatie in combinatie met ruimtelijke proteomics-assays, werd hier vastgesteld dat het combineren van een 3-plex geautomatiseerd visualisatieprotocol met een ruimtelijk transcriptomics-protocol resulteerde in verlies van dynamisch bereik, wat te wijten zou kunnen zijn aan de zwaardere protocolomstandigheden van het toevoegen van extra antigeen ophaal- / elutiestappen die de RNA-integriteit kunnen beïnvloeden. Daarom moet het 3-plex geautomatiseerde visualisatieprotocol alleen worden aangepast voor proteomics-assays, wat een beperking is en alternatieve visualisatiebenaderingen vereist voor op RNA gebaseerde assays. Als alternatief voor visualisatie van dezelfde dia kunnen seriële secties met interessante markeringen worden bedekt om ROI-selectiete vergemakkelijken 13. Daarnaast beschrijft de literatuur het gebruik van in situ hybridisatie op aangrenzende dia's om ROI-selectie te begeleiden14. Deze benaderingen kunnen echter worden beperkt door weefselbeschikbaarheid, sectie-tot-sectie variabiliteit en cel-tot-cel registraties.
We hebben ook de bruikbaarheid van verschillende ROI-groottes getest voor ruimtelijke transcriptomics-assays. Het gebruik van kleine ROI's van 50 μm stelt de onderzoeker in staat om gegevens van specifieke regio's te verkrijgen, waardoor een meer gedetailleerde uitlezing van geselecteerde cellen of interessegebieden mogelijk is. Beperkingen bij het selecteren van kleine ROI's zijn dat het aantal aanwezige cellen mogelijk niet overvloedig genoeg is om telwaarden te krijgen die van de achtergrond kunnen worden onderscheiden. Een optie is om zuivere celpopulaties te selecteren om minder overvloedige doelen te vangen. De ROI-selectie voor afzonderlijke cellen wordt echter beperkt door een hoge signaal-ruisverhouding15. Bovendien is het belangrijk om rekening te houden met ROI-groottes voor bibliotheekvoorbereiding als ROIs van verschillende groottes in één experiment worden verzameld. Als de ROI-grootte aanzienlijk verschilt, kan het nuttig zijn om ROI's te poolen op basis van hun grootte en afzonderlijke bibliotheken te bouwen om te voorkomen dat grote ROI's oververtegenwoordigd zijn in één bibliotheek. Dit zal er ook voor zorgen dat elke ROI voldoende sequencingdekking krijgt op basis van de grootte.
Andere factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van Spatial Omics-experimenten zijn dat de gegevens variaties kunnen vertonen als gevolg van slide-to-slide variabiliteit, en lagere expressie van bepaalde doelen kan achtergrond- en verschillen in correlatiewaarden oproepen. Adequate controles en normalisatiebenaderingen moeten worden overwogen bij het plannen van experimenten en het evalueren van gegevens. Voor ruimtelijke proteomics-assays op nCounter zijn normaliseren naar huishoudelijke doelen of naar de negatieve controle-IgG's de voorkeursmethoden op basis van interne ervaring en aanbevelingen van leveranciers waarbij de correlatie tussen de huishoudelijke doelen of de negatieve controle-IgG's moet worden geëvalueerd16. Afhankelijk van de gebruikte weefsels moet echter voor elk onderzoek de beste normalisatie worden gedefinieerd17,18. In de literatuur staat bijvoorbeeld dat gapdh, dat vaak wordt gebruikt voor het normaliseren naar huishoudelijke doelen, voor borstkanker ruimtelijke omics-studies minder concordant is geweest dan S6 en Histone19. Daarom zijn S6 en Histone de aanbevolen huishoudelijke doelen geweest voor normalisatie in borstkankerweefsels19.
Voor ruimtelijke transcriptomics-assays moeten normalisatiestrategieën worden gedefinieerd afhankelijk van de onderzoeksopzet (bijv. Weefseltypen en ROI-selectie). Sommige strategieën die worden gebruikt in RNA-Seq, zoals normalisatie van het bovenste kwartiel of het bijgesneden gemiddelde van M-waarden (TMM), kunnen worden toegepast om gesequencede gegevens te normaliseren19,20.
Ruimtelijke transcriptomics-assays bieden informatie over duizenden doelen en worden steeds vaker gebruikt om het hele transcriptoom te verkennen, waarbij specifieke TME-compartimenten worden geselecteerd en geanalyseerd in combinatie met single-nucleus RNA-seq20 of single-cell RNA-sequencing21. We hebben aangetoond dat visualisatieprotocollen om ROI-selectie te begeleiden om de ruimtelijke verdeling van doelen te beoordelen, kunnen worden geautomatiseerd voor ruimtelijke proteomics-assays, maar niet voor ruimtelijke transcriptomics-assays. Daarnaast presenteren we dat ROIs zo klein als 50 μm kunnen worden geselecteerd om een diepgaander onderzoek van een bepaald weefselgebied mogelijk te maken. Toekomstige toepassingen van deze technologie zullen het begrip van de micro-omgeving van de tumor verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan en Sandra Rost zijn werknemers en aandeelhouders van Genentech, een lid van de Roche Group. Andere bedrijven die deel uitmaken van Roche produceren reagentia en instrumenten die in dit manuscript worden gebruikt. Ciara Martin is een fulltime medewerker van NanoString Technologies Inc, dat reagentia en instrumenten produceert die in dit manuscript worden gebruikt.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Thomas Wu voor het verwerken van NGS-bestanden. We bedanken James Ziai voor de resultatendiscussies en manuscriptbeoordeling en Meredith Triplet en Rachel Taylor voor interne manuscriptrevisie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
