Summary
ここでは、腫瘍微小環境をより適切に特徴付け、特定の細胞集団を特定するために、空間オミクス技術の関心領域(ROI)を微調整するためのプロトコルについて説明します。プロテオミクスアッセイでは、カスタマイズされたプロトコルを自動化してROIを選択し、トランスクリプトミクスアッセイでは50 μmのROIを利用して微調整することができます。
Abstract
多重化により、空間コンテキストを提供しながら、同じ組織上の複数のマーカーを評価できます。空間オミクス技術は、光切断可能なオリゴタグ付き抗体とプローブをそれぞれ活用することにより、タンパク質とRNAの両方のマルチプレックスを可能にします。オリゴは、組織全体の特定の領域から切断および定量化され、基礎となる生物学を解明します。ここで、この研究は、自動化されたカスタム抗体視覚化プロトコルを利用して、空間プロテオミクスアッセイと組み合わせてROI選択をガイドできることを示しています。この特定の方法は、空間トランスクリプトミクスアッセイで許容できる性能を示さなかった。このプロトコルでは、チラミドシグナル増幅(TSA)を使用して特定のタンパク質ターゲットからの蛍光シグナルを増幅し、選択する抗体プールを増やす、自動プラットフォームでマーカーを視覚化するための3-plex免疫蛍光(IF)アッセイの開発について説明しています。可視化プロトコルは、品質と再現性を確保するために、徹底的に検証された3プレックスアッセイを使用して自動化されました。さらに、DAPIとSYTO色素の交換を評価して、空間プロファイリングプラットフォームでTSAベースのIFアッセイをイメージングできるようにしました。さらに、空間トランスクリプトミクスアッセイを使用して小さなROIを選択する能力をテストし、高度に特異的な関心領域(特定の細胞タイプに富む領域など)の調査を可能にしました。直径50 μmと300 μmのROIを収集し、これはそれぞれ約15細胞と100細胞に相当します。サンプルをライブラリにして配列決定し、組織の小さなROIおよびプロファイル特異的領域からのシグナルを検出する能力を調査しました。私たちは、空間プロテオミクス技術がROI選択を導くための自動化された標準化されたプロトコルから大きな恩恵を受けることを決定しました。この自動可視化プロトコルは空間トランスクリプトミクスアッセイと互換性がありませんでしたが、標準的な手動可視化プロトコルを使用すると、小さなROIでも特定の細胞集団を正常に検出できることをテストし、確認することができました。
Introduction
マルチプレックス技術の進歩は、腫瘍に存在する標的に対してより優れた特性評価ツールを提供し続けています。腫瘍微小環境(TME)は、腫瘍細胞、浸潤免疫細胞、および間質の複雑なシステムであり、空間情報は、関心のあるバイオマーカー間の相互作用のメカニズムをよりよく理解および解釈するために重要です1。GeoMxデジタル空間プロファイラー(DSP)や10x Visiumなどの新しい技術により、複数のターゲットを空間コンテキスト内で同時に検出および定量化できます。組織の可視化を容易にする免疫蛍光プロトコルを使用すると、これらの技術の空間プロファイリング機能をさらに向上させることができます。
本手法開発で着目した空間オミクス技術は、UV感受性光分解性リンカーを介してオリゴヌクレオチドを抗体やRNAプローブに結合させる空間プロテオミクスやトランスクリプトミクスアッセイです。組織学的スライドは、これらのオリゴ結合抗体またはプローブで標識され、空間プロファイリングプラットフォームで画像化されます。次に、さまざまなサイズと形状のROIを照明用に選択し、光切断されたオリゴヌクレオチドを吸引して96ウェルプレートに収集します。光切断されたオリゴヌクレオチドは、ナノストリングnCounterシステムまたは次世代シーケンシング(NGS)2,3のいずれかで定量できるように調製されます(図1)4,5。
細胞分布は組織内で異なり、選択されたマーカーと異なるROIサイズを使用して細胞の特定の位置を特徴付ける能力は、組織環境を完全に理解し、特定の特徴を特定するために非常に重要です。ここで言及した空間オミクス技術では、標準的な可視化プロトコルは直接結合抗体を使用し、手動プロトコルです。腫瘍と間質を区別するための標準マーカーは、パンサイトケラチン(panCK)およびCD45 6,7ですが、目的の特定の細胞集団を標的とするには、追加のマーカーが必要です。さらに、直接結合した蛍光抗体の使用は増幅を欠いており、抗体の選択が豊富なマーカーに限定されています。さらに、手動アッセイは、自動化されたワークフローよりもばらつきが大きくなります8。したがって、ROI選択のために、カスタマイズ可能で、自動化され、増幅された視覚化プロトコルを有することが望ましい。
ここで、この研究は、空間プロテオミクスアッセイの場合、TSAテクノロジーを自動化されたプラットフォームでの視覚化プロトコルに使用でき、よりターゲットを絞った標準化されたアッセイを実現できることを示しています。さらに、TSAベースのアッセイでは、低発現マーカーの使用が可能になり、可視化のために選択できるターゲットの範囲が広がります。panCK、FAP、および抗体Xの3プレックスアッセイは、panCKおよびFAPを使用して腫瘍と間質をそれぞれ区別する自動化されたプラットフォームを使用して開発されました。抗体Xは腫瘍で頻繁に遭遇する間質タンパク質ですが、その生物学と抗腫瘍免疫への影響は完全には理解されていません。抗体Xが豊富な領域における免疫コンテクスチャーの特性評価は、抗腫瘍免疫および治療反応におけるその役割、ならびに創薬標的としてのその可能性を解明することができる。
カスタマイズされた自動TSA可視化パネルは、空間プロテオミクスアッセイで成功することが証明されましたが、空間トランスクリプトミクスアッセイへのこれらのアッセイの適用は確認できませんでした。これは、RNAの完全性を損なうと思われる自動可視化プロトコルに使用される試薬とプロトコルが原因である可能性が最も高いです。可視化マーカーの自動標識プロトコルは、空間プロテオミクスアッセイには使用できるが、空間トランスクリプトミクスアッセイには使用できないことを認識することで、空間オミクス技術のアッセイ設計に関する重要なガイダンスを提供します。
さらに、この研究は、空間トランスクリプトミクスアッセイを使用して、直径50μmの領域(約15細胞)のターゲットをプロファイリングできることを実証しています。小さなROIの転写物も検出するアッセイの能力をテストするために、2つの異なるサイズのROIを選択しました。各関心領域について、1,800 mRNAターゲットに対応するオリゴを収集し、空間プロファイリングプラットフォームプロトコルに従ってライブラリにしました。ライブラリは個別に索引付けされ、その後プールされ、順序付けられました。これにより、プーリング効率と、小さなROIで特定の細胞集団を特定する能力の両方を評価することができました。
この論文は、空間プロテオミクスアッセイの場合、関心のある特定のマーカーのROI選択をガイドする自動プロトコルを使用して、関連する組織領域の調査を選択的に標的化し、組織の空間環境を特徴付けることができることを示しています。さらに、より小さなROIを空間トランスクリプトームアッセイに使用して、特定の細胞集団を検出および特性評価できることを実証します。
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Protocol
すべてのヒト組織は、適切な治験審査委員会の承認とインフォームドコンセントが得られたという保証の下で、商業バイオバンクまたは認定組織バンクから取得されました。
注: このプロトコルは、ディスカバリー ウルトラと GeoMx デジタル空間プロファイラーを使用して実行されます。このプロトコルで使用される試薬、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. 空間プロテオミクスアッセイのための自動可視化プロトコル
- 蛍光可視化抗体を適用するためのプログラムオートステナー
- オートステイナーソフトウェアで、ホームボタンをクリックし、 プロトコルを選択します。次に、[ プロトコルの作成/編集 ]をクリックし、手順として RUOディスカバリーユニバーサル を選択します。
- Depar v2>脱パラフィン化>最初のシーケンスをクリックします。中温の場合は、72°Cを選択し、前処理をクリックして、セルコンディショニングとCC1リザーバーを選択します。[非常に高い温度]の場合は、[100°C]を選択し、[CC1 8分]をクリックして、[CC1 64分]が選択されるまでクリックを続けます。
- ディス カバリー阻害剤>阻害剤をクリックし、[ インキュベーション時間]で [8分]を選択します。次に、抗体 >高温アブインキュベーションをクリックします。 低温の場合は、 37°Cを選択します。[ 抗体] で、ディスペンサーラベルから抗体番号を選択します (この例では抗体 6 )。 [プラスインキュベーション時間] で [32 分] を選択します。
注:このプロトコルには3つの異なる抗体番号があります。最初の抗体はFAP、2番目はパンサイトケラチン、3番目は抗体Xです。 - マルチマーHRP>マルチマーHRPブロッカーをクリックし、抗体ブロッキングでGt Igブロックを選択し、インキュベーション時間で4分を選択します。次に、マルチマーHRP試薬でOMap抗RB HRPを選択し、インキュベーション時間で16分を選択します。次に、Cy5をクリックし、長いインキュベーション時間で0時間8分を選択します。
- デュアルシーケンスをクリックして抗体変性を選択し、次に抗体変性CC2-1を選択し、超高温の場合は100°Cを選択します。インキュベーション時間が8分であることを確認してください。次に、DS阻害剤をクリックし、中和を選択します。
- DS抗体をクリックし、超低温の場合は37°Cを選択します。次に、[抗体] でディスペンサーラベルから抗体番号 (この例では抗体 3) を選択し、[Plus インキュベーション時間] で [32 分] を選択します。
- DS Multimer HRP をクリックし、DS Multimer HRP ブロッカーを選択します。次に、[抗体ブロッキング] で [Gt Ig ブロック] を選択し、[インキュベーション時間] で [4 分] を選択します。次に、マルチマーHRP試薬でOMap抗MSHRPを選択し、インキュベーション時間で16分を選択します。次に、DSローダミン6Gをクリックし、長いインキュベーション時間の場合は0時間8分を選択します。
- トリプルステインをクリックしてTS抗体変性を選択し、次に抗体変性CC2-2を選択し、超高温の場合は100°Cを選択します。インキュベーション時間が8分であることを確認してください。次に、TS阻害剤をクリックし、TS中和を選択します。
- TS抗体をクリックし、超低温の場合は37°Cを選択します。次に、[抗体] でディスペンサーラベルから抗体番号 (この例では [抗体 7]) を選択し、[Plus インキュベーション時間] で [32 分] を選択します。
- TS マルチマー HRP をクリックし、TS マルチマー HRP ブロッカーを選択します。 次に、[抗体ブロッキング] で [Gt Ig ブロック] を選択し、[インキュベーション時間] で [4 分] を選択します。次に、マルチマーHRP試薬でOMap抗RB HRPを選択し、インキュベーション時間で16分を選択します。次に、TS FAMをクリックし、長いインキュベーション時間の場合は、0時間8分を選択します。
- プロトコルにタイトルを追加します。プロトコル番号を選択し、コメントを追加して、[ アクティブ ]、[ 保存]の順にクリックします。
- スライドの準備、ラベルの印刷、オートステインの実行の開始
- ベークベンダーは、FFPE(ホルマリン固定、パラフィン包埋)ヒト組織切片を70°Cに設定されたオーブンで20〜60分間調達しました。スライドのベイク処理中に、オートステインソフトウェアで 「ラベルを作成 」をクリックしてラベルを印刷します。次に、[プロトコル]をクリックし、 プロトコル番号を選択して、[ 閉じる/印刷]をクリックします。スライドラベルに関連情報を追加し、[ 印刷]をクリックします。
- オーブンからスライドを取り出し、室温(RT)まで冷まします。以前に印刷したプロトコル・ラベルを対応するスライドに適用します。
- 詰め替え可能な抗体ディスペンサーに、ステップ1.1で割り当てられた抗体ラベル番号に従って抗体をロードします。このプロトコルでは、FAP用の抗体6を1 μg/mL、パンサイトケラチン用の抗体3を0.1 μg/mL、抗体X用の抗体7を2.5 μg/mLで使用します。各抗体を指定された希釈液で希釈し、詰め替え可能な抗体ディスペンサーをプライミングします。
- 上記のブロッキング、検出、および増幅の事前に充填された試薬ディスペンサーを収集し、試薬トレイに置きます。スライドトレイにスライドをロードし(実行ごとに最大30枚のスライド)、[ 実行 ]、[ はい]の順にクリックします。DAPIは核対比染色には使用されないことに注意してください。
- オートステイナーソフトウェアで実行時間を確認して、実行の開始を確認します。プロトコルは完了するまでに~11時間かかり、一晩実行できます。
- 翌日、スライドトレイスロットの緑色のライトが点滅するのを確認して、実行が完了していることを確認します。次に、スライドを装置から取り出し、液体カバーガラス溶液が完全に除去されるまで、1x反応バッファーでスライドを激しくすすぎます。
- プロテオミクスアッセイのための空間プロファイリングプラットフォームプロトコル
- 以下の注に示されている空間プロテオミクスプロトコルに従ってください。プロトコルに次の変更を含めて、3-plex 自動ラベル付け手順を有効にします。
- 空間プロテオミクスプロトコルを開始する前日に手順1.2.1-1.2.6を実行し、手順1.2.6を実行した後、空間プロテオミクスプロトコルの抗原検索手順に直接移動します。空間プロファイリングプロテオミクスプロトコルで概説されている視覚化手順は省略します。
- SYTO 13を5000 nMのSYTO 64に置き換えて、蛍光色素の統合を可能にします。SYTO 64を1x TBSで希釈し、湿度チャンバーで15分間インキュベートします。
- 空間プロファイリングプラットフォームでスキャンパラメータを設定する際、可視化パネルで使用する蛍光色素に応じてフィルターとフォーカシングチャンネルを選択し、3-plex統合を可能にします。ディスカバ リーFAM にFITCを使用して露出を200ミリ秒に設定し、 ディスカバリーローダミン6G にCy3を使用して露出を200ミリ秒に設定し、 SYTO 64 にテキサスレッドを使用して露出を50ミリ秒に設定し(これをフォーカスチャネルとして指定)、最後にディス カバリーCy5にCy5を使用して露出を200ミリ秒に設定します。 変更を保存します。
注:空間プロファイリングプロテオミクスプロトコルの詳細な手順は、公式Webサイトの[サポート]タブの [ドキュメント]>[ユーザーマニュアル]の順に選択して見つけることができます。ここでは、ボンドRXを使用してnCounterのタンパク質プロトコルを探します。
2. 空間トランスクリプトミクスアッセイのROI選択
- FFPEセルペレット切片を70°Cに設定したオーブンで20〜60分間焼きます。以下の注に示されている空間プロファイリングプラットフォームのNGSプロトコルに従い、空間プロファイリングプラットフォームでスライドをスキャンし、50 μmと300 μmのサイズを選択します。空間トランスクリプトミクスアッセイでは、以下の推奨事項が強調されています。
- ライブラリを準備するときに、さまざまなサイズのROIを選択した場合は、同様のサイズのROIをプールして、サイズごとに1つのライブラリを作成します。これは、サイズによる偏りなしに、すべてのROIに対して十分なシーケンスの深さが達成されるようにするためです。
注:空間プロファイリングプラットフォームの詳細な手順は、公式Webサイトの[サポート]タブの [ドキュメント]>[ユーザーマニュアル]の順に選択します。ここでは、ボンドRXを使用したNGSアプリケーション用のRNAプロトコルを探してください。
- ライブラリを準備するときに、さまざまなサイズのROIを選択した場合は、同様のサイズのROIをプールして、サイズごとに1つのライブラリを作成します。これは、サイズによる偏りなしに、すべてのROIに対して十分なシーケンスの深さが達成されるようにするためです。
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Representative Results
ROI選択をガイドする自動視覚化プロトコル
このホワイトペーパーでは、自動化されたカスタムTSAベースのIFプロトコルを使用して組織を視覚化し、特定のROIを選択する方法を示します。メラノーマとヒト正常皮膚を対照組織として使用した可視化パネルの開発は、エピトープ安定性試験、マーカー強度の微調整、および1つのアウトコントロールによるブリードスルー評価で構成されていました。抗体のエピトープ安定性が反復溶出ステップによって影響を受けるかどうかを試験するために、FAPおよび抗体Xシグナルを、3-plexの各位置で標識した後に定性的に評価した。抗体Xシグナルはすべての位置で一貫していましたが、FAPシグナル強度は1回の溶出後に減少しました(図2)。以前の内部研究では、panCKエピトープが3プレックスアッセイ全体で安定していることが示されました。したがって、FAPは3-plexの1番目の位置に配置され、panCKは2番目の位置に配置され、抗体Xは3番目の位置に配置されました。FAPシグナルは抗体XおよびpanCKと比較して全体的に弱かったため、FAPはより明るい蛍光色素であるCy5と対になりました。
自動3プレックスは、隣接するチャネルへのブリードスルーがないことを確認するために、各マーカーを3プレックスプロトコルから1回省略した1つのアウトコントロールで最適化されました(図3)。
自動染色プラットフォームで使用される蛍光色素を空間プロファイリングプラットフォームでテストし、フィルターが3プレックス可視化パネルのTSA蛍光色素と互換性があることを確認しました。3プレックスプロトコルはFITC、Cy3、およびCy5を使用し、DAPIチャネルは空間プロファイリングプラットフォームでのUV切断に使用されるため、Texas Redチャネルの核対比染色を使用する必要がありました。2つの異なる核色素、SYTO 59およびSYTO 64が試験され、色素は結腸組織において明確な核シグナルを示した。ただし、SYTO 59は、SYTO 64を使用した場合、Cy5チャネルがクリーンであるのに対し、Cy5チャネルにブリードスルー信号も表示しました(図4)。したがって、SYTO 64は核探知のための好ましい選択でした。
SYTO 64のさらなる試験では、この色素は光安定性がなく、イメージング中にすぐに光退色することが示されました。信号が漂白されると、イメージングシステムはバックグラウンドに焦点を合わせますが、これは非特異的な信号として解釈される可能性があります(図5)。核色素の濃度を上げてシグナル強度を上げることで、この問題を最小限に抑えることができました。
直接結合抗体を使用するpanCK/CD45手動可視化プロトコルで標識した組織を、panCK/FAP/抗体X自動カスタム可視化プロトコルで標識した組織と比較しました。両方のプロトコルは共通のマーカーとしてpanCKを共有し、信号は2つのプロトコル間で同等でした(図6)。
変更された可視化プロトコルがアップストリームの空間プロテオミクスアッセイに影響を与えないようにするために、panCK/CD45手動可視化プロトコルを使用した場合、空間プロファイリングプラットフォームの収集とカウントプラットフォームの処理後に得られたカウント値を比較しました。これは、直接結合抗体またはTSAを使用する3プレックス自動カスタム視覚化プロトコルを使用します。4つの結腸直腸癌(CRC)組織を、panCK/CD45手動可視化プロトコルまたは3-plex自動カスタム視覚化プロトコルと空間プロテオミクスアッセイと組み合わせて標識しました。各プロトコルについて同様のROIを選択し、対応するROIのカウントデータをS6およびHistoneのハウスキーピング正規化を使用して比較した。log2ヒートマップ(図7A)に示すように、これらのROI間で同様の傾向が観察され、空間プロテオミクスアッセイに含まれるすべてのマーカーのスピアマンR値は0.88でした(図7B)。アッセイに使用された31個の抗体のうち、23個の抗体は0.5以上のスピアマンR値を有していた。
空間プロテオミクスとトランスクリプトミクスプロトコルは異なるため、自動可視化プロトコルが空間トランスクリプトミクスアッセイにも適用できるかどうかを評価しました。自動可視化プロトコルでは、RNA検出の前にIHCアッセイを実行する必要がありますが、元の手動プロトコルでは、可視化プロトコルを適用する前に最初にRNAを検出します。3プレックス自動可視化プロトコルは、空間トランスクリプトミクスアッセイと組み合わせてCK/CD45手動可視化プロトコルと並行してテストされました。空間プロファイリングソフトウェアで正規化された3プレックス自動可視化プロトコルQuartile 3カウント(Q3)のシーケンスデータは、CK/CD45手動可視化プロトコル(図8A)と比較して低い値を示し、これは0.15の低いスピアマンR値にも反映されています(図8B)。また、3プレックス可視化自動化プロトコルを使用した場合、ダイナミックレンジの損失が観察されました(図8C)。
自動可視化プロトコルによるこのカウントの損失は、このプロトコルがRNAの完全性を損なうこと、および可視化アッセイを実行する前にRNAを検出することがRNA品質を節約するために必要であることを示しています。この自動可視化パネルでは、RNA検出の前にタンパク質部分を実行する必要があるため、このプロトコルはRNAアッセイには適していません。
空間トランスクリプトミクスアッセイにおけるROI選択のサイズ
RNAデータ出力に対するROIサイズの影響をよりよく理解するために、異なるサイズのROIのRNA数を比較しました。空間トランスクリプトミクスアッセイは、組織に固有の違いを最小限に抑えるために、SUDHL1およびJURKAT細胞株で実施されました。直径50 μmと300 μmの円形ROIを選択し、空間プロファイリングソフトウェアのQ3正規化を使用して相互に比較しました。異なる細胞株上の選択された標的のRNA数は、正規化後の2つのROIサイズの間で同等であった(図9A、B)。
図1:デジタル空間プロファイリングのワークフロー。 (A)スライドは、抗体(空間プロテオミクスアッセイ)またはプローブ(空間トランスクリプトミクスアッセイ)、および視覚化マーカーで標識されます。(B)スライドは空間プロファイリングプラットフォームに配置され、ROIを画像化して選択します。(C)オリゴはUV光で切断され、96ウェルプレートに集められます。このプロセスは、選択したROIごとに繰り返されます。(D)サンプルが処理され、カウントプラットフォームまたはシーケンサーを使用してデータが生成されます。この図は、ナノストリングテクノロジーズのウェブサイト4,5から変更されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:エピトープの安定性。(A-C)抗体Xおよび(D−F)FAPをそれぞれヒト正常皮膚および黒色腫で試験した。(A,D)1位、(B,E)2位、および(C,F)3位の各マーカーは3-plexである。抗体Xはすべての位置で安定していますが、(D)FAPは(E-F)1回および2回の溶出後にそれぞれシグナル伝達強度の低下を示します。抗体Xは緑、FAPは赤、DAPIは灰色。スケールバーは200μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ヒト膵臓組織に関する3プレックス自動カスタム視覚化プロトコルのコントロールを1つ残します。すべての画像について、抗体Xは緑色、panCKはシアン、FAPは赤色で示されています。最初の行は、FITCの(A)抗体X、Cy3の(C)panCK、およびCy5の(D)FAPの(A)3プレックスとシングルチャネルを示しています。2行目は、(E)抗体Xおよび(F-H)各マーカーの単一チャネルについての1つのアウトコントロール3-plexを示す。3行目は、(I)panCKおよび(J-L)各マーカーの単一チャネルの1つのアウト制御3プレックスを示しています。4行目は、(M)FAPの1アウト制御3プレックスと(N-P)各マーカーのシングルチャネルを示しています。(F)FAPなし、(K)panCKなし、および(P)抗体Xなしを試験した場合、対応するチャネルのシグナル不足によって示されるように、リーブスルーは観察されませんでした。 スケールバーは500μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:SYTO染料試験。テキサスレッドチャンネルは、(A)SYTO 59のコロンの核信号を(B)Cy5チャンネル(赤)にブリードスルーして表示します。テキサスレッドチャネルは、(E)Cy5チャネルへのブリードスルーのない(D)SYTO 64の結腸内の核信号を示しています。コロンのテキサスレッドとCy5チャネルが一緒に表示され、(C)SYTO 59のブリードスルーと(F)SYTO 64のブリードスルーなしが示されました。スケールバーは50μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:SYTO 64の光安定性。 SYTO 64で標識された結腸サンプル(A)前および(B)光退色後。画像Bは、核信号損失後に視認性が高くなる非特異的信号を示しています。スケールバーは50μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:panCK標識の比較 。 (A)panCK / CD45手動視覚化プロトコルおよび(B)panCK / FAP /抗体X自動視覚化プロトコルを使用した結腸直腸癌(CRC)サンプルのpanCKシグナル。2つのプロトコル間でpanCK信号に差は見られませんでした。スケールバーは200μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:4つのCRC組織の同様のROIに関する2つの異なる視覚化プロトコルを使用した空間プロテオミクスアッセイのカウント値の比較 。 (A)ログ2 手動panCK / CD45プロトコル(黒)と自動3プレックスプロトコル(灰色)を比較した空間プロテオミクスアッセイに含まれるすべてのマーカーのヒートマップ。(B)すべてのマーカーのログ2スピアマン相関は、0.88のR値を示します。統計解析は、GraphPad Prism 7ソフトウェアまたはPythonプログラミング言語を使用して実行されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:2つの異なる可視化プロトコルを使用した空間トランスクリプトミクスアッセイのカウント値の比較 。 (A)ログ2 手動panCK / CD45プロトコル(黒)と3プレックス自動プロトコル(灰色)を比較した空間トランスクリプトミクスアッセイに含まれる選択されたターゲットのヒートマップ。(B)すべてのマーカーのログ2スピアマン相関は、0.15のR値を示します。(C) 3プレックス自動化プロトコルでダイナミック・レンジが失われる平均(青)と標準偏差。統計解析は、GraphPad Prism 7ソフトウェアまたはPythonプログラミング言語を使用して実行されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:細胞ペレットでの空間トランスクリプトミクスアッセイのRNAカウント値の比較。 直径50 μm(黒色)および300 μm(灰色)のROIについて、(A)SUDHL1および(B)JURKAT細胞株上の選択された標的について、同等の結果が観察されました。t検定を用いて有意差は観察されなかった。サイズあたり n = 3 ROI の平均と標準偏差を示します。統計解析は、GraphPad Prism 7ソフトウェアを用いて行った。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
今日まで、手動プロトコルにおける直接結合蛍光抗体は、空間プロテオミクスまたは空間トランスクリプトミクスアッセイの可視化パネルとして最も一般的に使用されている9、10。しかし、直接結合した蛍光抗体の使用は、マーカーの数が少ない場合には困難であり、適切な抗体の選択が制限されます。このプロトコルは、可視化マーカーの標識が、空間プロテオミクスアッセイをサポートするTSA技術を使用して自動染色プラットフォーム上で自動化できることを示しています。これにより、視覚化パネルのカスタマイズの柔軟性が高まり、よりターゲットを絞ったROIの選択と、組織の特定の領域からの関連する生物学的データの取得が可能になります。TSA技術はまた、低存在量マーカーの可視化を可能にし、それによって潜在的な適切な抗体の数を増加させる。さらに、可視化プロトコルの自動化により、ラベリング手順の再現性と品質が保証されます。
3-plex IFアッセイを開発するには、適切なコントロール組織上のマーカー/蛍光色素シグナル強度を慎重に評価する必要があります。抗体濃度を滴定して、隣接するチャネルへのブリードスルーを最小限に抑えるのに役立つ最高のS/N比を得ることをお勧めします。さらに、目的の各マーカーのエピトープ安定性をテストして、エピトープが繰り返しの溶出ステップの影響を受けないことを確認する必要があります。パネル内の抗体の順序が確認されたら、1つのアウトコントロールを使用してアッセイを微調整する必要があります。ここでは、パネル内の特定のマーカーが省略され、取得された画像内の対応するチャネルがブリードスルーおよびクロストークについてレビューされる。
ここでは、TSAベースのアッセイを空間プロファイリングプラットフォーム上でイメージングできること、および核染色にはDAPIの代替手段を使用する必要があることが示されました。SYTO色素をテストし、使用するSYTO色素を決定する際には、隣接するチャンネルへのブリードスルーを避けるために信号を注意深く評価する必要があると判断しました。SYTO色素の使用の別の制限は、SYTO 64やSYTO 83(内部データ)など、一部のSYTO色素が光退色を速くし、核定量に影響を与える可能性があることです。したがって、染色されたスライドの光への露出はできるだけ避ける必要があります。他のグループは、より光安定性(内部データ)であり、目的のマーカーが選択した核色素に適合する蛍光色素に割り当てられていれば、パネルで使用できるSYTO 1311,12の使用を示しています。
自動化されたTSAベースの蛍光アッセイは、空間プロテオミクスアッセイと組み合わせて視覚化するのにうまく機能しましたが、ここでは、3プレックスの自動視覚化プロトコルと空間トランスクリプトミクスプロトコルを組み合わせると、ダイナミックレンジが失われることが判明しました。したがって、3プレックス自動可視化プロトコルはプロテオミクスアッセイにのみ適合させる必要がありますが、これは制限であり、RNAベースのアッセイには代替の可視化アプローチが必要です。同じスライドの視覚化の代わりに、関心のあるマーカーで染色されたシリアルセクションをオーバーレイして、ROIの選択を容易にすることができます13。さらに、文献は、ROI選択を導くために隣接するスライド上での in situ ハイブリダイゼーションの使用を記載している14。ただし、これらのアプローチは、組織の可用性、セクション間の変動性、および細胞間の登録によって制限される可能性があります。
また、空間トランスクリプトミクスアッセイのさまざまなROIサイズの有用性もテストしました。50 μmの小さなROIを使用することで、研究者は特定の領域のデータを取得できるため、選択した細胞または関心のある領域をより詳細に読み取ることができます。小さなROIを選択する際の制限は、存在するセルの数が、背景と区別できるカウント値を取得するのに十分な量ではない可能性があることです。1つの選択肢は、純粋な細胞集団を選択して、より豊富でない標的を捕捉することです。ただし、単一セルのROI選択は、高いS/N比15によって制限されます。さらに、1回の実験で異なるサイズのROIを収集する場合は、ライブラリ調製のROIサイズを考慮することが重要です。ROIサイズが大きく異なる場合は、ROIをサイズに応じてプールし、個別のライブラリを構築して、大きなROIが1つのライブラリで過剰に表現されないようにすることが有益な場合があります。これにより、各ROIがそのサイズに応じて十分なシーケンスカバレッジを取得することも保証されます。
空間オミクス実験を行う際に考慮すべき他の要因は、データがスライド間の変動を示す可能性があること、および特定のターゲットの発現が低いと、相関値のバックグラウンドと違いが生じる可能性があることです。実験を計画し、データを評価する際には、適切な制御と正規化アプローチを考慮する必要があります。nCounterでの空間プロテオミクスアッセイでは、ハウスキーピングターゲットまたはネガティブコントロールIgGへの正規化が、ハウスキーピングターゲットまたはネガティブコントロールIgG間の相関を評価する必要がある内部経験およびベンダーの推奨事項に従って推奨される方法です16。ただし、使用する組織に応じて、すべての研究に対して最良の正規化を定義する必要があります17,18。たとえば、文献によると、乳がんの空間オミクス研究では、ハウスキーピングターゲットへの正規化に一般的に使用されるGAPDHは、S6およびヒストン19よりも一致していません。したがって、S6およびヒストンは、乳癌組織における正常化のための推奨されるハウスキーピングターゲットであった19。
空間トランスクリプトミクスアッセイの場合、研究デザイン(組織の種類やROIの選択など)に応じて正規化戦略を定義する必要があります。M値の上位四分位数またはトリミング平均(TMM)正規化など、RNA-Seqで使用されるいくつかの戦略は、配列データの正規化に適用できます19,20。
空間トランスクリプトミクスアッセイは、何千ものターゲットに関する情報を提供し、特定のTMEコンパートメントが選択され、単一核RNA-seq20 またはシングルセルRNAシーケンシング21と組み合わせて分析されるトランスクリプトーム全体の探索に一般的に使用されるようになっています。ターゲットの空間分布を評価するためのROI選択をガイドする視覚化プロトコルは、空間プロテオミクスアッセイでは自動化できますが、空間トランスクリプトミクスアッセイでは自動化できないことを示しました。さらに、特定の組織領域のより詳細な調査を可能にするために、50μmという小さなROIを選択できることを紹介します。この技術の将来の応用は、腫瘍微小環境の理解を改善するでしょう。
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Disclosures
ベロニカ・イバラ・ロペス、サンギータ・ジャヤカール、イェチン・アンジェラ・ヤン、ゾラ・モドルサン、サンドラ・ロストは、ロシュ・グループのメンバーであるジェネンテックの従業員および株主です。ロシュの一部である他の企業は、この原稿で使用される試薬と機器を製造しています。Ciara Martinは、この原稿で使用される試薬と機器を製造するNanoString Technologies Inc.の正社員です。
Acknowledgments
著者らは、NGSファイルを処理したトーマス・ウーを認めています。結果の議論と原稿のレビューをしてくれたJames Ziaiと、内部原稿の改訂をしてくれたMeredith TriplelとRachel Taylorに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
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